Name: use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions
Uploaded: 2022-02-10T12:30:00
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Cette recherche a été soutenue par une subvention de la National Science Foundation (MCB 1818310) à la RAF. Ce travail a été soutenu en partie par l’installation centrale de biologie chimique / unité de cristallographie des protéines du H. Lee Moffitt Cancer Center (NIH / NCI: P30-CA076292).

1. Préparation des matériaux
<ol><li>Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) : 137 mM naCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 et 2 mM KH2PO4, pH 7,41.</li>
	<li>Préparez le colorant NTA-Atto 647 N. Diluer le colorant NTA-Atto 647 N à 100 nM d’une solution de DMSO à 100% dans du PBS sans interpolation.</li>
	<li>Express Vam7-His8 – Protéine en tant que protéine de fusion dans E. coli et purifier à l’aide de Ni-NTA et d...

<ol>
	<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroScale+Thermophoresis:+Interaction+analysis+and+beyond.">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li><li>Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, n. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+proteins+without+primary+sequence+tryptophan+residues:+mutant+trp+repressors+with+aliphatic+substitutions+for+tryptophan+side+chains.">Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains.</a> Gene. 163 (1), 1-11 (1995).</li><li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity.">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis.">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100 (2010).</li><li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis.">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding.">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li><li>Starr, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+induces+conformational+changes+in+Sec18+protomers+that+prevent+SNARE+priming.">Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).</li><li>Miner, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Central+Polybasic+Region+of+the+Soluble+SNARE+(Soluble+N-Ethylmaleimide-sensitive+Factor+Attachment+Protein+Receptor)+Vam7+Affects+Binding+to+Phosphatidylinositol+3-Phosphate+by+the+PX+(Phox+Homology)+Domain.">The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+phosphoinositide+partitioning+into+plasma+membrane+models.">Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models.</a> Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).</li><li>Zhao, H., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+guide+to+biochemical+approaches+for+analyzing+protein-lipid+interactions.">A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).</li><li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+proteins:+virulence+factors+of+intracellular+disease+agents.">Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents.</a> Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).</li><li>le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents.">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).</li><li>Corradi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Diversity+in+Lipid-Protein+Interactions.">Emerging Diversity in Lipid-Protein Interactions.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 5775-5848 (2019).</li><li>Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Microscale+Thermophoresis+to+Characterize+Hits+from+High-Throughput+Screening:+A+European+Lead+Factory+Perspective.">Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective.</a> SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).</li><li>Sparks, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+competitive+inhibitor+of+phosphatidic+acid+binding+by+the+AAA++protein+NSF/Sec18+blocks+the+SNARE-priming+stage+of+vacuole+fusion.">A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).</li></ol>

La détermination de Vam7-His8binding à DiC8-PA a fourni un KD ajusté robuste pour l’interaction donnée, qui est légèrement inférieure à la KD mesurée de Vam7-His8 aux liposomes PA (non publié). Cette différence est très probablement due à l’absence de membrane, ce qui entraîne généralement une affinité plus faible pour les interactions de liaison lipidique spécifiques à la membrane et démontre donc le rôle de l’échafaudage membranaire d...

La thermophorèse à micro-échelle est une technique relativement nouvelle pour déterminer les constantes de dissociation (KD) ainsi que les constantes d’inhibition (IC50) entre les ligands biochimiquement pertinents. Le principal détaillant commercial de MST (par exemple, NanoTemper) propose deux technologies MST populaires : 1) MST sans étiquette nécessitant une étiquette fluorescente, et 2) thermophorèse marquée utilisant la fluorescence inhérente des protéines en fonction du nombre de résidus aromatiques présents dans chaque protéine1. Un inconvénient de la thermophorèse sans étiquette est que, dans la plupart des cas, elle ne permet pas de mesurer les interactions protéine-protéine. Cependant, il peut être possible de concevoir des protéines sans acides aminés aromatiques tels que le tryptophane pour une utilisation dans la thermophorèse sans étiquette2.
MST mesure le mouvement des particules en réponse à l’induction de champs de température microscopiques initiés par un laser infrarouge dans les technologies actuellement disponibles1. MST peut être utilisé pour mesurer les interactions protéine-protéine, les interactions protéine-lipide, la protéine-petite molécule, les expériences de compétition et même les interactions entre petites molécules tant que l’on peut produire suffisamment de séparation du signal. De plus, MST permet de mesurer les interactions membrane-protéine intégrées dans les liposomes ou les nanodisques. La thermophorèse marquée tire parti de l’utilisation d’étiquettes marquées par fluorescence permettant une séparation chimiquement contrôlable du signal entre le ligand et l’analyte. Les valeurs de KD peuvent être obtenues par thermophorèse pour les interactions impliquant la liaison aux protéines à de faibles concentrations nanomolaires, ce qui dans la plupart des cas est une concentration de protéines beaucoup plus faible que ce qui est nécessaire pour la calorimétrie isotherme (ITC)3. De plus, MST n’a pas d’exigences strictes en matière de tampon comme requis pour la résonance plasmonique de surface (SPR)4 et la thermophorèse marquée peut même être utilisée pour mesurer les constantes de liaison des protéines d’intérêt à partir de solutions protéiques non entièrement purifiées5 avec des étiquettes fluorescentes génétiquement insérées6. Un inconvénient de MST est que les paramètres cinétiques ne peuvent pas être obtenus facilement pour MST comme dans SPR2.
Les mesures de thermophorèse dépendent de la différence de température locale d’une solution. Cette chaleur peut être générée à partir d’un laser infrarouge. Le dispositif MST dispose d’un détecteur de fluorescence couplé à un faisceau infrarouge (IR) et peut détecter les changements de fluorescence à partir des changements de concentration locaux des molécules fluorescentes au point où le laser IR est ciblé. Le dispositif MST utilise un laser ciblé IR couplé directement à un détecteur de fluorescence focalisé au même point que la chaleur générée dans la solution. Cela permet une détection robuste des changements de température correspondant à l’épuisement des molécules au point de chaleur généré par le laser IR. La fluorescence mesurée diminue généralement plus près du laser IR en réponse à l’augmentation de la température. Les différences mesurées en conséquence peuvent être dues à plusieurs facteurs, notamment la charge, la taille ou l’entropie de solvatation. Ces différences sont mesurées comme des changements de fluorescence en réponse à l’induction de chaleur ou au mouvement de molécules des parties chaudes vers les parties plus froides du capillaire.
Lors du chargement d’un capillaire avec une solution donnée, il est important de laisser de l’air à chaque extrémité du capillaire et de ne pas charger complètement le capillaire. Le capillaire commercial contient environ 10 μL de solution. On peut obtenir des mesures précises avec 5 μL de solution tant que la solution est manipulée au centre du capillaire, qu’il n’y a pas de bulles d’air (potentiellement dégazées avant le chargement capillaire), et qu’on charge soigneusement le rack pour ne pas bousculer la solution du centre du capillaire, où le laser infrarouge est ciblé. Si le laser n’entre pas complètement en contact avec la solution, le résultat sera très probablement l’une des trois sorties inutilisables pour cette concentration: 1) détection de fluorescence nulle ou faible, 2) détection de fluorescence plus élevée (potentiellement avec pic déchiqueté), ou 3) détection de fluorescence dans d’autres valeurs à partir d’un titrage donné, mais avec un pic déchiqueté et non arrondi.
Pour la thermophorèse marquée, il est optimal d’avoir un signal de fluorescence supérieur à 200 et inférieur à 2000 unités de fluorescence7. L’appareil MST utilise une gamme d’intensités LED de 0 à 100, qui peuvent être sélectionnées pour obtenir un signal supérieur à 200 ou inférieur à 2000. Alternativement, on peut utiliser différentes concentrations du ligand marqué pour modifier le signal de fluorescence à un niveau optimal. Il est important d’exécuter un scan de capuchon avec une mesure MST donnée comme référence lors de l’analyse des données, car un mauvais scan de capuchon peut souvent entraîner un point qui peut être déterminé plus tard comme une valeur aberrante. Chaque exécution devrait prendre environ 30 minutes si vous mesurez une seule puissance MST avec un scan de capuchon. Les appareils commerciaux permettent des changements dans la puissance MST. Dans les anciennes versions du logiciel, cela pouvait être réglé de 0 à 100; et dans les versions ultérieures, on peut sélectionner un MST faible, moyen ou élevé. Pour obtenir des traces robustes, un chercheur peut avoir besoin d’essayer chacun d’entre eux et de décider quel paramètre MST donne les données les plus robustes pour une interaction donnée.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>For protein labeleing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prsim</td>
			<td>Graphpad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-K022</td>
			<td>Capillaries for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 machine</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td></td>
			<td>University equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-Atto 647 N</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2175</td>
			<td>label for His tags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3008</td>
			<td>Lipid for binding experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions

La capacité de déterminer l’affinité de liaison des lipides aux protéines est un élément essentiel de la compréhension des interactions protéine-lipide dans le trafic membranaire, la transduction du signal et le remodelage cytosquelettique. Les outils classiques pour mesurer de telles interactions comprennent la résonance plasmonique de surface (SPR) et la calorimétrie de titrage isotherme (ITC). Bien qu’elles soient des outils puissants, ces approches présentent des revers. L’ITC nécessite de grandes quantités de protéines purifiées ainsi que des lipides, ce qui peut être coûteux et difficile à produire. De plus, l’ITC ainsi que le SPR prennent beaucoup de temps, ce qui pourrait augmenter considérablement le coût de la réalisation de ces expériences. Une façon de contourner ces restrictions est d’utiliser la technique relativement nouvelle de la thermophorèse à micro-échelle (MST). MST est rapide et rentable en utilisant de petites quantités d’échantillon pour obtenir une courbe de saturation pour un événement de liaison donné. Il existe actuellement deux types de systèmes MST disponibles. Un type de TMS nécessite un étiquetage avec un fluorophore dans le spectre bleu ou rouge. Le second système repose sur la fluorescence intrinsèque des acides aminés aromatiques dans la gamme UV. Les deux systèmes détectent le mouvement des molécules en réponse à l’induction localisée de la chaleur d’un laser infrarouge. Chaque approche a ses avantages et ses inconvénients. MST sans étiquette peut utiliser des protéines natives non marquées; cependant, de nombreux analytes, y compris les produits pharmaceutiques, fluorescent dans la gamme UV, ce qui peut interférer avec la détermination de valeurs KD précises. En comparaison, le MST marqué permet une plus grande diversité d’interactions mesurables par paires en utilisant des sondes marquées par fluorescence attachées à des ligands avec des absorbances mesurables dans la gamme visible par opposition aux UV, limitant le potentiel d’interférence des signaux des analytes.

Il s’agit d’un exemple de sortie utilisant l’analyse d’affinité. Le MST marqué a été utilisé pour déterminer la constante de liaison du Vam7-His8 au dioctanoyle soluble (DiC8) PA de l’un de ses substrats naturels9. La figure 1 présente les traces thermophorétiques d’un essai d’un titrage 1:1 de DiC8 PA à partir de 500 μM contre 50 nM de Vam7-His8. La fluorescence initiale (temps avant l’allumage du laser infrarouge), Tjump (temps initialement...

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Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

La thermophorèse à micro-échelle permet d’obtenir rapidement des constantes de liaison à faible coût matériel. La thermophorèse micro-échelle étiquetée ou sans étiquette est disponible dans le commerce; cependant, la thermophorèse sans étiquette n’est pas capable de la diversité des mesures d’interaction qui peuvent être effectuées à l’aide d’étiquettes fluorescentes. Nous fournissons un protocole pour les mesures de thermophorèse marquées.

Utilisation de la thermophorèse à micro-échelle pour mesurer les interactions protéine-lipide

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

La thermophorèse à micro-échelle marquée permet d’obtenir efficacement des constantes de dissociation, ou KD, de diverses interactions biochimiques. Ce protocole et la vidéo accompagnée donnent l’affinité approximative de Vam7, la seule protéine SNARE soluble dans la levure, à l’acide phosphatidique. C’est ainsi que Vam7 s’associe à deux membranes avant d’interagir avec d’autres protéines.Cette méthode permet d’obtenir rapidement des KD pour diverses interactions biochimiques à faible coût, avec une reproductibilité élevée et un coût protéique minimal. Cette technique convient au développement pharmaceutique de première étape, permettant d’obtenir facilement des KD pour déterminer les composés principaux potentiels. Avant de commencer une analyse, allumez l’interrupteur d’alimentation à l’arrière du périphérique MST et ouvrez le logiciel de contrôle.Vérifiez que l’ordinateur est connecté au périphérique et à l’état connecté et définissez le MST Before sur 3 secondes, le MST sur 30 secondes et le Fluorescence Recovery sur après 1 seconde. Pour chaque tube capillaire, entrez le nom du ligand cible, le nom de l’analyte ligand, la concentration de la cible et la concentration de titrage la plus élevée à l’aide du rapport de titrage automatique. Sélectionnez une plage de puissances MST et entrez des valeurs pour chaque puissance afin de tester l’ajustement de liaison le plus robuste.Pour préparer des échantillons MST marqués, diluer une solution de Vam7-octahistidine à une concentration de 200 nanomolaires et un colorant NTA-Atto 647 à une concentration de 100 nanomolaires, tous deux dans pbS. Mélanger le Vam7-octahistidine et le colorant NTA-Atto 647 à un rapport volumétrique de 1:1 et laisser le mélange reposer à température ambiante à l’abri de la lumière pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, centrifugez le mélange de colorant et de protéines et conservez la solution à 4 degrés Celsius jusqu’à quelques heures avant utilisation.Ensuite, préparez l’échantillon, prenez le ligand teint et exposez l’analyte. Pour la thermophorèse à micro-échelle de l’échantillon, ouvrez l’appareil et faites glisser le rack capillaire. Chargez les capillaires d’échantillon dans le rack avec la concentration la plus élevée à la première position et sélectionnez le canal rouge dans le logiciel de contrôle.Ensuite, chargez le rack dans l’instrument. Sélectionnez ensuite une plage de puissance MST et démarrez la mesure MST Cap Scan et évaluez la réponse au changement de vitesse. Les traces thermophorétiques d’un essai d’un titrage 1:1 de DiC8 PA à partir de 500 micromoles contre 50 nanomolés NTA-Atto 647 marqués domaine Vam7 sont montrées ici.La fluorescence initiale, le saut dans le temps et la thermophorèse peuvent être observés, ce qui permet de calculer KD à partir de l’une ou d’une combinaison de ces mesures. Une courbe de saturation peut être tracée à partir de ces résultats, par exemple, pour la thermophorèse avec la sortie de saut dans le temps, comme illustré dans le graphique. Généralement, les résultats MST sont déterminés à l’aide d’une échelle logarithmique, en tenant compte de la concentration en protéines pour déterminer l’affinité de liaison en sélectionnant le modèle KD et en entrant la concentration en protéines.Lors de l’exécution de ce protocole, assurez-vous que la solution est au centre du capillaire et qu’il n’y a pas de bulles d’air et que le capillaire n’a pas de poussière ou de solution à l’extérieur du capillaire. La calorimétrie de titrage isotherme ou la résonance plasmonique de surface pourraient être utilisées pour valider la KD expérimentale obtenue. S’il existe une liaison coopérative potentielle, l’ITC serait la prochaine méthode logique exécutée, compte tenu des ressources.Cette technique a permis aux chercheurs en biologie traditionnelle d’intégrer des techniques de dépistage biophysique dans leurs recherches pour déterminer les relations entre les voies. Un exemple de cette technique est la lysase cellulaire avec la protéine cible exprimée de manière endogène, où la balise GFP est une nouvelle façon d’effectuer un test traditionnel de traction.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

La cartographie du site de liaison d&#39;un aptamère sur ATP utilisant MicroScale thermophorèse

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Recherche

Biochimie

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

Immunofluorescence quantitative de mesure globale localisée Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Peptides de pénétration cellulaire biotinylé pour étudier les Interactions protéine-protéine intracellulaire

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Mesurer les Interactions des protéines globulaires et filamenteuses par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) et thermophorèse a petite Echelle (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

Spectroscopie d’absorbance atomique pour mesurer les pools de zinc intracellulaire dans les cellules de mammifères

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an upstream 3&#39; splice site within a pre-mRNA, a process called back-splicing. This circularization is likely aided by secondary structures in the pre-mRNA that bring the splice sites into close proximity. In human genes, Alu elements are thought to promote these secondary RNA structures, as Alu elements are abundant and exhibit base complementarities with each other when present in opposite directions in the pre-mRNA. Here, we describe the generation and analysis of large, Alu element containing reporter genes that form circular RNAs. Through optimization of cloning protocols, reporter genes with up to 20 kb insert length can be generated. Their analysis in co-transfection experiments allows the identification of regulatory factors. Thus, this method can identify RNA sequences and cellular components involved in circular RNA formation.

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

We clone and analyze reporter genes generating circular RNAs. These reporter genes are larger than constructs to analyze linear splicing and contain Alu elements. To investigate the circular RNAs, the constructs are transfected into cells and resulting RNA is analyzed using RT-PCR after removal of linear RNA.

Utilisation d’un élément Alu contenant des minigènes pour analyser les ARN circulaires

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

Essai non radioactif pour mesurer la phosphorylation polynucléotide des petits substrats nucléotides

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent advancements in CD spectroscopy have enabled the study of DNA-protein interactions and conformational dynamics of DNA in different microenvironments in detail for a better understanding of transcriptional regulation in vivo. The area around a potential transcription zone needs to be unwound for transcription to occur. This is a complex process requiring the coordination of histone modifications, binding of the transcription factor to DNA, and other chromatin remodeling activities. Using CD spectroscopy, it is possible to study conformational changes in the promoter region caused by regulatory proteins, such as ATP-dependent chromatin remodelers, to promote transcription. The conformational changes occurring in the protein can also be monitored. In addition, queries regarding the affinity of the protein towards its target DNA and sequence specificity can be addressed by incorporating mutations in the target DNA. In short, the unique understanding of this sensitive and inexpensive method can predict changes in chromatin dynamics, thereby improving the understanding of transcriptional regulation.

The interaction of an ATP-dependent chromatin remodeler with a DNA ligand is described using CD spectroscopy. The induced conformational changes on a gene promoter analyzed by the peaks generated can be used to understand the mechanism of transcriptional regulation.

Spectroscopie CD pour étudier les interactions ADN-protéine

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

Essai de sédimentation basé sur la concanavaline A pour mesurer la liaison au substrat des phosphatases glucanes

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Traçage d’isotopes stables et analyse LC-MS pour mesurer les activités DHODH et SDH

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

Pleins feux sur l’auteur : Des tests indépendants de l’oxygène pour mesurer la fonction mitochondriale chez les mammifères  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

Tests indépendants de l’oxygène pour mesurer la fonction mitochondriale chez les mammifères

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...