Name: use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions
Uploaded: 2022-02-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av et stipend fra National Science Foundation (MCB 1818310) til RAF. Dette arbeidet ble delvis støttet av Chemical Biology Core Facility/Protein Crystallography Unit ved H. Lee Moffitt Cancer Center (NIH/NCI: P30-CA076292).

1. Fremstilling av materialer
<ol><li>Forbered fosfatbufret saltvann (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 og 2 mM KH2PO4, pH 7,41.</li>
	<li>Forbered NTA-Atto 647 N fargestoff. Fortynn lager NTA-Atto 647 N fargestoff til 100 nM fra en 100% DMSO-løsning til PBS uten Tween.</li>
	<li>Express Vam7-His8 – Protein som fusjonsprotein i E. coli og rense ved hjelp av Ni-NTA og størrelseseksklusjonskromatografi8.</l...

<ol>
	<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroScale+Thermophoresis:+Interaction+analysis+and+beyond.">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li><li>Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, n. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+proteins+without+primary+sequence+tryptophan+residues:+mutant+trp+repressors+with+aliphatic+substitutions+for+tryptophan+side+chains.">Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains.</a> Gene. 163 (1), 1-11 (1995).</li><li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity.">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis.">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100 (2010).</li><li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis.">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding.">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li><li>Starr, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+induces+conformational+changes+in+Sec18+protomers+that+prevent+SNARE+priming.">Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).</li><li>Miner, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Central+Polybasic+Region+of+the+Soluble+SNARE+(Soluble+N-Ethylmaleimide-sensitive+Factor+Attachment+Protein+Receptor)+Vam7+Affects+Binding+to+Phosphatidylinositol+3-Phosphate+by+the+PX+(Phox+Homology)+Domain.">The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+phosphoinositide+partitioning+into+plasma+membrane+models.">Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models.</a> Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).</li><li>Zhao, H., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+guide+to+biochemical+approaches+for+analyzing+protein-lipid+interactions.">A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).</li><li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+proteins:+virulence+factors+of+intracellular+disease+agents.">Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents.</a> Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).</li><li>le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents.">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).</li><li>Corradi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Diversity+in+Lipid-Protein+Interactions.">Emerging Diversity in Lipid-Protein Interactions.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 5775-5848 (2019).</li><li>Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Microscale+Thermophoresis+to+Characterize+Hits+from+High-Throughput+Screening:+A+European+Lead+Factory+Perspective.">Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective.</a> SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).</li><li>Sparks, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+competitive+inhibitor+of+phosphatidic+acid+binding+by+the+AAA++protein+NSF/Sec18+blocks+the+SNARE-priming+stage+of+vacuole+fusion.">A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).</li></ol>

Bestemmelsen av Vam7-His8binding til DiC8-PA ga en robust montert KD for den gitte interaksjonen, som er litt lavere affinitet enn den målte KD av Vam7-His8 til PA liposomer (upublisert). Denne forskjellen skyldes mest sannsynlig mangel på en membran, noe som generelt resulterer i lavere affinitet for membranspesifikke lipidbindingsinteraksjoner og viser derfor rollen for liposomets membranstillas til denne interaksjonen11.
<p class="...

Mikroskala termoforese er en relativt ny teknikk for å bestemme disassosiasjonskonstanter (KD) samt hemmingskonstanter (IC50) mellom biokjemisk relevante ligander. Den ledende kommersielle forhandleren for MST (f.eks. NanoTemper) tilbyr to populære MST-teknologier: 1) Label free MST som krever en fluorescerende tag, og 2) merket termoforese ved hjelp av den iboende fluorescensen av proteiner avhengig av antall aromatiske rester som finnes i hvert protein1. En ulempe med etikettfri termoforese er at det i de fleste tilfeller ikke tillater måling av proteinproteininteraksjoner. Det kan imidlertid være mulig å konstruere proteiner uten aromatiske aminosyrer som tryptofan for bruk i etikettfri termoforese2.
MST måler bevegelsen av partikler som svar på induksjon av mikroskopiske temperaturfelt initiert av en infrarød laser i tilgjengelige teknologier1. MST kan brukes til å måle proteinproteininteraksjoner, protein-lipidinteraksjoner, protein-små molekyler, konkurranseeksperimenter og til og med interaksjoner mellom små molekyler så lenge man kan produsere nok signalseparasjon. I tillegg tillater MST måling av membranproteinbaserte interaksjoner innebygd i enten liposomer eller nanodiscs. Merket termoforese utnytter bruken av fluorescerende merkede tagger som muliggjør kjemisk kontrollerbar separasjon av signal mellom ligand og analytt. KD-verdier kan oppnås ved hjelp av termoforese for interaksjoner som involverer proteinbinding ved lave nanomolarkonsentrasjoner, som i de fleste tilfeller er en mye lavere konsentrasjon av protein enn det som kreves for isotermisk kalorimetri (ITC)3. I tillegg har MST ikke strenge bufferkrav som kreves for overflateplasmonresonans (SPR)4 og merket termoforese kan til og med brukes til å måle bindende konstanter av proteiner av interesse fra ikke-fullstendig rensede proteinløsninger5 med genetisk innsatte fluorescerende koder6. En ulempe med MST er at kinetiske parametere ikke kan oppnås lett for MST som i SPR2.
Termoforesemålinger avhenger av den lokale temperaturforskjellen til en løsning. Denne varmen kan genereres fra en infrarød laser. MST-enheten har en fluorescensdetektor koblet til en infrarød (IR) stråle og kan plukke opp endringer i fluorescens fra lokale konsentrasjonsendringer av fluorescerende molekyler på det punktet hvor IR-laseren er målrettet. MST-enheten bruker en IR-målrettet laser koblet direkte til en fluorescensdetektor fokusert på samme tidspunkt som varmen genereres i løsningen. Dette muliggjør robust deteksjon av temperaturendringer som tilsvarer uttømming av molekyler ved varmepunktet generert av IR-laseren. Målt fluorescens reduseres vanligvis nærmere IR-laseren som følge av temperaturøkninger. Forskjellene målt som et resultat kan skyldes flere faktorer, inkludert ladning, størrelse eller solvasjon entropi. Disse forskjellene måles som endringer i fluorescens som følge av induksjon av varme eller bevegelse av molekyler fra varme til kaldere deler av kapillæren.
Når du laster en kapillær med en gitt løsning, er det viktig å forlate luft i hver ende av kapillæren og ikke laste kapillæren helt full. Den kommersielle kapillæren har ca 10 μL løsning. Man kan oppnå nøyaktige målinger med 5 μL løsning så lenge løsningen er manipulert til midten av kapillæren, det er ingen luftbobler (potensielt degas før lasting av kapillær), og man er forsiktig med å laste stativet for ikke å jostle løsningen fra midten av kapillæren, hvor den infrarøde laseren er målrettet. Hvis laseren ikke kommer i kontakt fullt ut med løsningen, vil resultatet mest sannsynlig være en av tre ubrukelige utganger for den konsentrasjonen: 1) ingen eller lav fluorescensdeteksjon, 2) høyere fluorescensdeteksjon (potensielt med hakket topp), eller 3) fluorescensdeteksjon innenfor andre verdier fra gitt titrering, men med en hakket og uberørt topp.
For merket termoforese er det optimalt å ha et fluorescenssignal over 200 og under 2000 fluorescensenheter7. MST-enheten bruker en rekke LED-intensiteter fra 0 til 100, som kan velges for å oppnå et signal over 200 eller under 2000. Alternativt kan man bruke forskjellige konsentrasjoner av den merkede liganden for å endre fluorescenssignalet til et optimalt nivå. Det er viktig å kjøre en cap scan med en gitt MST-måling som referanse når du analyserer data, da en dårlig cap scan ofte kan resultere i et punkt som senere kan bestemmes å være en outlier. Hver kjøring bør ta omtrent 30 minutter hvis du måler en enkelt MST-strøm med en hetteskanning. De kommersielle enhetene tillater endringer i MST-strøm. I eldre programvareversjoner kan dette angis fra 0 til 100. og i senere versjoner kan man velge lav, middels eller høy MST. For å oppnå robuste spor, kan det hende at en forsker må prøve hver av disse og bestemme hvilken MST-innstilling som resulterer i de mest robuste dataene for en gitt interaksjon.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>For protein labeleing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prsim</td>
			<td>Graphpad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-K022</td>
			<td>Capillaries for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 machine</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td></td>
			<td>University equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-Atto 647 N</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2175</td>
			<td>label for His tags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3008</td>
			<td>Lipid for binding experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions

Evnen til å bestemme lipidenes bindende affinitet til proteiner er en viktig del av forståelsen av protein-lipid interaksjoner i membranhandel, signaltransduksjon og cytoskeletal ombygging. Klassiske verktøy for måling av slike interaksjoner inkluderer overflateplasmon resonans (SPR) og isotermisk titreringskalorimetri (ITC). Mens kraftige verktøy, disse tilnærmingene har tilbakeslag. ITC krever store mengder renset protein samt lipider, noe som kan være kostbart og vanskelig å produsere. Videre er ITC så vel som SPR svært tidkrevende, noe som kan legge betydelig til kostnadene ved å utføre disse eksperimentene. En måte å omgå disse begrensningene på er å bruke den relativt nye teknikken for mikroskala termoforese (MST). MST er rask og kostnadseffektiv ved hjelp av små mengder prøve for å oppnå en metningskurve for en gitt bindingshendelse. Det finnes for øyeblikket to typer MST-systemer tilgjengelig. En type MST krever merking med fluorofor i det blå eller røde spekteret. Det andre systemet er avhengig av den iboende fluorescensen av aromatiske aminosyrer i UV-serien. Begge systemene oppdager bevegelsen av molekyler som svar på lokalisert induksjon av varme fra en infrarød laser. Hver tilnærming har sine fordeler og ulemper. Etikettfri MST kan bruke ukodede innfødte proteiner; Imidlertid er mange analytter, inkludert legemidler, fluoresce i UV-området, noe som kan forstyrre bestemmelsen av nøyaktige KD-verdier. Til sammenligning gir merket MST mulighet for et større mangfold av målbare parvise interaksjoner ved hjelp av fluorescerende merkede sonder festet til ligander med målbare absorbanser i det synlige området i motsetning til UV, noe som begrenser potensialet for å forstyrre signaler fra analytter.

Dette er et eksempel på utdata som bruker affinitetsanalysen. Den merkede MST ble brukt til å bestemme bindingskonstanten til Vam7-His8 til den løselige dioktanoyl (DiC8) PA av et av sine naturlige substrater9. Figur 1 presenterer de termoforetiske sporene fra en studie av en 1:1-titrering av DiC8 PA fra 500 μM mot 50 nM Vam7-His8. Innledende fluorescens (tid før infrarød laser slått på), Tjump (tid først etter at infrarød laser slått på) og termoforese (n...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions at JoVE.com

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Mikroskala termoforese oppnår bindende konstanter raskt til lav materialkostnad. Enten merket eller etikettfri mikroskala termoforese er kommersielt tilgjengelig; Etikettfri termoforese er imidlertid ikke i stand til mangfoldet av interaksjonsmålinger som kan utføres ved hjelp av fluorescerende etiketter. Vi tilbyr en protokoll for merkede termoforesemålinger.

Bruk av mikroskala termoforese for å måle protein-lipid interaksjoner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Merket mikroskala termoforese oppnår disassosiasjonskonstanter, eller KDer, av forskjellige biokjemiske interaksjoner effektivt. Denne protokollen og den fulgte videoen gir omtrentlig affinitet for Vam7, det eneste oppløselige SNARE-proteinet i gjær, til fosfatidsyre. Dette er måten Vam7 forbinder med to membraner før han samhandler med andre proteiner.Denne metoden oppnår KDs raskt for ulike biokjemiske interaksjoner til lav pris, med høy reproduserbarhet og med minimal proteinkostnad. Denne teknikken er egnet for førstetrinns farmasøytisk utvikling, slik at lett oppnåelige KDs kan bestemme potensielle blyforbindelser. Før du starter en analyse, slår du på strømbryteren på baksiden av MST-enheten og åpner kontrollprogramvaren.Kontroller at datamaskinen er koblet til enheten og i tilkoblet status, og sett MST Før til 3 sekunder, MST til 30 sekunder og Fluorescence Recovery til etter 1 sekund. For hvert kapillærrør skriver du inn navnet på målligen, navnet på ligandanalytten, konsentrasjonen av målet og den høyeste titreringskonsentrasjonen ved hjelp av autofylltitreringsforholdet. Velg en rekke MST-krefter, og angi verdier for hver kraft som skal testes for den mest robuste bindingstilpasning.For å forberede merkede MST-prøver, fortynn en Vam7-octahistidine-løsning til en 200 nanomolarkonsentrasjon og en NTA-Atto 647 fargestoff til 100 nanomolarkonsentrasjon, begge i PBS. Bland Vam7-octahistidine og NTA-Atto 647 fargestoff med et volumtrisk forhold på 1:1 og la blandingen sitte ved romtemperatur beskyttet mot lys i 30 minutter. På slutten av inkubasjonen sentrifugerer du fargestoff- og proteinblandingen og lagrer løsningen ved 4 grader Celsius i opptil noen timer før bruk.Deretter forbereder du prøven, tar farget ligand og eksponerer analytten. For mikroskala termoforese av prøven, åpne enheten og skyv kapillærstativet ut. Last prøvekapillærene inn i stativet med den høyeste konsentrasjonen i posisjon én, og velg den røde kanalen i kontrollprogramvaren.Deretter legger du stativet i instrumentet. Velg deretter et område med MST-strøm og start CAP Scan MST-målingen og evaluer skiftresponsen. Termoforetiske spor fra en studie av en 1:1 titrering av DiC8 PA fra 500 mikromol mot 50 nanomolar NTA-Atto 647 merket Vam7 domene er vist her.Den første fluorescens, tidshopp og termoforese kan observeres, slik at KD kan beregnes fra en hvilken som helst eller en kombinasjon av disse målingene. En metningskurve kan plottes fra disse resultatene, for eksempel for termoforesen med tidshopputgangen, som illustrert i grafen. Generelt bestemmes MST-resultatene ved hjelp av loggskala, med tanke på proteinkonsentrasjonen for å bestemme bindingsaffiniteten ved å velge KD-modellen og legge inn proteinkonsentrasjonen.Når du utfører denne protokollen, må du sørge for at løsningen er i midten av kapillæren og at det ikke er luftbobler, og at kapillæren ikke har støv eller løsning på utsiden av kapillæren. Isotermisk titreringskalorimetri eller overflateplasmonresonans kan brukes til å validere den eksperimentelle KD oppnådd. Hvis det finnes potensielle kooperative bindinger, vil ITC være den neste logiske metoden som utføres, gitt ressurser.Denne teknikken har gjort det mulig for tradisjonelle biologiforskere å innlemme biofysiske screeningteknikker i sin forskning for å bestemme veiforhold. Et eksempel på denne teknikken er cellelysase med målproteinet uttrykt endogenet, der GFP-koden er en ny måte å utføre en tradisjonell nedtrekksanalyse på.

use-of-microscale-thermophoresis-to-measure-protein-lipid-interactions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Kartlegging av bindingssetet på en Aptamer på ATP Bruke mikro termodiffusjon

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

Kvantitativ Immunofluorescence å måle globale lokalisert oversettelse

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Biotinylated celle-gjennomtrengende peptider å studere intracellulær Protein-protein interaksjoner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Måle interaksjoner Globular og trådformede proteiner av kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi (NRM) og Mikroskala Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

Atomic absorbansen spektroskopi å måle intracellulære zinc Pools i pattedyrceller

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an upstream 3&#39; splice site within a pre-mRNA, a process called back-splicing. This circularization is likely aided by secondary structures in the pre-mRNA that bring the splice sites into close proximity. In human genes, Alu elements are thought to promote these secondary RNA structures, as Alu elements are abundant and exhibit base complementarities with each other when present in opposite directions in the pre-mRNA. Here, we describe the generation and analysis of large, Alu element containing reporter genes that form circular RNAs. Through optimization of cloning protocols, reporter genes with up to 20 kb insert length can be generated. Their analysis in co-transfection experiments allows the identification of regulatory factors. Thus, this method can identify RNA sequences and cellular components involved in circular RNA formation.

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

We clone and analyze reporter genes generating circular RNAs. These reporter genes are larger than constructs to analyze linear splicing and contain Alu elements. To investigate the circular RNAs, the constructs are transfected into cells and resulting RNA is analyzed using RT-PCR after removal of linear RNA.

Bruk av Alu Element som inneholder minigenes å analysere sirkulære RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

Ikke-radioaktiv analyse for å måle polynukleotidfosforylering av små nukleotids underlag

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent advancements in CD spectroscopy have enabled the study of DNA-protein interactions and conformational dynamics of DNA in different microenvironments in detail for a better understanding of transcriptional regulation in vivo. The area around a potential transcription zone needs to be unwound for transcription to occur. This is a complex process requiring the coordination of histone modifications, binding of the transcription factor to DNA, and other chromatin remodeling activities. Using CD spectroscopy, it is possible to study conformational changes in the promoter region caused by regulatory proteins, such as ATP-dependent chromatin remodelers, to promote transcription. The conformational changes occurring in the protein can also be monitored. In addition, queries regarding the affinity of the protein towards its target DNA and sequence specificity can be addressed by incorporating mutations in the target DNA. In short, the unique understanding of this sensitive and inexpensive method can predict changes in chromatin dynamics, thereby improving the understanding of transcriptional regulation.

The interaction of an ATP-dependent chromatin remodeler with a DNA ligand is described using CD spectroscopy. The induced conformational changes on a gene promoter analyzed by the peaks generated can be used to understand the mechanism of transcriptional regulation.

CD-spektroskopi for å studere DNA-proteininteraksjoner

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

Concanavalin A-basert sedimenteringsanalyse for å måle substratbinding av glukanfosfataser

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Stabil isotopsporing og LC-MS-analyse for å måle DHODH- og SDH-aktiviteter

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

Forfatter Spotlight: Oksygenuavhengige analyser for å måle mitokondriell funksjon hos pattedyr  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

Oksygenuavhengige analyser for å måle mitokondriefunksjon hos pattedyr

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...