Name: use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions
Uploaded: 2022-02-10T12:30:00
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이 연구는 국립 과학 재단 (MCB 1818310)의 RAF에 대한 보조금으로 지원되었습니다. 이 연구는 H. Lee Moffitt Cancer Center (NIH / NCI : P30-CA076292)의 화학 생물학 핵심 시설 / 단백질 결정학 부서에서 부분적으로 지원했습니다.

1. 재료의 제조
<ol><li>포스페이트 완충 식염수 (PBS)를 제조하였다: 137 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 및 2 mM KH2PO4, pH 7.41.</li>
	<li>NTA-Atto 647 N 염료를 제조하였다. NTA-Atto 647 N 염료를 100% DMSO 용액으로부터 100 nM로 희석하여 트윈이 없는 PBS로 희석한다.</li>
	<li>익스프레스 Vam7-His8 – 대장균 의 융합 단백질로서 Ni-NTA 및 크기 배제 크로마토그래피를 ...

<ol>
	<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroScale+Thermophoresis:+Interaction+analysis+and+beyond.">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li><li>Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, n. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+proteins+without+primary+sequence+tryptophan+residues:+mutant+trp+repressors+with+aliphatic+substitutions+for+tryptophan+side+chains.">Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains.</a> Gene. 163 (1), 1-11 (1995).</li><li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity.">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis.">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100 (2010).</li><li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis.">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding.">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li><li>Starr, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+induces+conformational+changes+in+Sec18+protomers+that+prevent+SNARE+priming.">Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).</li><li>Miner, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Central+Polybasic+Region+of+the+Soluble+SNARE+(Soluble+N-Ethylmaleimide-sensitive+Factor+Attachment+Protein+Receptor)+Vam7+Affects+Binding+to+Phosphatidylinositol+3-Phosphate+by+the+PX+(Phox+Homology)+Domain.">The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+phosphoinositide+partitioning+into+plasma+membrane+models.">Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models.</a> Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).</li><li>Zhao, H., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+guide+to+biochemical+approaches+for+analyzing+protein-lipid+interactions.">A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).</li><li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+proteins:+virulence+factors+of+intracellular+disease+agents.">Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents.</a> Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).</li><li>le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents.">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).</li><li>Corradi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Diversity+in+Lipid-Protein+Interactions.">Emerging Diversity in Lipid-Protein Interactions.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 5775-5848 (2019).</li><li>Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Microscale+Thermophoresis+to+Characterize+Hits+from+High-Throughput+Screening:+A+European+Lead+Factory+Perspective.">Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective.</a> SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).</li><li>Sparks, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+competitive+inhibitor+of+phosphatidic+acid+binding+by+the+AAA++protein+NSF/Sec18+blocks+the+SNARE-priming+stage+of+vacuole+fusion.">A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).</li></ol>

DiC8-PA에 대한 Vam7-His8결합의 결정은 주어진 상호작용에 대해 강력한 적합 KD를 제공하였고, 이는 PA 리포솜에 대한 Vam7-His8의 측정된 KD보다 약간 낮은 친화도이다(미공개). 이러한 차이는 멤브레인의 부족으로 인한 것일 가능성이 가장 높으며, 이는 일반적으로 막 특이적 지질 결합 상호작용에 대한 더 낮은 친화도를 초래하고, 따라서 이러한 상호작용에 ?...

마이크로스케일 열영동은 생화학적으로 관련된 리간드 사이의 분해 상수 (KD) 및 억제 상수 (IC50)를 결정하는 비교적 새로운 기술이다. MST (예를 들어, NanoTemper)에 대한 선도적 인 상업 소매 업체는 두 가지 인기있는 MST 기술을 제공합니다 : 1) 형광 태그를 필요로하는 라벨없는 MST 라벨 및 2) 각 단백질에 존재하는 방향족 잔기의 수에 의존하는 단백질의 고유 형광을 사용하는 표지 된 열 영동1. 라벨이 없는 열영동의 단점은 대부분의 경우 단백질-단백질 상호작용의 측정을 허용하지 않는다는 것이다. 그러나, 라벨 프리 열영동2에 사용하기 위해 트립토판과 같은 방향족 아미노산 없이 단백질을 조작하는 것이 가능할 수 있다.
MST는 현재 이용 가능한 기술에서 적외선 레이저에 의해 개시되는 미세한 온도 필드의 유도에 응답하여 입자의 이동을 측정한다1. MST는 단백질-단백질 상호작용, 단백질-지질 상호작용, 단백질-소분자, 경쟁 실험, 심지어 소분자 간의 상호작용까지 측정하는데 사용될 수 있으며, 이는 충분한 신호 분리를 생성할 수 있는 한 말이다. 추가적으로, MST는 리포솜 또는 나노디스크에 매립된 막-단백질 기반 상호작용의 측정을 허용한다. 표지된 열영동은 형광 표지된 태그의 사용을 이용하므로 리간드와 분석물 사이의 신호를 화학적으로 제어할 수 있습니다. KD 값은 낮은 나노몰 농도에서 단백질 결합을 수반하는 상호작용에 대해 열영동을 사용하여 얻을 수 있으며, 대부분의 경우 등온 열량측정법(ITC)3에 필요한 것보다 훨씬 낮은 농도의 단백질이다. 추가적으로, MST는 표면 플라즈몬 공명(SPR)4에 요구되는 엄격한 완충 요건을 갖지 않으며, 표지된 열영동은 심지어 유전적으로 삽입된 형광 태그6를 갖는 완전 정제되지 않은 단백질 용액5으로부터 관심있는 단백질의 결합 상수를 측정하는데 사용될 수 있다. MST의 단점은 SPR2에서와 같이 MST에 대해 운동 매개 변수를 쉽게 얻을 수 없다는 것입니다.
열영동 측정은 용액의 국소 온도 차이에 따라 달라집니다. 이 열은 적외선 레이저에서 생성 될 수 있습니다. MST 장치는 적외선(IR) 빔에 결합된 형광 검출기를 가지며, IR 레이저가 표적이 되는 지점에서 형광 분자의 국소 농도 변화로부터 형광의 변화를 포착할 수 있다. MST 장치는 용액에서 열이 발생되는 동일한 지점에 집속된 형광 검출기에 직접 결합된 IR 표적 레이저를 이용한다. 이를 통해 IR 레이저에 의해 생성 된 열 지점에서 분자의 고갈에 해당하는 온도 변화를 강력하게 감지 할 수 있습니다. 측정된 형광은 일반적으로 온도 증가에 반응하여 IR 레이저에 더 가깝게 감소한다. 결과로 측정 된 차이는 전하, 크기 또는 용매화 엔트로피를 포함한 여러 요인으로 인해 발생할 수 있습니다. 이러한 차이는 모세관의 뜨거운에서 더 차가운 부분까지 열의 유도 또는 분자의 이동에 대한 반응으로 형광의 변화로 측정됩니다.
주어진 용액으로 모세관을 적재 할 때, 모세관의 양쪽 끝에 공기를 남겨두고 모세관을 완전히 가득 채우지 않는 것이 중요합니다. 상업용 모세관은 약 10 μL의 용액을 보유한다. 용액이 모세관의 중심으로 조작되는 한 5 μL의 용액으로 정확한 측정을 달성 할 수 있으며, 기포 (모세관을 적재하기 전에 잠재적으로 가스 제거)가 없으며, 하나는 적외선 레이저가 목표로하는 모세관 중심에서 용액을 흔들지 않도록 랙을 조심스럽게 적재하는 것입니다. 레이저가 용액과 완전히 접촉하지 않으면, 그 결과는 그 농도에 대해 사용할 수 없는 세 가지 출력 중 하나가 될 가능성이 큽니다: 1) 형광 검출이 없거나 낮음, 2) 더 높은 형광 검출(잠재적으로 들쭉날쭉한 피크가 있음), 또는 3) 주어진 적정에서 다른 값 내에서 형광 검출, 그러나 들쭉날쭉하고 둥글지 않은 피크가 있습니다.
표지된 열영동을 위해서는 200 이상의 형광 신호와 2000 미만의 형광 단위7을 갖는 것이 최적이다. MST 장치는 0에서 100까지의 LED 강도 범위를 사용하며, 이는 200 이상 또는 2000 미만의 신호를 달성하기 위해 선택할 수 있습니다. 대안적으로, 형광 신호를 최적 수준으로 변형시키기 위해 표지된 리간드의 상이한 농도를 사용할 수 있다. 데이터를 분석할 때 주어진 MST 측정을 기준으로 캡 스캔을 실행하는 것이 중요한데, 불량한 캡 스캔은 종종 나중에 이상치로 결정될 수 있는 점을 초래할 수 있기 때문입니다. 캡 스캔으로 단일 MST 전력을 측정하는 경우 각 실행에 약 30분이 소요됩니다. 상용 장치는 MST 전력의 변경을 허용합니다. 이전 소프트웨어 버전에서는 0에서 100까지 설정할 수 있습니다. 이후 버전에서는 낮음, 중간 또는 높은 MST를 선택할 수 있습니다. 강력한 추적을 달성하기 위해 연구원은 이들 각각을 시도하고 주어진 상호 작용에 대해 가장 강력한 데이터를 생성하는 MST 설정을 결정해야 할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>For protein labeleing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prsim</td>
			<td>Graphpad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-K022</td>
			<td>Capillaries for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 machine</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td></td>
			<td>University equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-Atto 647 N</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2175</td>
			<td>label for His tags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3008</td>
			<td>Lipid for binding experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions

단백질에 대한 지질의 결합 친화도를 결정하는 능력은 막 밀매, 신호 전달 및 세포 골격 리모델링에서 단백질-지질 상호작용을 이해하는 데 필수적인 부분이다. 이러한 상호 작용을 측정하기위한 고전적인 도구에는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및 등온 적정 열량계 (ITC)가 포함됩니다. 강력한 도구이지만 이러한 접근 방식에는 어려움이 있습니다. ITC는 지질뿐만 아니라 다량의 정제 된 단백질을 필요로하며, 이는 비용이 많이 들고 생산하기가 어려울 수 있습니다. 또한 ITC와 SPR은 매우 시간이 많이 걸리므로 이러한 실험을 수행하는 데 드는 비용이 크게 추가 될 수 있습니다. 이러한 제한을 우회하는 한 가지 방법은 마이크로스케일 열영동(MST)의 비교적 새로운 기술을 사용하는 것이다. MST는 주어진 결합 이벤트에 대한 포화 곡선을 얻기 위해 소량의 샘플을 사용하여 빠르고 비용 효율적입니다. 현재 사용할 수 있는 MST 시스템에는 두 가지 유형이 있습니다. MST의 한 유형은 파란색 또는 빨간색 스펙트럼의 형광단으로 라벨링해야합니다. 두 번째 시스템은 UV 범위에서 방향족 아미노산의 고유 형광에 의존합니다. 두 시스템 모두 적외선 레이저에서 열의 국부적 인 유도에 반응하여 분자의 움직임을 감지합니다. 각 접근 방식에는 장점과 단점이 있습니다. 라벨이 없는 MST는 태그가 지정되지 않은 천연 단백질을 사용할 수 있습니다. 그러나, 의약품을 포함한 많은 분석물은, UV 범위의 형광, 이는 정확한 KD 값의 결정을 방해할 수 있다. 비교해 보면, 표지된 MST는 UV와 반대되는 가시 범위에서 측정 가능한 흡수율을 갖는 리간드에 부착된 형광 표지된 프로브를 활용하여 측정 가능한 쌍 상호작용의 더 큰 다양성을 허용하여, 분석물로부터의 신호를 방해할 가능성을 제한한다.

선호도 분석을 사용한 샘플 출력입니다. 표지된 MST는 그의 천연 기질 중 하나의 가용성 디옥타노일(DiC8) PA에 대한 Vam7-His8의 결합 상수를 결정하는데 사용되었다9. 도 1은 Vam7-His8의 50 nM에 대하여 500 μM에서 시작하는 DiC8 PA의 1:1 적정의 일 시험으로부터의 열영동 트레이스를 제시한다. 초기 형광(적외선 레이저가 켜지기 전의 시간), Tjump(적외선 레이저가 켜진...

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Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

마이크로스케일 열영동은 낮은 재료 비용으로 결합 상수를 신속하게 획득한다. 표지 또는 라벨이 없는 마이크로스케일 열영동이 상업적으로 입수가능하거나; 그러나, 라벨 없는 열영동은 형광 표지를 사용하여 수행될 수 있는 상호작용 측정의 다양성을 할 수 없다. 우리는 라벨이 붙은 열영동 측정을위한 프로토콜을 제공합니다.

단백질-지질 상호작용을 측정하기 위한 마이크로스케일 열영동 사용

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

표지된 마이크로스케일 열영동은 다양한 생화학적 상호작용의 분리 상수 또는 KD를 효율적으로 획득한다. 이 프로토콜과 동반된 비디오는 효모에서 유일하게 용해되는 SNARE 단백질인 Vam7에 대한 대략적인 친화도를 포스파티드산에 부여한다. 이것은 Vam7이 다른 단백질과 상호 작용하기 전에 두 개의 막과 관련되는 방식입니다.이 방법은 낮은 비용, 높은 재현성 및 최소한의 단백질 비용으로 다양한 생화학 적 상호 작용에 대한 KD를 신속하게 얻습니다. 이 기술은 첫 번째 단계의 제약 개발에 적합하므로 쉽게 얻을 수있는 KD가 잠재적 인 납 화합물을 결정할 수 있습니다. 분석을 시작하기 전에 MST 장치 뒷면의 전원 스위치를 켜고 제어 소프트웨어를 엽니다.컴퓨터가 장치에 연결되어 있고 연결된 상태인지 확인하고 MST 전을 3초로, MST를 30초로, 형광 복구를 1초 후로 설정합니다. 각 모세관 튜브에 대해, 표적 리간드의 이름, 리간드 분석물의 이름, 표적의 농도, 및 자동 충전 적정 비율을 사용하여 최고 적정 농도를 입력하십시오. MST 전원 범위를 선택하고 각 전력에 대한 값을 입력하여 가장 강력한 바인딩 적합성을 테스트합니다.표지된 MST 샘플을 제조하기 위해, Vam7-옥타히스티딘 용액을 PBS 중에서 200 나노몰 농도로 희석하고 NTA-Atto 647 염료를 모두 100 나노몰 농도로 희석하였다. Vam7-옥타히스티딘과 NTA-Atto 647 염료를 1:1 부피비로 혼합하고, 혼합물이 빛으로부터 보호된 실온에서 30분 동안 앉게 한다. 인큐베이션이 끝나면 염료 및 단백질 혼합물을 원심분리하고 사용 전에 최대 몇 시간 동안 섭씨 4도에서 용액을 저장합니다.그런 다음 샘플을 준비하고 염색 된 리간드를 취하여 분석물을 노출시킵니다. 샘플의 마이크로 스케일 열영동을 위해 장치를 열고 모세관 랙을 밀어 내십시오. 시료 모세혈관을 위치 하나에서 가장 높은 농도로 랙에 로드하고 제어 소프트웨어에서 빨간색 채널을 선택합니다.그런 다음 계측기에 랙을 로드하십시오. 그런 다음 MST 전력 범위를 선택하고 캡 스캔 MST 측정을 시작하고 시프트 응답을 평가하십시오. Vam7 도메인으로 표지된 50 나노몰 NTA-Atto 647에 대해 500 마이크로몰에서 시작하는 DiC8 PA의 1:1 적정의 하나의 시험으로부터의 열영동 트레이스가 여기에 제시된다.초기 형광, 시간 점프 및 열영동을 관찰할 수 있으므로 KD를 이들 측정 중 어느 하나 또는 조합으로부터 계산할 수 있습니다. 포화 곡선은 예를 들어, 그래프에 예시된 바와 같이, 시간 점프 출력을 갖는 열영동에 대해 이러한 결과로부터 플롯팅될 수 있다. 일반적으로, MST 결과는 KD 모델을 선택하고 단백질 농도를 입력함으로써 결합 친화도를 결정하기 위해 단백질 농도를 고려하여 로그 스케일을 사용하여 결정된다.이 프로토콜을 수행할 때 용액이 모세관의 중앙에 있고 기포가 없고 모세관 외부에 먼지나 용액이 없는지 확인하십시오. 등온 적정 열량계 또는 표면 플라즈몬 공명은 수득된 실험 KD를 검증하는데 사용될 수 있다. 잠재적 인 협력 결합이 있다면, ITC는 주어진 자원이 수행 된 다음 논리적 인 방법이 될 것입니다.이 기술을 통해 전통적인 생물학 연구자들은 경로 관계를 결정하기위한 연구에 생물 물리학 적 선별 기술을 통합 할 수있었습니다. 이 기술의 한 예는 내인성으로 발현된 표적 단백질을 갖는 세포 리자제이며, 여기서 GFP 태그는 전통적인 풀다운 분석을 수행하는 신규한 방법이다.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

마이크로 열 영동을 사용하여 ATP에 앱 타머의 결합 부위를 매핑

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

연구

생화학

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Biotinylated 세포 관통 펩 티 드 세포내 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an upstream 3&#39; splice site within a pre-mRNA, a process called back-splicing. This circularization is likely aided by secondary structures in the pre-mRNA that bring the splice sites into close proximity. In human genes, Alu elements are thought to promote these secondary RNA structures, as Alu elements are abundant and exhibit base complementarities with each other when present in opposite directions in the pre-mRNA. Here, we describe the generation and analysis of large, Alu element containing reporter genes that form circular RNAs. Through optimization of cloning protocols, reporter genes with up to 20 kb insert length can be generated. Their analysis in co-transfection experiments allows the identification of regulatory factors. Thus, this method can identify RNA sequences and cellular components involved in circular RNA formation.

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

We clone and analyze reporter genes generating circular RNAs. These reporter genes are larger than constructs to analyze linear splicing and contain Alu elements. To investigate the circular RNAs, the constructs are transfected into cells and resulting RNA is analyzed using RT-PCR after removal of linear RNA.

원형 RNA를 분석하기 위해 미니유전자를 포함하는 Alu 요소 사용

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent advancements in CD spectroscopy have enabled the study of DNA-protein interactions and conformational dynamics of DNA in different microenvironments in detail for a better understanding of transcriptional regulation in vivo. The area around a potential transcription zone needs to be unwound for transcription to occur. This is a complex process requiring the coordination of histone modifications, binding of the transcription factor to DNA, and other chromatin remodeling activities. Using CD spectroscopy, it is possible to study conformational changes in the promoter region caused by regulatory proteins, such as ATP-dependent chromatin remodelers, to promote transcription. The conformational changes occurring in the protein can also be monitored. In addition, queries regarding the affinity of the protein towards its target DNA and sequence specificity can be addressed by incorporating mutations in the target DNA. In short, the unique understanding of this sensitive and inexpensive method can predict changes in chromatin dynamics, thereby improving the understanding of transcriptional regulation.

The interaction of an ATP-dependent chromatin remodeler with a DNA ligand is described using CD spectroscopy. The induced conformational changes on a gene promoter analyzed by the peaks generated can be used to understand the mechanism of transcriptional regulation.

DNA 단백질 상호 작용을 연구하는 CD 분광법

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

글루칸 포스파타제의 기질 결합을 측정하기 위한 Concanavalin A 기반 침강 분석

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

DHODH 및 SDH 활성을 측정하기 위한 안정 동위원소 추적 및 LC-MS 분석

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

저자 스포트라이트: 포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 독립적 분석  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...