Name: use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions
Uploaded: 2022-02-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van de National Science Foundation (MCB 1818310) aan RAF. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Chemical Biology Core Facility / Protein Crystallography Unit in het H. Lee Moffitt Cancer Center (NIH / NCI: P30-CA076292).

1. Voorbereiding van materialen
<ol><li>Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 en 2 mM KH2PO4, pH 7,41.</li>
	<li>Bereid NTA-Atto 647 N kleurstof voor. Verdun bouillon NTA-Atto 647 N kleurstof tot 100 nM van een 100% DMSO-oplossing in PBS zonder Tween.</li>
	<li>Druk Vam7-His8 uit – Eiwit als fusie-eiwit in E. coli en zuiver met behulp van Ni-NTA en grootte-uitsluiting chromatografie8.<sup class...

<ol>
	<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroScale+Thermophoresis:+Interaction+analysis+and+beyond.">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li><li>Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, n. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+proteins+without+primary+sequence+tryptophan+residues:+mutant+trp+repressors+with+aliphatic+substitutions+for+tryptophan+side+chains.">Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains.</a> Gene. 163 (1), 1-11 (1995).</li><li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity.">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis.">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100 (2010).</li><li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis.">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding.">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li><li>Starr, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+induces+conformational+changes+in+Sec18+protomers+that+prevent+SNARE+priming.">Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).</li><li>Miner, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Central+Polybasic+Region+of+the+Soluble+SNARE+(Soluble+N-Ethylmaleimide-sensitive+Factor+Attachment+Protein+Receptor)+Vam7+Affects+Binding+to+Phosphatidylinositol+3-Phosphate+by+the+PX+(Phox+Homology)+Domain.">The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+phosphoinositide+partitioning+into+plasma+membrane+models.">Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models.</a> Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).</li><li>Zhao, H., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+guide+to+biochemical+approaches+for+analyzing+protein-lipid+interactions.">A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).</li><li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+proteins:+virulence+factors+of+intracellular+disease+agents.">Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents.</a> Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).</li><li>le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents.">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).</li><li>Corradi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Diversity+in+Lipid-Protein+Interactions.">Emerging Diversity in Lipid-Protein Interactions.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 5775-5848 (2019).</li><li>Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Microscale+Thermophoresis+to+Characterize+Hits+from+High-Throughput+Screening:+A+European+Lead+Factory+Perspective.">Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective.</a> SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).</li><li>Sparks, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+competitive+inhibitor+of+phosphatidic+acid+binding+by+the+AAA++protein+NSF/Sec18+blocks+the+SNARE-priming+stage+of+vacuole+fusion.">A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).</li></ol>

De bepaling van Vam7-His8binding aan DiC8-PA leverde een robuust gemonteerde KD op voor de gegeven interactie, die iets lagere affiniteit heeft dan de gemeten KD van Vam7-His8 voor PA-liposomen (ongepubliceerd). Dit verschil is hoogstwaarschijnlijk te wijten aan het ontbreken van een membraan, wat over het algemeen resulteert in een lagere affiniteit voor membraanspecifieke lipidebindingsinteracties en daarom de rol van de liposoommembraansteiger aan deze interact...

Thermoforese op microschaal is een relatief nieuwe techniek voor het bepalen van disassociatieconstanten (KD) en remmingsconstanten (IC50) tussen biochemisch relevante liganden. De toonaangevende commerciële retailer voor MST (bijv. NanoTemper) biedt twee populaire MST-technologieën: 1) Labelvrije MST waarvoor een fluorescerende tag nodig is, en 2) gelabelde thermoforese met behulp van de inherente fluorescentie van eiwitten, afhankelijk van het aantal aromatische residuen in elk eiwit1. Een nadeel van labelvrije thermoforese is dat het in de meeste gevallen niet mogelijk is om eiwit-eiwitinteracties te meten. Het kan echter mogelijk zijn om eiwitten te ontwikkelen zonder aromatische aminozuren zoals tryptofaan voor gebruik in labelvrije thermoforese2.
MST meet de beweging van deeltjes als reactie op de inductie van microscopische temperatuurvelden geïnitieerd door een infraroodlaser in momenteel beschikbare technologieën1. MST kan worden gebruikt om eiwit-eiwitinteracties, eiwit-lipide-interacties, eiwit-klein molecuul, concurrentie-experimenten en zelfs interacties tussen kleine moleculen te meten, zolang men voldoende signaalscheiding kan produceren. Bovendien maakt MST het mogelijk om op membraan en eiwit gebaseerde interacties te meten die zijn ingebed in liposomen of nanodiscs. Gelabelde thermoforese maakt gebruik van het gebruik van fluorescerend gelabelde tags die een chemisch controleerbare scheiding van signaal tussen ligand en analyt mogelijk maken. KD-waarden kunnen worden verkregen met behulp van thermoforese voor interacties waarbij eiwitbinding betrokken is bij lage nanomolaire concentraties, wat in de meeste gevallen een veel lagere eiwitconcentratie is dan wat nodig is voor isotherme calorimetrie (ITC)3. Bovendien heeft MST geen strikte buffervereisten zoals vereist voor oppervlakteplasmonresonantie (SPR)4 en kan gelabelde thermoforese zelfs worden gebruikt om bindingsconstanten van eiwitten van belang te meten uit niet-volledig gezuiverde eiwitoplossingen5 met genetisch ingebrachte fluorescerende tags6. Een nadeel van MST is dat kinetische parameters niet gemakkelijk kunnen worden verkregen voor MST zoals in SPR2.
Thermoforesemetingen zijn afhankelijk van het lokale temperatuurverschil van een oplossing. Deze warmte kan worden opgewekt uit een infraroodlaser. Het MST-apparaat heeft een fluorescentiedetector gekoppeld aan een infrarood (IR) -straal en kan veranderingen in fluorescentie opvangen van lokale concentratieveranderingen van de fluorescerende moleculen op het punt waar de IR-laser is gericht. Het MST-apparaat maakt gebruik van een IR-gerichte laser die rechtstreeks is gekoppeld aan een fluorescentiedetector die is gericht op hetzelfde punt waarop de warmte in de oplossing wordt gegenereerd. Dit maakt robuuste detectie mogelijk van temperatuurveranderingen die overeenkomen met de uitputting van moleculen op het punt van warmte dat door de IR-laser wordt gegenereerd. Gemeten fluorescentie neemt over het algemeen dichter bij de IR-laser af als reactie op temperatuurstijgingen. De verschillen die als gevolg hiervan worden gemeten, kunnen te wijten zijn aan meerdere factoren, waaronder lading, grootte of solvatie-entropie. Deze verschillen worden gemeten als veranderingen in fluorescentie als reactie op inductie van warmte of beweging van moleculen van warme naar koudere delen van het capillair.
Bij het laden van een capillair met een bepaalde oplossing, is het belangrijk om lucht aan beide uiteinden van het capillair te laten en het capillair niet volledig vol te laden. Het commerciële capillair bevat ongeveer 10 μL oplossing. Men kan nauwkeurige metingen uitvoeren met 5 μL oplossing zolang de oplossing wordt gemanipuleerd naar het midden van het capillair, er geen luchtbellen zijn (mogelijk ontgassen voordat het capillair wordt geladen) en men voorzichtig is met het laden van het rek om de oplossing niet te verdringen vanuit het midden van het capillair, waar de infraroodlaser is gericht. Als de laser niet volledig in contact komt met de oplossing, zal het resultaat hoogstwaarschijnlijk een van de drie onbruikbare uitgangen voor die concentratie zijn: 1) geen of lage fluorescentiedetectie, 2) hogere fluorescentiedetectie (mogelijk met gekartelde piek), of 3) fluorescentiedetectie binnen andere waarden van gegeven titratie, maar met een gekartelde en onbegeleide piek.
Voor gelabelde thermoforese is het optimaal om een fluorescentiesignaal boven 200 en onder 2000 fluorescentie-eenheden te hebben7. Het MST-apparaat maakt gebruik van een bereik van LED-intensiteiten van 0 tot 100, die kunnen worden geselecteerd om een signaal boven 200 of onder 2000 te bereiken. Als alternatief kan men verschillende concentraties van het gelabelde ligand gebruiken om het fluorescentiesignaal tot een optimaal niveau aan te passen. Het is belangrijk om een cap-scan uit te voeren met een bepaalde MST-meting als referentie bij het analyseren van gegevens, omdat een poor cap-scan vaak kan resulteren in een punt waarvan later kan worden vastgesteld dat het een uitschieter is. Elke run duurt ongeveer 30 minuten als u een enkel MST-vermogen meet met een dopscan. De commerciële apparaten maken veranderingen in MST-vermogen mogelijk. In oudere softwareversies kon dit worden ingesteld van 0 tot 100; en in latere versies kan men lage, gemiddelde of hoge MST selecteren. Om robuuste sporen te bereiken, moet een onderzoeker mogelijk elk van deze proberen en beslissen welke MST-instelling resulteert in de meest robuuste gegevens voor een bepaalde interactie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>For protein labeleing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prsim</td>
			<td>Graphpad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-K022</td>
			<td>Capillaries for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 machine</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td></td>
			<td>University equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-Atto 647 N</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2175</td>
			<td>label for His tags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3008</td>
			<td>Lipid for binding experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions

Het vermogen om de bindingsaffiniteit van lipiden aan eiwitten te bepalen, is een essentieel onderdeel van het begrijpen van eiwit-lipide-interacties bij membraanhandel, signaaltransductie en cytoskeletale remodellering. Klassieke hulpmiddelen voor het meten van dergelijke interacties zijn oppervlakteplasmonresonantie (SPR) en isotherme titratiecalorimetrie (ITC). Hoewel krachtige tools, hebben deze benaderingen tegenslagen. ITC vereist grote hoeveelheden gezuiverd eiwit en lipiden, die duur en moeilijk te produceren kunnen zijn. Bovendien zijn ITC en SPR zeer tijdrovend, wat aanzienlijk kan bijdragen aan de kosten van het uitvoeren van deze experimenten. Een manier om deze beperkingen te omzeilen is door de relatief nieuwe techniek van microschaal thermoforese (MST) te gebruiken. MST is snel en kosteneffectief met behulp van kleine hoeveelheden monster om een verzadigingscurve voor een bepaalde bindingsgebeurtenis te verkrijgen. Er zijn momenteel twee soorten MST-systemen beschikbaar. Eén type MST vereist etikettering met een fluorofoor in het blauwe of rode spectrum. Het tweede systeem is gebaseerd op de intrinsieke fluorescentie van aromatische aminozuren in het UV-bereik. Beide systemen detecteren de beweging van moleculen als reactie op gelokaliseerde inductie van warmte van een infraroodlaser. Elke aanpak heeft zijn voor- en nadelen. Labelvrije MST kan niet-gecodeerde inheemse eiwitten gebruiken; veel analyten, waaronder farmaceutische producten, fluoresceren echter in het UV-bereik, wat de bepaling van nauwkeurige KD-waarden kan verstoren. Ter vergelijking: gelabelde MST zorgt voor een grotere diversiteit aan meetbare paarsgewijze interacties met behulp van fluorescerend gelabelde sondes die zijn bevestigd aan liganden met meetbare absorpties in het zichtbare bereik in tegenstelling tot UV, waardoor het potentieel voor storende signalen van analyten wordt beperkt.

Dit is een steekproefuitvoer met behulp van de affiniteitsanalyse. De gelabelde MST werd gebruikt om de bindingsconstante van de Vam7-His8 aan de oplosbare dioctanoyl (DiC8) PA van een van zijn natuurlijke substraten9 te bepalen. Figuur 1 toont de thermoforetische sporen van één proef met een 1:1 titratie van DiC8 PA vanaf 500 μM tegen 50 nM Vam7-His8. Initiële fluorescentie (tijd voordat infraroodlaser werd ingeschakeld), Tjump (tijd in eerste instantie nadat inf...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions at JoVE.com

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Thermoforese op microschaal verkrijgt snel bindingsconstanten tegen lage materiaalkosten. Gelabelde of labelvrije thermoforese op microschaal is in de handel verkrijgbaar; labelvrije thermoforese is echter niet in staat tot de diversiteit aan interactiemetingen die kunnen worden uitgevoerd met behulp van fluorescerende labels. Wij bieden een protocol voor gelabelde thermoforesemetingen.

Gebruik van thermoforese op microschaal om eiwit-lipide-interacties te meten

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Gelabelde thermoforese op microschaal verkrijgt disassociatieconstanten, of KD's, van diverse biochemische interacties efficiënt. Dit protocol en de bijbehorende video geven de geschatte affiniteit voor Vam7, het enige oplosbare SNARE-eiwit in gist, aan fosfatidisch zuur. Dit is de manier waarop Vam7 zich associeert met twee membranen voordat het interageert met andere eiwitten.Deze methode verkrijgt snel KD's voor diverse biochemische interacties tegen lage kosten, met een hoge reproduceerbaarheid en met minimale eiwitkosten. Deze techniek is geschikt voor de eerste fase van farmaceutische ontwikkeling, waardoor gemakkelijk verkrijgbare KD's mogelijk zijn om potentiële loodverbindingen te bepalen. Voordat u met een analyse begint, schakelt u de aan/uit-schakelaar aan de achterkant van het MST-apparaat in en opent u de besturingssoftware.Controleer of de computer is aangesloten op het apparaat en de status Verbonden heeft en stel de MST Before in op 3 seconden, de MST op 30 seconden en het Fluorescence Recovery op na 1 seconde. Voer voor elke capillaire buis de naam van het doelligand, de naam van de ligandanalyt, de concentratie van het doel en de hoogste titratieconcentratie in met behulp van de autofill-titratieverhouding. Selecteer een reeks MST-vermogens en voer waarden in voor elk vermogen om te testen op de meest robuuste bindingsfitting.Om gelabelde MST-monsters te bereiden, verdunt u een Vam7-octahistidine-oplossing tot een concentratie van 200 nanomolaire waarden en een NTA-Atto 647-kleurstof tot een 100 nanomolaire concentratie, beide in PBS. Meng de Vam7-octahistidine en de NTA-Atto 647 kleurstof in een volumetrische verhouding van 1:1 en laat het mengsel gedurende 30 minuten op kamertemperatuur staan beschermd tegen licht. Centrifugeer aan het einde van de incubatie het kleurstof- en eiwitmengsel en bewaar de oplossing tot enkele uren voor gebruik bij 4 graden Celsius.Bereid vervolgens het monster voor, neem geverfd ligand en stel de analyt bloot. Voor thermoforese op microschaal van het monster opent u het apparaat en schuift u het capillaire rek naar buiten. Laad de monstercapillairen in het rek met de hoogste concentratie op positie één en selecteer het rode kanaal in de besturingssoftware.Laad vervolgens het rek in het instrument. Selecteer vervolgens een bereik van MST-vermogen en start de Cap Scan MST-meting en evalueer de schakelrespons. Thermoforetische sporen van een proef van een 1:1 titratie van DiC8 PA beginnend bij 500 micromol tegen 50 nanomol NTA-Atto 647 gelabeld Vam7 domein worden hier getoond.De initiële fluorescentie, tijdsprong en thermoforese kunnen worden waargenomen, waardoor KD kan worden berekend uit een van deze metingen of een combinatie. Uit deze resultaten kan een verzadigingscurve worden uitgezet, bijvoorbeeld voor de thermoforese met de tijdsprongoutput, zoals geïllustreerd in de grafiek. Over het algemeen worden MST-resultaten bepaald met behulp van logschaal, rekening houdend met de eiwitconcentratie om de bindingsaffiniteit te bepalen door het KD-model te selecteren en de eiwitconcentratie in te voeren.Zorg er bij het uitvoeren van dit protocol voor dat de oplossing zich in het midden van het capillair bevindt en dat er geen luchtbellen zijn en dat het capillair geen stof of oplossing aan de buitenkant van het capillair heeft. Isotherme titratiecalorimetrie of oppervlakteplasmonresonantie kan worden gebruikt om de verkregen experimentele KD te valideren. Als er potentiële coöperatieve binding is, zou ITC de volgende logische methode zijn die wordt uitgevoerd, gegeven middelen.Deze techniek heeft traditionele biologieonderzoekers in staat gesteld om biofysische screeningstechnieken op te nemen in hun onderzoek voor het bepalen van pathway-relaties. Een voorbeeld van deze techniek is cellysase met het doeleiwit dat endogeen tot expressie komt, waarbij de GFP-tag een nieuwe manier is om een traditionele pull-down assay uit te voeren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwit interacties te bestuderen

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Kwantitatieve immunofluorescentie te meten Global gelokaliseerd vertaling

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinyleerd cel-penetrating Peptides te bestuderen van intracellulaire eiwit-eiwitinteractie

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Meten van interacties van bolvormige en filamenteuze eiwitten door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR) en Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomaire absorptiespectroscopie om intracellulaire zink zwembaden in zoogdiercellen te meten

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Gebruik van Alu Element met minigenen om circulaire RNA's te analyseren

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Niet-radioactieve test om polynucleotide fosforylatie van kleine nucleotide substraten te meten

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

CD-spectroscopie om DNA-eiwitinteracties te bestuderen

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Concanavaline A-gebaseerde sedimentatietest om substraatbinding van glucaanfosfatasen te meten

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...