Name: use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions
Uploaded: 2022-02-10T12:30:00
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Diese Forschung wurde durch ein Stipendium der National Science Foundation (MCB 1818310) an RAF unterstützt. Diese Arbeit wurde zum Teil von der Chemical Biology Core Facility/Protein Crystallography Unit am H. Lee Moffitt Cancer Center (NIH/NCI: P30-CA076292) unterstützt.

1. Vorbereitung der Materialien
<ol><li>Herstellung von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 und 2 mM KH2PO4, pH 7,41.</li>
	<li>Bereiten Sie NTA-Atto 647 N Farbstoff vor. Verdünnen Sie den NTA-Atto 647 N-Farbstoff auf 100 nM von einer 100%igen DMSO-Lösung in PBS ohne Tween.</li>
	<li>Express Vam7-His8 – Protein als Fusionsprotein in E. coli und Reinigung mittels Ni-NTA und Größenausschlusschr...

<ol>
	<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroScale+Thermophoresis:+Interaction+analysis+and+beyond.">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li><li>Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, n. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+proteins+without+primary+sequence+tryptophan+residues:+mutant+trp+repressors+with+aliphatic+substitutions+for+tryptophan+side+chains.">Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains.</a> Gene. 163 (1), 1-11 (1995).</li><li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity.">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis.">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100 (2010).</li><li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis.">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding.">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li><li>Starr, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+induces+conformational+changes+in+Sec18+protomers+that+prevent+SNARE+priming.">Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).</li><li>Miner, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Central+Polybasic+Region+of+the+Soluble+SNARE+(Soluble+N-Ethylmaleimide-sensitive+Factor+Attachment+Protein+Receptor)+Vam7+Affects+Binding+to+Phosphatidylinositol+3-Phosphate+by+the+PX+(Phox+Homology)+Domain.">The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+phosphoinositide+partitioning+into+plasma+membrane+models.">Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models.</a> Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).</li><li>Zhao, H., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+guide+to+biochemical+approaches+for+analyzing+protein-lipid+interactions.">A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).</li><li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+proteins:+virulence+factors+of+intracellular+disease+agents.">Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents.</a> Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).</li><li>le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents.">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).</li><li>Corradi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Diversity+in+Lipid-Protein+Interactions.">Emerging Diversity in Lipid-Protein Interactions.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 5775-5848 (2019).</li><li>Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Microscale+Thermophoresis+to+Characterize+Hits+from+High-Throughput+Screening:+A+European+Lead+Factory+Perspective.">Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective.</a> SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).</li><li>Sparks, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+competitive+inhibitor+of+phosphatidic+acid+binding+by+the+AAA++protein+NSF/Sec18+blocks+the+SNARE-priming+stage+of+vacuole+fusion.">A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).</li></ol>

Die Bestimmung der Vam7-His8-Bindung an DiC8-PA ergab ein robustes angepasstes KD für die gegebene Wechselwirkung, das eine etwas geringere Affinität aufweist als das gemessene KD von Vam7-His8 zu PA-Liposomen (unveröffentlicht). Dieser Unterschied ist höchstwahrscheinlich auf das Fehlen einer Membran zurückzuführen, was im Allgemeinen zu einer geringeren Affinität für membranspezifische Lipidbindungsinteraktionen führt und daher die Rolle des Liposomenme...

Die mikroskalige Thermophorese ist eine relativ neue Technik zur Bestimmung von Dissoziationskonstanten (KD) sowie Hemmungskonstanten (IC50) zwischen biochemisch relevanten Liganden. Der führende kommerzielle Einzelhändler für MST (z. B. NanoTemper) bietet zwei beliebte MST-Technologien an: 1) labelfreie MST, die einen fluoreszierenden Tag erfordert, und 2) markierte Thermophorese, die die inhärente Fluoreszenz von Proteinen in Abhängigkeit von der Anzahl der in jedem Protein vorhandenen aromatischen Rückstände verwendet1. Ein Nachteil der markierungsfreien Thermophorese besteht darin, dass sie in den meisten Fällen keine Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zulässt. Es könnte jedoch möglich sein, Proteine ohne aromatische Aminosäuren wie Tryptophan für die Verwendung in der markierungsfreien Thermophorese zu entwickeln2.
MST misst die Bewegung von Partikeln als Reaktion auf die Induktion mikroskopischer Temperaturfelder, die von einem Infrarotlaser in derzeit verfügbaren Technologien initiiert werden1. MST kann verwendet werden, um Protein-Protein-Interaktionen, Protein-Lipid-Interaktionen, Protein-Kleinmolekül-Experimente, Wettbewerbsexperimente und sogar Interaktionen zwischen kleinen Molekülen zu messen, solange man eine ausreichende Signaltrennung erzeugen kann. Darüber hinaus ermöglicht MST die Messung von Membran-Protein-basierten Interaktionen, die entweder in Liposomen oder Nanoscheiben eingebettet sind. Die markierte Thermophorese nutzt die Verwendung fluoreszierend markierter Tags, die eine chemisch kontrollierbare Trennung des Signals zwischen Ligand und Analyt ermöglichen. KD-Werte können mittels Thermophorese für Wechselwirkungen mit Proteinbindung bei niedrigen nanomolaren Konzentrationen erhalten werden, was in den meisten Fällen eine viel niedrigere Proteinkonzentration darstellt als für die isotherme Kalorimetrie (ITC)3. Darüber hinaus hat MST keine strengen Pufferanforderungen, wie sie für die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)4 erforderlich sind, und die markierte Thermophorese kann sogar verwendet werden, um Bindungskonstanten von Proteinen von Interesse aus nicht vollständig gereinigten Proteinlösungen5 mit genetisch eingefügten fluoreszierenden Tags zu messen6. Ein Nachteil von MST ist, dass kinetische Parameter für MST wie in SPR2 nicht ohne weiteres erhalten werden können.
Thermophoresemessungen hängen von der lokalen Temperaturdifferenz einer Lösung ab. Diese Wärme kann von einem Infrarotlaser erzeugt werden. Das MST-Gerät verfügt über einen Fluoreszenzdetektor, der an einen Infrarotstrahl (IR) gekoppelt ist und Änderungen der Fluoreszenz durch lokale Konzentrationsänderungen der fluoreszierenden Moleküle an dem Punkt aufnehmen kann, an dem der IR-Laser anvisiert wird. Das MST-Gerät verwendet einen IR-gezielten Laser, der direkt mit einem Fluoreszenzdetektor gekoppelt ist, der auf den gleichen Punkt fokussiert ist, an dem die Wärme in der Lösung erzeugt wird. Dies ermöglicht eine robuste Detektion von Temperaturänderungen, die der Erschöpfung von Molekülen an der vom IR-Laser erzeugten Wärmestelle entsprechen. Die gemessene Fluoreszenz nimmt im Allgemeinen näher am IR-Laser als Reaktion auf Temperaturerhöhungen ab. Die als Ergebnis gemessenen Unterschiede können auf mehrere Faktoren zurückzuführen sein, darunter Ladung, Größe oder Solvatationsentropie. Diese Unterschiede werden als Änderungen der Fluoreszenz als Reaktion auf die Induktion von Wärme oder die Bewegung von Molekülen von heißen zu kälteren Teilen der Kapillare gemessen.
Beim Laden einer Kapillare mit einer gegebenen Lösung ist es wichtig, Luft an beiden Enden der Kapillare zu belassen und die Kapillare nicht vollständig voll zu laden. Die kommerzielle Kapillare fasst etwa 10 μL Lösung. Man kann genaue Messungen mit 5 μL Lösung erreichen, solange die Lösung bis zur Mitte der Kapillare manipuliert wird, es keine Luftblasen gibt (möglicherweise vor dem Laden der Kapillare entgasen) und man vorsichtig ist, das Rack zu laden, um die Lösung nicht aus der Mitte der Kapillare zu drängen, wo der Infrarotlaser anvisiert wird. Wenn der Laser nicht vollständig mit der Lösung in Berührung kommt, wird das Ergebnis höchstwahrscheinlich einer von drei unbrauchbaren Ausgängen für diese Konzentration sein: 1) keine oder niedrige Fluoreszenzdetektion, 2) höhere Fluoreszenzdetektion (möglicherweise mit gezacktem Peak) oder 3) Fluoreszenzdetektion innerhalb anderer Werte aus gegebener Titration, jedoch mit einem gezackten und ungerundeten Peak.
Für die markierte Thermophorese ist es optimal, ein Fluoreszenzsignal über 200 und unter 2000 Fluoreszenzeinheiten zu haben7. Das MST-Gerät verwendet einen Bereich von LED-Intensitäten von 0 bis 100, die ausgewählt werden können, um ein Signal über 200 oder unter 2000 zu erreichen. Alternativ kann man verschiedene Konzentrationen des markierten Liganden verwenden, um das Fluoreszenzsignal auf ein optimales Niveau zu modifizieren. Es ist wichtig, bei der Datenanalyse einen Cap-Scan mit einer bestimmten MST-Messung als Referenz durchzuführen, da ein schlechter Cap-Scan oft zu einem Punkt führen kann, der später als Ausreißer eingestuft werden kann. Jeder Durchlauf sollte ungefähr 30 Minuten dauern, wenn eine einzelne MST-Leistung mit einem Cap-Scan gemessen wird. Die kommerziellen Geräte ermöglichen Änderungen der MST-Leistung. In älteren Softwareversionen konnte dies von 0 auf 100 eingestellt werden; und in späteren Versionen kann man niedrige, mittlere oder hohe MST wählen. Um robuste Ablaufverfolgungen zu erhalten, muss ein Forscher möglicherweise jede dieser Ablaufverfolgungen ausprobieren und entscheiden, welche MST-Einstellung zu den robustesten Daten für eine bestimmte Interaktion führt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>For protein labeleing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prsim</td>
			<td>Graphpad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-K022</td>
			<td>Capillaries for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 machine</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td></td>
			<td>University equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-Atto 647 N</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2175</td>
			<td>label for His tags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3008</td>
			<td>Lipid for binding experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions

Die Fähigkeit, die Bindungsaffinität von Lipiden an Proteine zu bestimmen, ist ein wesentlicher Bestandteil des Verständnisses von Protein-Lipid-Wechselwirkungen beim Membrantransport, der Signaltransduktion und dem Zytoskelett-Umbau. Klassische Werkzeuge zur Messung solcher Wechselwirkungen sind die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) und die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC). Obwohl diese Ansätze mächtige Werkzeuge sind, haben sie Rückschläge. ITC erfordert große Mengen an gereinigtem Protein sowie Lipiden, die teuer und schwierig herzustellen sein können. Darüber hinaus sind sowohl ITC als auch SPR sehr zeitaufwendig, was die Kosten für die Durchführung dieser Experimente erheblich erhöhen könnte. Eine Möglichkeit, diese Einschränkungen zu umgehen, besteht darin, die relativ neue Technik der Mikroskalen-Thermophorese (MST) zu verwenden. MST ist schnell und kostengünstig, wenn kleine Probenmengen verwendet werden, um eine Sättigungskurve für ein bestimmtes Bindungsereignis zu erhalten. Derzeit stehen zwei Arten von MST-Systemen zur Verfügung. Eine Art von MST erfordert die Kennzeichnung mit einem Fluorophor im blauen oder roten Spektrum. Das zweite System beruht auf der intrinsischen Fluoreszenz aromatischer Aminosäuren im UV-Bereich. Beide Systeme erkennen die Bewegung von Molekülen als Reaktion auf die lokalisierte Induktion von Wärme durch einen Infrarotlaser. Jeder Ansatz hat seine Vor- und Nachteile. Markierungsfreie MST kann native Proteine ohne Tags verwenden; Viele Analyten, einschließlich Pharmazeutika, fluoreszieren jedoch im UV-Bereich, was die Bestimmung genauer KD-Werte beeinträchtigen kann. Im Vergleich dazu ermöglicht die markierte MST eine größere Vielfalt messbarer paarweiser Wechselwirkungen unter Verwendung fluoreszierend markierter Sonden, die an Liganden mit messbaren Absorptionen im sichtbaren Bereich im Gegensatz zu UV befestigt sind, wodurch das Potenzial für Störsignale von Analyten begrenzt wird.

Dies ist eine Beispielausgabe, die die Affinitätsanalyse verwendet. Die markierte MST wurde verwendet, um die Bindungskonstante des Vam7-His8 an das lösliche Dioctanoyl (DiC8) PA eines seiner natürlichen Substrate zu bestimmen9. Abbildung 1 zeigt die thermophoretischen Spuren aus einem Versuch einer 1:1-Titration von DiC8 PA ab 500 μM gegenüber 50 nM Vam7-His8. Die anfängliche Fluoreszenz (Zeit vor dem Einschalten des Infrarotlasers), Tjump (Zeit nach dem Einsch...

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Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Die mikroskalige Thermophorese erhält schnell Bindungskonstanten bei geringen Materialkosten. Entweder gekennzeichnete oder markierungsfreie mikroskalige Thermophorese ist kommerziell erhältlich; Die markierungsfreie Thermophorese ist jedoch nicht in der Lage, die Vielfalt der Wechselwirkungsmessungen zu erreichen, die mit fluoreszierenden Markierungen durchgeführt werden können. Wir bieten ein Protokoll für markierte Thermophoresemessungen an.

Einsatz der mikroskaligen Thermophorese zur Messung von Protein-Lipid-Wechselwirkungen

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Die markierte mikroskalige Thermophorese erhält effizient Dissoziationskonstanten oder KDs verschiedener biochemischer Wechselwirkungen. Dieses Protokoll und das begleitende Video geben die ungefähre Affinität von Vam7, dem einzigen löslichen SNARE-Protein in Hefe, zu Phosphatidsäure an. Auf diese Weise assoziiert sich Vam7 mit zwei Membranen, bevor es mit anderen Proteinen interagiert.Diese Methode erhält schnell KDs für verschiedene biochemische Wechselwirkungen zu niedrigen Kosten, mit hoher Reproduzierbarkeit und mit minimalen Proteinkosten. Diese Technik eignet sich für die pharmazeutische Entwicklung der ersten Stufe, so dass leicht erhältliche KDs potenzielle Leitverbindungen bestimmen können. Bevor Sie mit einer Analyse beginnen, schalten Sie den Netzschalter auf der Rückseite des MST-Geräts ein und öffnen Sie die Steuerungssoftware.Vergewissern Sie sich, dass der Computer an das Gerät angeschlossen ist und sich im verbundenen Status befindet, und stellen Sie den MST Before auf 3 Sekunden, den MST auf 30 Sekunden und die Fluoreszenzwiederherstellung auf nach 1 Sekunde ein. Geben Sie für jedes Kapillarröhrchen den Namen des Zielliganden, den Namen des Ligandenanalyten, die Konzentration des Ziels und die höchste Titrationskonzentration unter Verwendung des Autofill-Titrationsverhältnisses ein. Wählen Sie einen Bereich von MST-Leistungen aus und geben Sie Werte für jede Leistung ein, um die robusteste Bindungsanpassung zu testen.Um markierte MST-Proben herzustellen, verdünnen Sie eine Vam7-Octahistidin-Lösung auf eine 200-Nanomol-Konzentration und einen NTA-Atto 647-Farbstoff auf eine 100-Nanomolar-Konzentration, beide in PBS. Mischen Sie das Vam7-Octashetidine und den NTA-Atto 647-Farbstoff in einem volumetrischen Verhältnis von 1:1 und lassen Sie die Mischung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt sitzen. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie das Farbstoff- und Proteingemisch und lagern Sie die Lösung vor dem Gebrauch bis zu einigen Stunden bei 4 Grad Celsius.Bereiten Sie dann die Probe vor, nehmen Sie einen gefärbten Liganden und belichten Sie den Analyten. Für die mikroskalige Thermophorese der Probe öffnen Sie das Gerät und schieben Sie das Kapillargestell heraus. Laden Sie die Probenkapillaren mit der höchsten Konzentration an Position eins in das Rack und wählen Sie den roten Kanal in der Steuerungssoftware aus.Laden Sie dann das Rack in das Instrument. Wählen Sie dann einen Bereich der MST-Leistung aus und starten Sie die Cap Scan MST-Messung und bewerten Sie die Schichtreaktion. Thermophoretische Spuren aus einem Versuch einer 1:1-Titration von DiC8 PA ab 500 Mikromol gegen 50 nanomolare NTA-Atto 647-markierte Vam7-Domäne sind hier gezeigt.Die anfängliche Fluoreszenz, der Zeitsprung und die Thermophorese können beobachtet werden, so dass KD aus einer oder einer Kombination dieser Messungen berechnet werden kann. Aus diesen Ergebnissen kann eine Sättigungskurve dargestellt werden, beispielsweise für die Thermophorese mit der Zeitsprungausgabe, wie in der Grafik dargestellt. Im Allgemeinen werden die MST-Ergebnisse unter Verwendung der Log-Skala unter Berücksichtigung der Proteinkonzentration bestimmt, um die Bindungsaffinität durch Auswahl des KD-Modells und Eingabe der Proteinkonzentration zu bestimmen.Stellen Sie bei der Durchführung dieses Protokolls sicher, dass sich die Lösung in der Mitte der Kapillare befindet und dass keine Luftblasen vorhanden sind und dass die Kapillare keinen Staub oder keine Lösung an der Außenseite der Kapillare aufweist. Isotherme Titrationkalorimetrie oder Oberflächenplasmonenresonanz könnten verwendet werden, um die erhaltene experimentelle KD zu validieren. Wenn es eine potenzielle kooperative Bindung gibt, wäre ITC die nächste logische Methode, die unter Berücksichtigung der Ressourcen durchgeführt wird.Diese Technik hat es traditionellen Biologieforschern ermöglicht, biophysikalische Screening-Techniken in ihre Forschung zur Bestimmung von Signalwegbeziehungen zu integrieren. Ein Beispiel für diese Technik ist die Zelllysase mit dem Zielprotein, das endogen exprimiert wird, wobei der GFP-Tag eine neuartige Möglichkeit ist, einen traditionellen Pulldown-Assay durchzuführen.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Kartierung der Bindungsstelle eines Aptamer auf ATP Mit Micro Thermophorese

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Forschung

Biochemie

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Biotinylierte Zelle eindringen Peptide, intrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zu studieren

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Messung der Interaktionen von Kugelsternhaufen und filamentösen Proteinen Kernresonanzspektroskopie (NMR) und Microscale Thermophorese (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

Atomische Absorbance-Spektroskopie zur Messung von intrazellulären Zink-Pools in den Mamänarchalzellen

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an upstream 3&#39; splice site within a pre-mRNA, a process called back-splicing. This circularization is likely aided by secondary structures in the pre-mRNA that bring the splice sites into close proximity. In human genes, Alu elements are thought to promote these secondary RNA structures, as Alu elements are abundant and exhibit base complementarities with each other when present in opposite directions in the pre-mRNA. Here, we describe the generation and analysis of large, Alu element containing reporter genes that form circular RNAs. Through optimization of cloning protocols, reporter genes with up to 20 kb insert length can be generated. Their analysis in co-transfection experiments allows the identification of regulatory factors. Thus, this method can identify RNA sequences and cellular components involved in circular RNA formation.

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

We clone and analyze reporter genes generating circular RNAs. These reporter genes are larger than constructs to analyze linear splicing and contain Alu elements. To investigate the circular RNAs, the constructs are transfected into cells and resulting RNA is analyzed using RT-PCR after removal of linear RNA.

Verwendung von Alu-Element enthaltenden Minigenes zur Analyse von kreisförmigen RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

Nichtradioaktiver Test zur Messung der Polynukleotid-Phosphorylierung kleiner Nukleotidsubstrate

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent advancements in CD spectroscopy have enabled the study of DNA-protein interactions and conformational dynamics of DNA in different microenvironments in detail for a better understanding of transcriptional regulation in vivo. The area around a potential transcription zone needs to be unwound for transcription to occur. This is a complex process requiring the coordination of histone modifications, binding of the transcription factor to DNA, and other chromatin remodeling activities. Using CD spectroscopy, it is possible to study conformational changes in the promoter region caused by regulatory proteins, such as ATP-dependent chromatin remodelers, to promote transcription. The conformational changes occurring in the protein can also be monitored. In addition, queries regarding the affinity of the protein towards its target DNA and sequence specificity can be addressed by incorporating mutations in the target DNA. In short, the unique understanding of this sensitive and inexpensive method can predict changes in chromatin dynamics, thereby improving the understanding of transcriptional regulation.

The interaction of an ATP-dependent chromatin remodeler with a DNA ligand is described using CD spectroscopy. The induced conformational changes on a gene promoter analyzed by the peaks generated can be used to understand the mechanism of transcriptional regulation.

CD-Spektroskopie zur Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

Concanavalin A-basierter Sedimentationsassay zur Messung der Substratbindung von Glucanphosphatasen

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Stabile Isotopenverfolgung und LC-MS-Analyse zur Messung von DHODH- und SDH-Aktivitäten

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

Autor im Rampenlicht: Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...