Name: use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions
Uploaded: 2022-02-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van de National Science Foundation (MCB 1818310) aan RAF. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Chemical Biology Core Facility / Protein Crystallography Unit in het H. Lee Moffitt Cancer Center (NIH / NCI: P30-CA076292).

1. Voorbereiding van materialen
<ol><li>Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 en 2 mM KH2PO4, pH 7,41.</li>
	<li>Bereid NTA-Atto 647 N kleurstof voor. Verdun bouillon NTA-Atto 647 N kleurstof tot 100 nM van een 100% DMSO-oplossing in PBS zonder Tween.</li>
	<li>Druk Vam7-His8 uit – Eiwit als fusie-eiwit in E. coli en zuiver met behulp van Ni-NTA en grootte-uitsluiting chromatografie8.<sup class...

<ol>
	<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroScale+Thermophoresis:+Interaction+analysis+and+beyond.">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li><li>Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, n. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+proteins+without+primary+sequence+tryptophan+residues:+mutant+trp+repressors+with+aliphatic+substitutions+for+tryptophan+side+chains.">Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains.</a> Gene. 163 (1), 1-11 (1995).</li><li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity.">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis.">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100 (2010).</li><li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis.">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding.">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li><li>Starr, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+induces+conformational+changes+in+Sec18+protomers+that+prevent+SNARE+priming.">Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).</li><li>Miner, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Central+Polybasic+Region+of+the+Soluble+SNARE+(Soluble+N-Ethylmaleimide-sensitive+Factor+Attachment+Protein+Receptor)+Vam7+Affects+Binding+to+Phosphatidylinositol+3-Phosphate+by+the+PX+(Phox+Homology)+Domain.">The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+phosphoinositide+partitioning+into+plasma+membrane+models.">Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models.</a> Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).</li><li>Zhao, H., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+guide+to+biochemical+approaches+for+analyzing+protein-lipid+interactions.">A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).</li><li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+proteins:+virulence+factors+of+intracellular+disease+agents.">Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents.</a> Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).</li><li>le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents.">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).</li><li>Corradi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Diversity+in+Lipid-Protein+Interactions.">Emerging Diversity in Lipid-Protein Interactions.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 5775-5848 (2019).</li><li>Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Microscale+Thermophoresis+to+Characterize+Hits+from+High-Throughput+Screening:+A+European+Lead+Factory+Perspective.">Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective.</a> SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).</li><li>Sparks, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+competitive+inhibitor+of+phosphatidic+acid+binding+by+the+AAA++protein+NSF/Sec18+blocks+the+SNARE-priming+stage+of+vacuole+fusion.">A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).</li></ol>

De bepaling van Vam7-His8binding aan DiC8-PA leverde een robuust gemonteerde KD op voor de gegeven interactie, die iets lagere affiniteit heeft dan de gemeten KD van Vam7-His8 voor PA-liposomen (ongepubliceerd). Dit verschil is hoogstwaarschijnlijk te wijten aan het ontbreken van een membraan, wat over het algemeen resulteert in een lagere affiniteit voor membraanspecifieke lipidebindingsinteracties en daarom de rol van de liposoommembraansteiger aan deze interact...

Thermoforese op microschaal is een relatief nieuwe techniek voor het bepalen van disassociatieconstanten (KD) en remmingsconstanten (IC50) tussen biochemisch relevante liganden. De toonaangevende commerciële retailer voor MST (bijv. NanoTemper) biedt twee populaire MST-technologieën: 1) Labelvrije MST waarvoor een fluorescerende tag nodig is, en 2) gelabelde thermoforese met behulp van de inherente fluorescentie van eiwitten, afhankelijk van het aantal aromatische residuen in elk eiwit1. Een nadeel van labelvrije thermoforese is dat het in de meeste gevallen niet mogelijk is om eiwit-eiwitinteracties te meten. Het kan echter mogelijk zijn om eiwitten te ontwikkelen zonder aromatische aminozuren zoals tryptofaan voor gebruik in labelvrije thermoforese2.
MST meet de beweging van deeltjes als reactie op de inductie van microscopische temperatuurvelden geïnitieerd door een infraroodlaser in momenteel beschikbare technologieën1. MST kan worden gebruikt om eiwit-eiwitinteracties, eiwit-lipide-interacties, eiwit-klein molecuul, concurrentie-experimenten en zelfs interacties tussen kleine moleculen te meten, zolang men voldoende signaalscheiding kan produceren. Bovendien maakt MST het mogelijk om op membraan en eiwit gebaseerde interacties te meten die zijn ingebed in liposomen of nanodiscs. Gelabelde thermoforese maakt gebruik van het gebruik van fluorescerend gelabelde tags die een chemisch controleerbare scheiding van signaal tussen ligand en analyt mogelijk maken. KD-waarden kunnen worden verkregen met behulp van thermoforese voor interacties waarbij eiwitbinding betrokken is bij lage nanomolaire concentraties, wat in de meeste gevallen een veel lagere eiwitconcentratie is dan wat nodig is voor isotherme calorimetrie (ITC)3. Bovendien heeft MST geen strikte buffervereisten zoals vereist voor oppervlakteplasmonresonantie (SPR)4 en kan gelabelde thermoforese zelfs worden gebruikt om bindingsconstanten van eiwitten van belang te meten uit niet-volledig gezuiverde eiwitoplossingen5 met genetisch ingebrachte fluorescerende tags6. Een nadeel van MST is dat kinetische parameters niet gemakkelijk kunnen worden verkregen voor MST zoals in SPR2.
Thermoforesemetingen zijn afhankelijk van het lokale temperatuurverschil van een oplossing. Deze warmte kan worden opgewekt uit een infraroodlaser. Het MST-apparaat heeft een fluorescentiedetector gekoppeld aan een infrarood (IR) -straal en kan veranderingen in fluorescentie opvangen van lokale concentratieveranderingen van de fluorescerende moleculen op het punt waar de IR-laser is gericht. Het MST-apparaat maakt gebruik van een IR-gerichte laser die rechtstreeks is gekoppeld aan een fluorescentiedetector die is gericht op hetzelfde punt waarop de warmte in de oplossing wordt gegenereerd. Dit maakt robuuste detectie mogelijk van temperatuurveranderingen die overeenkomen met de uitputting van moleculen op het punt van warmte dat door de IR-laser wordt gegenereerd. Gemeten fluorescentie neemt over het algemeen dichter bij de IR-laser af als reactie op temperatuurstijgingen. De verschillen die als gevolg hiervan worden gemeten, kunnen te wijten zijn aan meerdere factoren, waaronder lading, grootte of solvatie-entropie. Deze verschillen worden gemeten als veranderingen in fluorescentie als reactie op inductie van warmte of beweging van moleculen van warme naar koudere delen van het capillair.
Bij het laden van een capillair met een bepaalde oplossing, is het belangrijk om lucht aan beide uiteinden van het capillair te laten en het capillair niet volledig vol te laden. Het commerciële capillair bevat ongeveer 10 μL oplossing. Men kan nauwkeurige metingen uitvoeren met 5 μL oplossing zolang de oplossing wordt gemanipuleerd naar het midden van het capillair, er geen luchtbellen zijn (mogelijk ontgassen voordat het capillair wordt geladen) en men voorzichtig is met het laden van het rek om de oplossing niet te verdringen vanuit het midden van het capillair, waar de infraroodlaser is gericht. Als de laser niet volledig in contact komt met de oplossing, zal het resultaat hoogstwaarschijnlijk een van de drie onbruikbare uitgangen voor die concentratie zijn: 1) geen of lage fluorescentiedetectie, 2) hogere fluorescentiedetectie (mogelijk met gekartelde piek), of 3) fluorescentiedetectie binnen andere waarden van gegeven titratie, maar met een gekartelde en onbegeleide piek.
Voor gelabelde thermoforese is het optimaal om een fluorescentiesignaal boven 200 en onder 2000 fluorescentie-eenheden te hebben7. Het MST-apparaat maakt gebruik van een bereik van LED-intensiteiten van 0 tot 100, die kunnen worden geselecteerd om een signaal boven 200 of onder 2000 te bereiken. Als alternatief kan men verschillende concentraties van het gelabelde ligand gebruiken om het fluorescentiesignaal tot een optimaal niveau aan te passen. Het is belangrijk om een cap-scan uit te voeren met een bepaalde MST-meting als referentie bij het analyseren van gegevens, omdat een poor cap-scan vaak kan resulteren in een punt waarvan later kan worden vastgesteld dat het een uitschieter is. Elke run duurt ongeveer 30 minuten als u een enkel MST-vermogen meet met een dopscan. De commerciële apparaten maken veranderingen in MST-vermogen mogelijk. In oudere softwareversies kon dit worden ingesteld van 0 tot 100; en in latere versies kan men lage, gemiddelde of hoge MST selecteren. Om robuuste sporen te bereiken, moet een onderzoeker mogelijk elk van deze proberen en beslissen welke MST-instelling resulteert in de meest robuuste gegevens voor een bepaalde interactie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>For protein labeleing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prsim</td>
			<td>Graphpad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-K022</td>
			<td>Capillaries for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 machine</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td></td>
			<td>University equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-Atto 647 N</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2175</td>
			<td>label for His tags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3008</td>
			<td>Lipid for binding experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions

Het vermogen om de bindingsaffiniteit van lipiden aan eiwitten te bepalen, is een essentieel onderdeel van het begrijpen van eiwit-lipide-interacties bij membraanhandel, signaaltransductie en cytoskeletale remodellering. Klassieke hulpmiddelen voor het meten van dergelijke interacties zijn oppervlakteplasmonresonantie (SPR) en isotherme titratiecalorimetrie (ITC). Hoewel krachtige tools, hebben deze benaderingen tegenslagen. ITC vereist grote hoeveelheden gezuiverd eiwit en lipiden, die duur en moeilijk te produceren kunnen zijn. Bovendien zijn ITC en SPR zeer tijdrovend, wat aanzienlijk kan bijdragen aan de kosten van het uitvoeren van deze experimenten. Een manier om deze beperkingen te omzeilen is door de relatief nieuwe techniek van microschaal thermoforese (MST) te gebruiken. MST is snel en kosteneffectief met behulp van kleine hoeveelheden monster om een verzadigingscurve voor een bepaalde bindingsgebeurtenis te verkrijgen. Er zijn momenteel twee soorten MST-systemen beschikbaar. Eén type MST vereist etikettering met een fluorofoor in het blauwe of rode spectrum. Het tweede systeem is gebaseerd op de intrinsieke fluorescentie van aromatische aminozuren in het UV-bereik. Beide systemen detecteren de beweging van moleculen als reactie op gelokaliseerde inductie van warmte van een infraroodlaser. Elke aanpak heeft zijn voor- en nadelen. Labelvrije MST kan niet-gecodeerde inheemse eiwitten gebruiken; veel analyten, waaronder farmaceutische producten, fluoresceren echter in het UV-bereik, wat de bepaling van nauwkeurige KD-waarden kan verstoren. Ter vergelijking: gelabelde MST zorgt voor een grotere diversiteit aan meetbare paarsgewijze interacties met behulp van fluorescerend gelabelde sondes die zijn bevestigd aan liganden met meetbare absorpties in het zichtbare bereik in tegenstelling tot UV, waardoor het potentieel voor storende signalen van analyten wordt beperkt.

Dit is een steekproefuitvoer met behulp van de affiniteitsanalyse. De gelabelde MST werd gebruikt om de bindingsconstante van de Vam7-His8 aan de oplosbare dioctanoyl (DiC8) PA van een van zijn natuurlijke substraten9 te bepalen. Figuur 1 toont de thermoforetische sporen van één proef met een 1:1 titratie van DiC8 PA vanaf 500 μM tegen 50 nM Vam7-His8. Initiële fluorescentie (tijd voordat infraroodlaser werd ingeschakeld), Tjump (tijd in eerste instantie nadat inf...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions at JoVE.com

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Thermoforese op microschaal verkrijgt snel bindingsconstanten tegen lage materiaalkosten. Gelabelde of labelvrije thermoforese op microschaal is in de handel verkrijgbaar; labelvrije thermoforese is echter niet in staat tot de diversiteit aan interactiemetingen die kunnen worden uitgevoerd met behulp van fluorescerende labels. Wij bieden een protocol voor gelabelde thermoforesemetingen.

Gebruik van thermoforese op microschaal om eiwit-lipide-interacties te meten

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Gelabelde thermoforese op microschaal verkrijgt disassociatieconstanten, of KD's, van diverse biochemische interacties efficiënt. Dit protocol en de bijbehorende video geven de geschatte affiniteit voor Vam7, het enige oplosbare SNARE-eiwit in gist, aan fosfatidisch zuur. Dit is de manier waarop Vam7 zich associeert met twee membranen voordat het interageert met andere eiwitten.Deze methode verkrijgt snel KD's voor diverse biochemische interacties tegen lage kosten, met een hoge reproduceerbaarheid en met minimale eiwitkosten. Deze techniek is geschikt voor de eerste fase van farmaceutische ontwikkeling, waardoor gemakkelijk verkrijgbare KD's mogelijk zijn om potentiële loodverbindingen te bepalen. Voordat u met een analyse begint, schakelt u de aan/uit-schakelaar aan de achterkant van het MST-apparaat in en opent u de besturingssoftware.Controleer of de computer is aangesloten op het apparaat en de status Verbonden heeft en stel de MST Before in op 3 seconden, de MST op 30 seconden en het Fluorescence Recovery op na 1 seconde. Voer voor elke capillaire buis de naam van het doelligand, de naam van de ligandanalyt, de concentratie van het doel en de hoogste titratieconcentratie in met behulp van de autofill-titratieverhouding. Selecteer een reeks MST-vermogens en voer waarden in voor elk vermogen om te testen op de meest robuuste bindingsfitting.Om gelabelde MST-monsters te bereiden, verdunt u een Vam7-octahistidine-oplossing tot een concentratie van 200 nanomolaire waarden en een NTA-Atto 647-kleurstof tot een 100 nanomolaire concentratie, beide in PBS. Meng de Vam7-octahistidine en de NTA-Atto 647 kleurstof in een volumetrische verhouding van 1:1 en laat het mengsel gedurende 30 minuten op kamertemperatuur staan beschermd tegen licht. Centrifugeer aan het einde van de incubatie het kleurstof- en eiwitmengsel en bewaar de oplossing tot enkele uren voor gebruik bij 4 graden Celsius.Bereid vervolgens het monster voor, neem geverfd ligand en stel de analyt bloot. Voor thermoforese op microschaal van het monster opent u het apparaat en schuift u het capillaire rek naar buiten. Laad de monstercapillairen in het rek met de hoogste concentratie op positie één en selecteer het rode kanaal in de besturingssoftware.Laad vervolgens het rek in het instrument. Selecteer vervolgens een bereik van MST-vermogen en start de Cap Scan MST-meting en evalueer de schakelrespons. Thermoforetische sporen van een proef van een 1:1 titratie van DiC8 PA beginnend bij 500 micromol tegen 50 nanomol NTA-Atto 647 gelabeld Vam7 domein worden hier getoond.De initiële fluorescentie, tijdsprong en thermoforese kunnen worden waargenomen, waardoor KD kan worden berekend uit een van deze metingen of een combinatie. Uit deze resultaten kan een verzadigingscurve worden uitgezet, bijvoorbeeld voor de thermoforese met de tijdsprongoutput, zoals geïllustreerd in de grafiek. Over het algemeen worden MST-resultaten bepaald met behulp van logschaal, rekening houdend met de eiwitconcentratie om de bindingsaffiniteit te bepalen door het KD-model te selecteren en de eiwitconcentratie in te voeren.Zorg er bij het uitvoeren van dit protocol voor dat de oplossing zich in het midden van het capillair bevindt en dat er geen luchtbellen zijn en dat het capillair geen stof of oplossing aan de buitenkant van het capillair heeft. Isotherme titratiecalorimetrie of oppervlakteplasmonresonantie kan worden gebruikt om de verkregen experimentele KD te valideren. Als er potentiële coöperatieve binding is, zou ITC de volgende logische methode zijn die wordt uitgevoerd, gegeven middelen.Deze techniek heeft traditionele biologieonderzoekers in staat gesteld om biofysische screeningstechnieken op te nemen in hun onderzoek voor het bepalen van pathway-relaties. Een voorbeeld van deze techniek is cellysase met het doeleiwit dat endogeen tot expressie komt, waarbij de GFP-tag een nieuwe manier is om een traditionele pull-down assay uit te voeren.

use-of-microscale-thermophoresis-to-measure-protein-lipid-interactions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

Kwantitatieve immunofluorescentie te meten Global gelokaliseerd vertaling

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Biotinyleerd cel-penetrating Peptides te bestuderen van intracellulaire eiwit-eiwitinteractie

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Meten van interacties van bolvormige en filamenteuze eiwitten door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR) en Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

Atomaire absorptiespectroscopie om intracellulaire zink zwembaden in zoogdiercellen te meten

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an upstream 3&#39; splice site within a pre-mRNA, a process called back-splicing. This circularization is likely aided by secondary structures in the pre-mRNA that bring the splice sites into close proximity. In human genes, Alu elements are thought to promote these secondary RNA structures, as Alu elements are abundant and exhibit base complementarities with each other when present in opposite directions in the pre-mRNA. Here, we describe the generation and analysis of large, Alu element containing reporter genes that form circular RNAs. Through optimization of cloning protocols, reporter genes with up to 20 kb insert length can be generated. Their analysis in co-transfection experiments allows the identification of regulatory factors. Thus, this method can identify RNA sequences and cellular components involved in circular RNA formation.

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

We clone and analyze reporter genes generating circular RNAs. These reporter genes are larger than constructs to analyze linear splicing and contain Alu elements. To investigate the circular RNAs, the constructs are transfected into cells and resulting RNA is analyzed using RT-PCR after removal of linear RNA.

Gebruik van Alu Element met minigenen om circulaire RNA's te analyseren

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

Niet-radioactieve test om polynucleotide fosforylatie van kleine nucleotide substraten te meten

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent advancements in CD spectroscopy have enabled the study of DNA-protein interactions and conformational dynamics of DNA in different microenvironments in detail for a better understanding of transcriptional regulation in vivo. The area around a potential transcription zone needs to be unwound for transcription to occur. This is a complex process requiring the coordination of histone modifications, binding of the transcription factor to DNA, and other chromatin remodeling activities. Using CD spectroscopy, it is possible to study conformational changes in the promoter region caused by regulatory proteins, such as ATP-dependent chromatin remodelers, to promote transcription. The conformational changes occurring in the protein can also be monitored. In addition, queries regarding the affinity of the protein towards its target DNA and sequence specificity can be addressed by incorporating mutations in the target DNA. In short, the unique understanding of this sensitive and inexpensive method can predict changes in chromatin dynamics, thereby improving the understanding of transcriptional regulation.

The interaction of an ATP-dependent chromatin remodeler with a DNA ligand is described using CD spectroscopy. The induced conformational changes on a gene promoter analyzed by the peaks generated can be used to understand the mechanism of transcriptional regulation.

CD-spectroscopie om DNA-eiwitinteracties te bestuderen

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

Concanavaline A-gebaseerde sedimentatietest om substraatbinding van glucaanfosfatasen te meten

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Stabiele isotopentracering en LC-MS-analyse om DHODH- en SDH-activiteiten te meten

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

Auteur in de schijnwerpers: zuurstofonafhankelijke tests om de mitochondriale functie bij zoogdieren te meten  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

Zuurstofonafhankelijke assays om de mitochondriale functie bij zoogdieren te meten

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...