Name: use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions
Uploaded: 2022-02-10T12:30:00
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这项研究得到了美国国家科学基金会（MCB 1818310）对英国皇家空军的资助。这项工作得到了H. Lee Moffitt癌症中心化学生物学核心设施/蛋白质晶体学部门（NIH / NCI：P30-CA076292）的部分支持。

1. 准备材料
<ol><li>制备磷酸盐缓冲盐水（PBS）：137 mM NaCl，2.5 mM KCl，10 mM NaH2PO4和2 mM KH2PO4，pH 7.41。</li>
	<li>制备NTA-Atto 647 N染料。将NTA-Atto 647 N染料从100%DMSO溶液稀释至100 nM，无吐温即可稀释到PBS中。</li>
	<li>Express Vam7-His8 – 蛋白质作为 大肠杆菌 中的融合蛋白，并使用Ni-NTA和尺寸排阻色谱法纯化8。</li>
	<li>在PBS缓冲液中?...

<ol>
	<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroScale+Thermophoresis:+Interaction+analysis+and+beyond.">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li><li>Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, n. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+proteins+without+primary+sequence+tryptophan+residues:+mutant+trp+repressors+with+aliphatic+substitutions+for+tryptophan+side+chains.">Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains.</a> Gene. 163 (1), 1-11 (1995).</li><li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity.">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis.">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100 (2010).</li><li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis.">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding.">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li><li>Starr, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+induces+conformational+changes+in+Sec18+protomers+that+prevent+SNARE+priming.">Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).</li><li>Miner, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Central+Polybasic+Region+of+the+Soluble+SNARE+(Soluble+N-Ethylmaleimide-sensitive+Factor+Attachment+Protein+Receptor)+Vam7+Affects+Binding+to+Phosphatidylinositol+3-Phosphate+by+the+PX+(Phox+Homology)+Domain.">The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+phosphoinositide+partitioning+into+plasma+membrane+models.">Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models.</a> Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).</li><li>Zhao, H., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+guide+to+biochemical+approaches+for+analyzing+protein-lipid+interactions.">A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).</li><li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+proteins:+virulence+factors+of+intracellular+disease+agents.">Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents.</a> Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).</li><li>le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents.">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).</li><li>Corradi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Diversity+in+Lipid-Protein+Interactions.">Emerging Diversity in Lipid-Protein Interactions.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 5775-5848 (2019).</li><li>Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Microscale+Thermophoresis+to+Characterize+Hits+from+High-Throughput+Screening:+A+European+Lead+Factory+Perspective.">Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective.</a> SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).</li><li>Sparks, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+competitive+inhibitor+of+phosphatidic+acid+binding+by+the+AAA++protein+NSF/Sec18+blocks+the+SNARE-priming+stage+of+vacuole+fusion.">A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).</li></ol>

Vam7-His8结合DiC8-PA的测定为给定的相互作用提供了一个强大的拟合KD，其亲和力略低于Vam7-His8对PA脂质体的测量KD（未发表）。这种差异很可能是由于缺乏膜，这通常导致对膜特异性脂质结合相互作用的亲和力较低，因此证明了脂质体膜支架对这种相互作用的作用11。
为了进一步确定MST数据的强度，研究人员需要检查<...

微尺度热泳是一种相对较新的技术，用于确定生化相关配体之间的解离常数（KD）以及抑制常数（IC50）。MST 的领先商业零售商（例如 NanoTemper）提供两种流行的 MST 技术：1） 需要荧光标签的无标签 MST，以及 2） 使用蛋白质固有的荧光进行标记热泳，具体取决于每种蛋白质中存在的芳香族残基数量1。无标记热泳的缺点是，在大多数情况下，它不允许测量蛋白质 - 蛋白质相互作用。然而，有可能设计不含芳香族氨基酸的蛋白质，如色氨酸，用于无标记的热泳2。
MST测量粒子的运动，以响应红外激光引发的微观温度场的感应，在目前可用的技术中1。MST可用于测量蛋白质 - 蛋白质相互作用，蛋白质 - 脂质相互作用，蛋白质 - 小分子，竞争实验，甚至小分子之间的相互作用，只要可以产生足够的信号分离。此外，MST允许测量嵌入脂质体或纳米盘中的基于膜蛋白的相互作用。标记热泳利用荧光标记标签的使用，允许在配体和分析物之间以化学方式控制信号分离。KD值可以使用热泳获得涉及低纳摩尔浓度的蛋白质结合的相互作用，在大多数情况下，其蛋白质浓度远低于等温量热法（ITC）3。此外，MST 没有表面等离子体共振 （SPR）4 所需的严格缓冲要求，标记的热泳甚至可用于测量来自非完全纯化的蛋白质溶液5的结合常数与遗传插入的荧光标签6。MST 的一个缺点是，像 SPR2 中那样，MST 的动力学参数无法轻易获得。
热泳测量取决于溶液的局部温差。这种热量可以从红外激光器产生。MST设备具有耦合到红外（IR）束的荧光检测器，并且可以从红外激光瞄准点处荧光分子的局部浓度变化中拾取荧光的变化。MST设备利用红外靶向激光直接耦合到荧光检测器，该荧光检测器聚焦在溶液中产生热量的同一点。这允许可靠地检测与红外激光产生的热点处分子消耗相对应的温度变化。测量的荧光通常随着温度的升高而降低到更接近红外激光器的位置。因此测量的差异可能是由于多种因素引起的，包括电荷，大小或溶剂化熵。这些差异被测量为响应于热感应或分子从毛细管的热到冷部分的运动而引起的荧光变化。
当用给定的溶液加载毛细管时，重要的是将空气留在毛细管的两端，而不是将毛细管完全装满。商用毛细管可容纳约10μL溶液。只要将溶液操纵到毛细管的中心，就可以使用5μL溶液实现精确测量，没有气泡（在加载毛细管之前可能脱气），并且小心地加载机架，以免从毛细管中心推挤溶液，红外激光瞄准。如果激光器未与溶液完全接触，则结果很可能是该浓度的三个不可用输出之一：1）无或低荧光检测，2）更高的荧光检测（可能具有锯齿状峰值），或3）在给定滴定的其他值内进行荧光检测，但具有锯齿状和不圆润的峰。
对于标记的热泳，荧光信号最好高于200和低于2000个荧光单位7。MST器件使用从0到100的LED强度范围，可以选择该范围来实现高于200或低于2000的信号。或者，可以使用不同浓度的标记配体将荧光信号修改为最佳水平。在分析数据时，使用给定的 MST 测量值作为参考运行电容扫描非常重要，因为较差的电容扫描通常会导致稍后可能被确定为异常值的点。如果使用电容扫描测量单个MST功率，则每次运行应花费大约30分钟。商用设备允许更改 MST 电源。在较旧的软件版本中，这可以设置为0到100;在更高版本中，可以选择低，中或高MST。为了实现可靠的跟踪，研究人员可能需要尝试其中的每一个，并确定哪个 MST 设置为给定交互组件生成最可靠的数据。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>For protein labeleing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prsim</td>
			<td>Graphpad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-K022</td>
			<td>Capillaries for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 machine</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td></td>
			<td>University equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-Atto 647 N</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2175</td>
			<td>label for His tags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3008</td>
			<td>Lipid for binding experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions

确定脂质与蛋白质的结合亲和力的能力是了解膜运输，信号转导和细胞骨架重塑中蛋白质 - 脂质相互作用的重要组成部分。测量此类相互作用的经典工具包括表面等离子体共振（SPR）和等温滴定量热法（ITC）。虽然这些工具功能强大，但也有挫折。ITC需要大量的纯化蛋白质和脂质，这可能既昂贵又难以生产。此外，ITC和SPR非常耗时，这可能会大大增加进行这些实验的成本。绕过这些限制的一种方法是使用相对较新的微尺度热泳（MST）技术。MST使用少量样品获得给定结合事件的饱和曲线，快速且经济高效。目前有两种类型的 MST 系统可用。一种类型的MST需要用蓝色或红色光谱中的荧光团标记。第二种系统依赖于紫外范围内芳香族氨基酸的固有荧光。这两个系统都检测分子的运动，以响应红外激光的局部热量感应。每种方法都有其优点和缺点。无标记的MST可以使用未标记的天然蛋白质;然而，许多分析物（包括药物）在紫外线范围内发出荧光，这可能会干扰准确KD值的测定。相比之下，标记的MST允许使用荧光标记的探针连接到配体上，在可见光范围内具有可测量的吸光度而不是紫外线，从而限制了来自分析物的干扰信号的可能性。

这是使用亲和力分析的示例输出。标记的MST用于确定Vam7-His8与其天然底物之一的可溶性二辛酰（DiC8）PA的结合常数9。图1显示了一次试验的热泳痕量，该试验从500μM开始对50 nM的Vam7-His8进行1：1滴定DiC8 PA。显示了初始荧光（红外激光打开前的时间）、跳跃（红外激光打开后最初的时间）和热泳（一旦粒子达到与温度的平衡）。人们可以仅从这些测量中的任何...

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Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

微尺度热泳以较低的材料成本快速获得结合常数。标记或标记的无微量级热泳是市售的;然而，无标记热泳不能使用荧光标记进行相互作用测量的多样性。我们提供用于标记热泳测量的协议。

使用微尺度热泳测量蛋白质-脂质相互作用

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

标记的微尺度热泳有效地获得各种生化相互作用的解离常数或KDs。该协议和随附的视频给出了Vam7（酵母中唯一可溶性SNARE蛋白）对磷脂酸的近似亲和力。这是Vam7在与其他蛋白质相互作用之前与两个膜结合的方式。该方法以低成本，高再现性和最小的蛋白质成本快速获得KDs，用于各种生化相互作用。该技术适用于第一阶段药物开发，允许容易获得的KDs来确定潜在的先导化合物。在开始分析之前，请打开 MST 设备背面的电源开关，然后打开控制软件。确认计算机已连接到设备并处于连接状态，并将“MST 之前”设置为 3 秒，将“MST”设置为 30 秒，将“荧光恢复”设置为 1 秒之后。对于每个毛细管，输入目标配体的名称、配体分析物的名称、目标的浓度以及使用自动填充滴定比的最高滴定浓度。选择一系列 MST 功率，并为每个功率输入值，以测试最稳健的结合拟合。为了制备标记的MST样品，将Vam7-八硫噻嗪溶液稀释至200纳摩尔浓度，将NTA-Atto 647染料稀释至100纳摩尔浓度，均在PBS中。将Vam7-八噻嗪和NTA-Atto 647染料以1：1的体积比混合，让混合物在室温下避光30分钟。在孵育结束时，离心染料和蛋白质混合物，并在使用前将溶液在4摄氏度下储存长达几个小时。然后，准备样品，取染色配体并暴露分析物。对于样品的微尺度热泳，打开设备并将毛细管架滑出。将样品毛细管装入位于第一位置浓度最高的样品架中，然后在控制软件中选择红色通道。然后，将机架加载到仪器中。然后选择一个MST功率范围，开始电容扫描MST测量并评估偏移响应。这里显示了一项试验中的热泳痕量，该试验从500微摩尔开始对50纳米摩尔NTA-Atto 647标记的Vam7结构域进行1：1滴定DiC8 PA。可以观察到初始荧光，时间跳跃和热泳，允许从这些测量的任意一个或组合中计算KD。可以从这些结果中绘制饱和曲线，例如，对于具有时间跳跃输出的热泳，如图所示。通常，MST结果使用对数尺度确定，同时考虑蛋白质浓度，通过选择KD模型并输入蛋白质浓度来确定结合亲和力。执行此方案时，请确保溶液位于毛细管的中心，并且没有气泡，并且毛细管外部没有灰尘或溶液。等温滴定量热法或表面等离子体共振可用于验证所获得的实验KD。如果存在潜在的合作绑定，则在给定资源的情况下，ITC将是执行的下一个逻辑方法。这项技术使传统的生物学研究人员能够将生物物理筛选技术纳入他们的研究中，以确定通路关系。这种技术的一个例子是细胞裂解酶，其靶蛋白内源性表达，其中GFP标签是执行传统下拉测定的新方法。

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