Name: use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions
Uploaded: 2022-02-10T12:30:00
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इस शोध को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एमसीबी 1818310) से आरएएफ को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम को एच ली मोफिट कैंसर सेंटर (एनआईएच / एनसीआई: पी 30-सीए076292) में रासायनिक जीव विज्ञान कोर सुविधा / प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी यूनिट द्वारा भाग में समर्थित किया गया था।

1. सामग्री की तैयारी
<ol><li>फॉस्फेट बफ़र्ड खारा (PBS) तैयार करें: 137 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, और 2 mM KH2PO4, pH 7.41.</li>
	<li>NTA-Atto 647 N डाई तैयार करें। तनु स्टॉक NTA-Atto 647 एन डाई करने के लिए 100 nM करने के लिए एक 100% DMSO समाधान से PBS ?...

<ol>
	<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroScale+Thermophoresis:+Interaction+analysis+and+beyond.">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li><li>Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, n. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+proteins+without+primary+sequence+tryptophan+residues:+mutant+trp+repressors+with+aliphatic+substitutions+for+tryptophan+side+chains.">Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains.</a> Gene. 163 (1), 1-11 (1995).</li><li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity.">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis.">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100 (2010).</li><li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis.">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding.">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li><li>Starr, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+induces+conformational+changes+in+Sec18+protomers+that+prevent+SNARE+priming.">Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).</li><li>Miner, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Central+Polybasic+Region+of+the+Soluble+SNARE+(Soluble+N-Ethylmaleimide-sensitive+Factor+Attachment+Protein+Receptor)+Vam7+Affects+Binding+to+Phosphatidylinositol+3-Phosphate+by+the+PX+(Phox+Homology)+Domain.">The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+phosphoinositide+partitioning+into+plasma+membrane+models.">Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models.</a> Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).</li><li>Zhao, H., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+guide+to+biochemical+approaches+for+analyzing+protein-lipid+interactions.">A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).</li><li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+proteins:+virulence+factors+of+intracellular+disease+agents.">Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents.</a> Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).</li><li>le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents.">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).</li><li>Corradi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Diversity+in+Lipid-Protein+Interactions.">Emerging Diversity in Lipid-Protein Interactions.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 5775-5848 (2019).</li><li>Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Microscale+Thermophoresis+to+Characterize+Hits+from+High-Throughput+Screening:+A+European+Lead+Factory+Perspective.">Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective.</a> SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).</li><li>Sparks, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+competitive+inhibitor+of+phosphatidic+acid+binding+by+the+AAA++protein+NSF/Sec18+blocks+the+SNARE-priming+stage+of+vacuole+fusion.">A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).</li></ol>

DiC8-PA के लिए Vam7-His8binding के निर्धारण ने दिए गए इंटरैक्शन के लिए एक मजबूत फिट केडी प्रदान किया, जो पीए लिपोसोम (अप्रकाशित) के लिए Vam7-His8 के मापा केडी की तुलना में थोड़ा कम आत्मीयता है। यह अंतर एक...

माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस जैव रासायनिक रूप से प्रासंगिक लिगेंड के बीच असंबद्धता स्थिरांक (केडी) के साथ-साथ निषेध स्थिरांक (आईसी 50) को निर्धारित करने में एक अपेक्षाकृत नई तकनीक है। एमएसटी (जैसे, नैनोटेम्पर) के लिए अग्रणी वाणिज्यिक खुदरा विक्रेता दो लोकप्रिय एमएसटी प्रौद्योगिकियां प्रदान करता है: 1) लेबल मुक्त एमएसटी को फ्लोरोसेंट टैग की आवश्यकता होती है, और 2) प्रत्येक प्रोटीन में मौजूद सुगंधित अवशेषों की संख्या पर निर्भर प्रोटीन के अंतर्निहित प्रतिदीप्ति का उपयोग करके थर्मोफोरेसिस लेबल किया जाता है1। लेबल-मुक्त थर्मोफोरेसिस का एक नुकसान यह है कि ज्यादातर मामलों में, यह प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के माप के लिए अनुमति नहीं देता है। हालांकि, लेबल मुक्त थर्मोफोरेसिस 2 में उपयोग के लिए ट्रिप्टोफैन जैसे सुगंधित अमीनो एसिड के बिना प्रोटीन इंजीनियर करना संभव हो सकता है।
एमएसटी वर्तमान में उपलब्ध प्रौद्योगिकियों में एक अवरक्त लेजर द्वारा शुरू किए गए सूक्ष्म तापमान क्षेत्रों के प्रेरण के जवाब में कणों के आंदोलन को मापता है1। एमएसटी का उपयोग प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन, प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन, प्रोटीन-छोटे अणु, प्रतियोगिता प्रयोगों और यहां तक कि छोटे अणुओं के बीच बातचीत को मापने के लिए किया जा सकता है जब तक कि कोई पर्याप्त संकेत पृथक्करण का उत्पादन कर सकता है। इसके अतिरिक्त, एमएसटी झिल्ली-प्रोटीन आधारित इंटरैक्शन के माप के लिए अनुमति देता है जो या तो लिपोसोम या नैनोडिस्क में एम्बेडेड होता है। लेबल थर्मोफोरेसिस फ्लोरोसेंटली लेबल वाले टैग के उपयोग का लाभ उठाता है जो लिगैंड और विश्लेषक के बीच सिग्नल के रासायनिक रूप से नियंत्रणीय पृथक्करण के लिए अनुमति देता है। कम नैनोमोलर सांद्रता में प्रोटीन बाइंडिंग से जुड़े इंटरैक्शन के लिए थर्मोफोरेसिस का उपयोग करके केडी मूल्यों को प्राप्त किया जा सकता है, जो ज्यादातर मामलों में समतापीय कैलोरीमेट्री (आईटीसी) 3 के लिए आवश्यक प्रोटीन की तुलना में प्रोटीन की बहुत कम एकाग्रता है। इसके अतिरिक्त, एमएसटी में सतह प्लास्मोन अनुनाद (एसपीआर) 4 के लिए आवश्यक सख्त बफरिंग आवश्यकताएं नहीं हैं और लेबल किए गए थर्मोफोरेसिस का उपयोग आनुवंशिक रूप से डाले गए फ्लोरोसेंट टैग 6 के साथ गैर-पूरी तरह से शुद्ध प्रोटीन समाधान 5 से ब्याज के प्रोटीन के बाध्यकारी स्थिरांक को मापने के लिए भी किया जा सकता है। एमएसटी का एक नुकसान यह है कि एसपीआर 2 के रूप में एमएसटी के लिए गतिज पैरामीटर आसानी से प्राप्त नहीं किए जा सकते हैं।
थर्मोफोरेसिस माप एक समाधान के स्थानीय तापमान अंतर पर निर्भर करता है। यह गर्मी एक अवरक्त लेजर से उत्पन्न की जा सकती है। एमएसटी डिवाइस में एक इन्फ्रारेड (आईआर) बीम के लिए युग्मित एक प्रतिदीप्ति डिटेक्टर होता है और उस बिंदु पर फ्लोरोसेंट अणुओं के स्थानीय एकाग्रता परिवर्तनों से प्रतिदीप्ति में परिवर्तन उठा सकता है जहां आईआर लेजर को लक्षित किया जाता है। एमएसटी डिवाइस एक आईआर लक्षित लेजर का उपयोग करता है जो सीधे एक प्रतिदीप्ति डिटेक्टर पर निर्भर करता है, जो उसी बिंदु पर केंद्रित होता है जिसमें समाधान में गर्मी उत्पन्न होती है। यह आईआर लेजर द्वारा उत्पन्न गर्मी के बिंदु पर अणुओं की कमी के अनुरूप तापमान में परिवर्तन का मजबूत पता लगाने की अनुमति देता है। मापा प्रतिदीप्ति आमतौर पर तापमान में वृद्धि के जवाब में आईआर लेजर के करीब कम हो जाता है। परिणामस्वरूप मापा गया अंतर आवेश, आकार, या सॉल्वेशन एन्ट्रॉपी सहित कई कारकों के कारण हो सकता है। इन अंतरों को केशिका के गर्म से ठंडे हिस्सों तक गर्मी के प्रेरण या अणुओं के आंदोलन के जवाब में प्रतिदीप्ति में परिवर्तन के रूप में मापा जाता है।
किसी दिए गए समाधान के साथ एक केशिका लोड करते समय, केशिका के दोनों छोर पर हवा छोड़ना और केशिका को पूरी तरह से पूर्ण रूप से लोड नहीं करना महत्वपूर्ण है। वाणिज्यिक केशिका में लगभग 10 μL समाधान होता है। कोई भी समाधान के 5 μL के साथ सटीक माप प्राप्त कर सकता है जब तक कि समाधान को केशिका के केंद्र में हेरफेर किया जाता है, तब तक कोई हवा के बुलबुले नहीं होते हैं (केशिका लोड करने से पहले संभावित रूप से डेगास), और एक सावधानीपूर्वक रैक को लोड करने के लिए केशिका के केंद्र से समाधान को धक्का नहीं देता है, जहां अवरक्त लेजर को लक्षित किया जाता है। यदि लेजर समाधान के साथ पूरी तरह से संपर्क में नहीं आता है, तो परिणाम सबसे अधिक संभावना है कि एकाग्रता के लिए तीन अनुपयोगी आउटपुट में से एक होगा: 1) कोई या कम प्रतिदीप्ति का पता लगाना, 2) उच्च प्रतिदीप्ति का पता लगाना (संभावित रूप से जकड़े हुए शिखर के साथ), या 3) दिए गए अनुमापन से अन्य मूल्यों के भीतर प्रतिदीप्ति का पता लगाना, लेकिन एक झुका हुआ और अनियंत्रित चोटी के साथ।
लेबल किए गए थर्मोफोरेसिस के लिए यह 200 से ऊपर और 2000 से नीचे प्रतिदीप्ति संकेत 7 के लिए इष्टतम है। एमएसटी डिवाइस 0 से 100 तक एलईडी तीव्रता की एक श्रृंखला का उपयोग करता है, जिसे 2000 से ऊपर या 2000 से नीचे के सिग्नल को प्राप्त करने के लिए चुना जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, कोई भी इष्टतम स्तर पर प्रतिदीप्ति संकेत को संशोधित करने के लिए लेबल किए गए लिगैंड की विभिन्न सांद्रता का उपयोग कर सकता है। डेटा का विश्लेषण करते समय संदर्भ के रूप में दिए गए एमएसटी माप के साथ एक कैप स्कैन चलाना महत्वपूर्ण है, क्योंकि एक खराब कैप स्कैन अक्सर एक बिंदु में परिणाम कर सकता है जिसे बाद में एक बाहरी होने के लिए निर्धारित किया जा सकता है। प्रत्येक रन को लगभग 30 मिनट लगना चाहिए यदि कैप स्कैन के साथ एक एकल एमएसटी शक्ति को मापना। वाणिज्यिक उपकरण MST शक्ति में परिवर्तन की अनुमति देते हैं। पुराने सॉफ़्टवेयर संस्करणों में इसे 0 से 100 तक सेट किया जा सकता है; और बाद के संस्करणों में एक कम, मध्यम, या उच्च एमएसटी का चयन कर सकते हैं। मजबूत निशान प्राप्त करने के लिए, एक शोधकर्ता को इनमें से प्रत्येक को आज़माने की आवश्यकता हो सकती है और यह तय करना पड़ सकता है कि किसी दिए गए इंटरैक्शन के लिए सबसे मजबूत डेटा में कौन सा एमएसटी सेटिंग परिणाम है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>For protein labeleing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prsim</td>
			<td>Graphpad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-K022</td>
			<td>Capillaries for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 machine</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td></td>
			<td>University equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-Atto 647 N</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2175</td>
			<td>label for His tags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3008</td>
			<td>Lipid for binding experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions

प्रोटीन के लिए लिपिड की बाध्यकारी आत्मीयता को निर्धारित करने की क्षमता झिल्ली तस्करी, सिग्नल ट्रांसडक्शन और साइटोस्केलेटल रीमॉडलिंग में प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन को समझने का एक अनिवार्य हिस्सा है। इस तरह की बातचीत को मापने के लिए क्लासिक उपकरणों में सतह प्लास्मोन अनुनाद (एसपीआर) और समतापी अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी) शामिल हैं। जबकि शक्तिशाली उपकरण, इन दृष्टिकोणों में असफलताएं हैं। आईटीसी को बड़ी मात्रा में शुद्ध प्रोटीन के साथ-साथ लिपिड की आवश्यकता होती है, जो महंगा और उत्पादन करने में मुश्किल हो सकता है। इसके अलावा, आईटीसी के साथ-साथ एसपीआर भी बहुत समय लेने वाले हैं, जो इन प्रयोगों को करने की लागत में काफी जोड़ सकते हैं। इन प्रतिबंधों को बायपास करने का एक तरीका माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस (एमएसटी) की अपेक्षाकृत नई तकनीक का उपयोग करना है। एमएसटी किसी दिए गए बाध्यकारी घटना के लिए संतृप्ति वक्र प्राप्त करने के लिए नमूने की छोटी मात्रा का उपयोग करके तेज और लागत प्रभावी है। वर्तमान में दो प्रकार के एमएसटी सिस्टम उपलब्ध हैं। एक प्रकार के एमएसटी को नीले या लाल स्पेक्ट्रम में फ्लोरोफोर के साथ लेबलिंग की आवश्यकता होती है। दूसरी प्रणाली यूवी रेंज में सुगंधित अमीनो एसिड के आंतरिक प्रतिदीप्ति पर निर्भर करती है। दोनों प्रणालियां एक अवरक्त लेजर से गर्मी के स्थानीयकृत प्रेरण के जवाब में अणुओं के आंदोलन का पता लगाती हैं। प्रत्येक दृष्टिकोण के अपने फायदे और नुकसान हैं। लेबल मुक्त एमएसटी untagged देशी प्रोटीन का उपयोग कर सकते हैं; हालांकि, फार्मास्यूटिकल्स सहित कई analytes, यूवी रेंज में fluoresce, जो सटीक केडी मूल्यों के निर्धारण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। इसकी तुलना में, लेबल किए गए एमएसटी औसत दर्जे के युग्मवार इंटरैक्शन की अधिक विविधता की अनुमति देता है, जो यूवी के विपरीत दृश्यमान सीमा में मापने योग्य अवशोषण के साथ लिगेंड से जुड़े फ्लोरोसेंटली लेबल वाली जांच का उपयोग करता है, जो एनालिस्ट से संकेतों में हस्तक्षेप करने की क्षमता को सीमित करता है।

यह आत्मीयता विश्लेषण का उपयोग करके एक नमूना आउटपुट है। लेबल किए गए एमएसटी का उपयोग Vam7-His8 के बाध्यकारी स्थिरांक को इसके प्राकृतिक सब्सट्रेट्स 9 में से एक के घुलनशील डायोक्टानोयल (DiC8) पीए के लिए नि?...

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Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस कम सामग्री लागत पर जल्दी से बाध्यकारी स्थिरांक प्राप्त करता है। या तो लेबल या लेबल मुक्त माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है; हालांकि, लेबल मुक्त थर्मोफोरेसिस इंटरैक्शन माप की विविधता में सक्षम नहीं है जिसे फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग करके किया जा सकता है। हम लेबल थर्मोफोरेसिस माप के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन को मापने के लिए माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस का उपयोग

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

लेबल माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस विभिन्न जैव रासायनिक इंटरैक्शन के असंबद्धता स्थिरांक, या केडी, कुशलतापूर्वक प्राप्त करता है। यह प्रोटोकॉल और साथ में वीडियो Vam7 के लिए अनुमानित आत्मीयता देते हैं, खमीर में एकमात्र घुलनशील SNARE प्रोटीन, फॉस्फेटिडिक एसिड के लिए। यह वह तरीका है जो Vam7 अन्य प्रोटीन के साथ बातचीत करने से पहले दो झिल्ली के साथ संबद्ध करता है।यह विधि कम लागत पर विविध जैव रासायनिक इंटरैक्शन के लिए तेजी से केडी प्राप्त करती है, उच्च पुनरुत्पादन के साथ और न्यूनतम प्रोटीन लागत के साथ। यह तकनीक पहले चरण के फार्मास्यूटिकल विकास के लिए उपयुक्त है, जिससे संभावित लीड यौगिकों को निर्धारित करने के लिए आसानी से प्राप्त करने योग्य केडी की अनुमति मिलती है। एक विश्लेषण शुरू करने से पहले, एमएसटी डिवाइस के पीछे पावर स्विच चालू करें और नियंत्रण सॉफ़्टवेयर खोलें।पुष्टि करें कि कंप्यूटर डिवाइस और कनेक्टेड स्थिति में अनुलग्न है और MST सेट करने के लिए 3 सेकंड से पहले, MST करने के लिए 30 सेकंड, और प्रतिदीप्ति पुनर्प्राप्ति 1 सेकंड के बाद करने के लिए। प्रत्येक केशिका ट्यूब के लिए, लक्ष्य लिगैंड का नाम, लिगैंड विश्लेषक का नाम, लक्ष्य की एकाग्रता, और ऑटोफिल अनुमापन अनुपात का उपयोग करके उच्चतम अनुमापन एकाग्रता दर्ज करें। एमएसटी शक्तियों की एक श्रेणी का चयन करें और सबसे मजबूत बाध्यकारी फिट के लिए परीक्षण करने के लिए प्रत्येक शक्ति के लिए मान दर्ज करें।लेबल किए गए एमएसटी नमूनों को तैयार करने के लिए, पीबीएस में दोनों को 200 नैनोमोलर एकाग्रता और एक एनटीए-एटो 647 डाई से 100 नैनोमोलर एकाग्रता के लिए एक Vam7-octahistidine समाधान पतला करें। Vam7-octahistidine और NTA-Atto 647 डाई को 1: 1 वॉल्यूमेट्रिक अनुपात में मिलाएं और मिश्रण को 30 मिनट के लिए प्रकाश से संरक्षित कमरे के तापमान पर बैठने की अनुमति दें। इनक्यूबेशन के अंत में, डाई और प्रोटीन मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज करें और उपयोग से पहले कुछ घंटों तक समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।फिर, नमूना तैयार करें, रंगे हुए लिगैंड लें और विश्लेषक को उजागर करें। नमूने के माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस के लिए, डिवाइस खोलें और केशिका रैक को स्लाइड करें। एक स्थान पर उच्चतम एकाग्रता के साथ रैक में नमूना केशिकाओं को लोड करें और नियंत्रण सॉफ़्टवेयर में लाल चैनल का चयन करें।फिर, उपकरण में रैक लोड करें। फिर एमएसटी पावर की एक श्रेणी का चयन करें और कैप स्कैन एमएसटी मापन शुरू करें और शिफ्ट प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करें। DiC8 PA के 1: 1 अनुमापन के एक परीक्षण से थर्मोफोरेटिक निशान 500 माइक्रोमोल्स पर 500 माइक्रोमोल्स पर शुरू होते हैं, जो 50 नैनोमोलर एनटीए-एटो 647 लेबल वाले Vam7 डोमेन के खिलाफ यहां दिखाए गए हैं।प्रारंभिक प्रतिदीप्ति, समय कूद, और थर्मोफोरेसिस को देखा जा सकता है, जिससे केडी को इन मापों के किसी भी एक या संयोजन से गणना करने की अनुमति मिलती है। एक संतृप्ति वक्र को इन परिणामों से प्लॉट किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, समय कूद आउटपुट के साथ थर्मोफोरेसिस के लिए, जैसा कि ग्राफ में दिखाया गया है। आम तौर पर, एमएसटी परिणाम लॉग स्केल का उपयोग करके निर्धारित किए जाते हैं, केडी मॉडल का चयन करके और प्रोटीन एकाग्रता को इनपुट करके बाध्यकारी आत्मीयता को निर्धारित करने के लिए प्रोटीन एकाग्रता को ध्यान में रखते हुए।इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते समय, सुनिश्चित करें कि समाधान केशिका के केंद्र में है और कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं और केशिका में केशिका के बाहर धूल या समाधान नहीं है। समतापी अनुमापन कैलोरीमेट्री या सतह प्लास्मोन अनुनाद का उपयोग प्राप्त प्रयोगात्मक केडी को मान्य करने के लिए किया जा सकता है। यदि संभावित सहकारी बाध्यकारी है, तो आईटीसी संसाधनों को देखते हुए अगली तार्किक विधि होगी।इस तकनीक ने पारंपरिक जीव विज्ञान शोधकर्ताओं को मार्ग संबंधों को निर्धारित करने के लिए अपने शोध में बायोफिजिकल स्क्रीनिंग तकनीकों को शामिल करने में सक्षम बनाया है। इस तकनीक का एक उदाहरण लक्ष्य प्रोटीन अंतर्जात रूप से व्यक्त के साथ सेल लाइसेज है, जहां जीएफपी टैग एक पारंपरिक पुल-डाउन परख करने का एक उपन्यास तरीका है।

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

बाध्यकारी microscale thermophoresis का उपयोग करते हुए एटीपी पर एक Aptamer की साइट मानचित्रण

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

मात्रात्मक इम्यूनोफ्लोरेसेंस वैश्विक स्थानीयकृत अनुवाद मापने के लिए

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Biotinylated सेल-मर्मज्ञ पेप्टाइड्स Intracellular प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएमआर) और अतिसूक्ष्म Thermophoresis (MST) द्वारा गोलाकार और रेशा प्रोटीन की बातचीत को मापने

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी स्तनधारी कोशिकाओं में Intracellular जस्ता पूल को मापने के लिए

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an upstream 3&#39; splice site within a pre-mRNA, a process called back-splicing. This circularization is likely aided by secondary structures in the pre-mRNA that bring the splice sites into close proximity. In human genes, Alu elements are thought to promote these secondary RNA structures, as Alu elements are abundant and exhibit base complementarities with each other when present in opposite directions in the pre-mRNA. Here, we describe the generation and analysis of large, Alu element containing reporter genes that form circular RNAs. Through optimization of cloning protocols, reporter genes with up to 20 kb insert length can be generated. Their analysis in co-transfection experiments allows the identification of regulatory factors. Thus, this method can identify RNA sequences and cellular components involved in circular RNA formation.

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

We clone and analyze reporter genes generating circular RNAs. These reporter genes are larger than constructs to analyze linear splicing and contain Alu elements. To investigate the circular RNAs, the constructs are transfected into cells and resulting RNA is analyzed using RT-PCR after removal of linear RNA.

परिपत्र आरएनए का विश्लेषण करने के लिए मिनीजीन युक्त एलु तत्व का उपयोग

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

छोटे न्यूक्लियोटाइड सब्सट्रेट्स के पॉलीन्यूक्लियोटाइड फॉस्फोरिलेशन को मापने के लिए गैर-रेड्रियक परख

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent advancements in CD spectroscopy have enabled the study of DNA-protein interactions and conformational dynamics of DNA in different microenvironments in detail for a better understanding of transcriptional regulation in vivo. The area around a potential transcription zone needs to be unwound for transcription to occur. This is a complex process requiring the coordination of histone modifications, binding of the transcription factor to DNA, and other chromatin remodeling activities. Using CD spectroscopy, it is possible to study conformational changes in the promoter region caused by regulatory proteins, such as ATP-dependent chromatin remodelers, to promote transcription. The conformational changes occurring in the protein can also be monitored. In addition, queries regarding the affinity of the protein towards its target DNA and sequence specificity can be addressed by incorporating mutations in the target DNA. In short, the unique understanding of this sensitive and inexpensive method can predict changes in chromatin dynamics, thereby improving the understanding of transcriptional regulation.

The interaction of an ATP-dependent chromatin remodeler with a DNA ligand is described using CD spectroscopy. The induced conformational changes on a gene promoter analyzed by the peaks generated can be used to understand the mechanism of transcriptional regulation.

सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

ग्लूकन फॉस्फेटेस के सब्सट्रेट बाइंडिंग को मापने के लिए कॉनकानावेलिन ए-आधारित अवसादन परख

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

DHODH और SDH गतिविधियों को मापने के लिए स्थिर आइसोटोप अनुरेखण और LC-MS विश्लेषण

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

लेखक स्पॉटलाइट: स्तनधारियों में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को मापने के लिए ऑक्सीजन-स्वतंत्र परख  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

स्तनधारियों में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को मापने के लिए ऑक्सीजन-स्वतंत्र परख

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...