Name: use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions
Uploaded: 2022-02-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av et stipend fra National Science Foundation (MCB 1818310) til RAF. Dette arbeidet ble delvis støttet av Chemical Biology Core Facility/Protein Crystallography Unit ved H. Lee Moffitt Cancer Center (NIH/NCI: P30-CA076292).

1. Fremstilling av materialer
<ol><li>Forbered fosfatbufret saltvann (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 og 2 mM KH2PO4, pH 7,41.</li>
	<li>Forbered NTA-Atto 647 N fargestoff. Fortynn lager NTA-Atto 647 N fargestoff til 100 nM fra en 100% DMSO-løsning til PBS uten Tween.</li>
	<li>Express Vam7-His8 – Protein som fusjonsprotein i E. coli og rense ved hjelp av Ni-NTA og størrelseseksklusjonskromatografi8.</l...

<ol>
	<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroScale+Thermophoresis:+Interaction+analysis+and+beyond.">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li><li>Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, n. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+proteins+without+primary+sequence+tryptophan+residues:+mutant+trp+repressors+with+aliphatic+substitutions+for+tryptophan+side+chains.">Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains.</a> Gene. 163 (1), 1-11 (1995).</li><li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity.">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis.">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100 (2010).</li><li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis.">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding.">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li><li>Starr, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+induces+conformational+changes+in+Sec18+protomers+that+prevent+SNARE+priming.">Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).</li><li>Miner, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Central+Polybasic+Region+of+the+Soluble+SNARE+(Soluble+N-Ethylmaleimide-sensitive+Factor+Attachment+Protein+Receptor)+Vam7+Affects+Binding+to+Phosphatidylinositol+3-Phosphate+by+the+PX+(Phox+Homology)+Domain.">The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+phosphoinositide+partitioning+into+plasma+membrane+models.">Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models.</a> Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).</li><li>Zhao, H., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+guide+to+biochemical+approaches+for+analyzing+protein-lipid+interactions.">A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).</li><li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+proteins:+virulence+factors+of+intracellular+disease+agents.">Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents.</a> Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).</li><li>le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents.">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).</li><li>Corradi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Diversity+in+Lipid-Protein+Interactions.">Emerging Diversity in Lipid-Protein Interactions.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 5775-5848 (2019).</li><li>Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Microscale+Thermophoresis+to+Characterize+Hits+from+High-Throughput+Screening:+A+European+Lead+Factory+Perspective.">Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective.</a> SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).</li><li>Sparks, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+competitive+inhibitor+of+phosphatidic+acid+binding+by+the+AAA++protein+NSF/Sec18+blocks+the+SNARE-priming+stage+of+vacuole+fusion.">A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).</li></ol>

Bestemmelsen av Vam7-His8binding til DiC8-PA ga en robust montert KD for den gitte interaksjonen, som er litt lavere affinitet enn den målte KD av Vam7-His8 til PA liposomer (upublisert). Denne forskjellen skyldes mest sannsynlig mangel på en membran, noe som generelt resulterer i lavere affinitet for membranspesifikke lipidbindingsinteraksjoner og viser derfor rollen for liposomets membranstillas til denne interaksjonen11.
<p class="...

Mikroskala termoforese er en relativt ny teknikk for å bestemme disassosiasjonskonstanter (KD) samt hemmingskonstanter (IC50) mellom biokjemisk relevante ligander. Den ledende kommersielle forhandleren for MST (f.eks. NanoTemper) tilbyr to populære MST-teknologier: 1) Label free MST som krever en fluorescerende tag, og 2) merket termoforese ved hjelp av den iboende fluorescensen av proteiner avhengig av antall aromatiske rester som finnes i hvert protein1. En ulempe med etikettfri termoforese er at det i de fleste tilfeller ikke tillater måling av proteinproteininteraksjoner. Det kan imidlertid være mulig å konstruere proteiner uten aromatiske aminosyrer som tryptofan for bruk i etikettfri termoforese2.
MST måler bevegelsen av partikler som svar på induksjon av mikroskopiske temperaturfelt initiert av en infrarød laser i tilgjengelige teknologier1. MST kan brukes til å måle proteinproteininteraksjoner, protein-lipidinteraksjoner, protein-små molekyler, konkurranseeksperimenter og til og med interaksjoner mellom små molekyler så lenge man kan produsere nok signalseparasjon. I tillegg tillater MST måling av membranproteinbaserte interaksjoner innebygd i enten liposomer eller nanodiscs. Merket termoforese utnytter bruken av fluorescerende merkede tagger som muliggjør kjemisk kontrollerbar separasjon av signal mellom ligand og analytt. KD-verdier kan oppnås ved hjelp av termoforese for interaksjoner som involverer proteinbinding ved lave nanomolarkonsentrasjoner, som i de fleste tilfeller er en mye lavere konsentrasjon av protein enn det som kreves for isotermisk kalorimetri (ITC)3. I tillegg har MST ikke strenge bufferkrav som kreves for overflateplasmonresonans (SPR)4 og merket termoforese kan til og med brukes til å måle bindende konstanter av proteiner av interesse fra ikke-fullstendig rensede proteinløsninger5 med genetisk innsatte fluorescerende koder6. En ulempe med MST er at kinetiske parametere ikke kan oppnås lett for MST som i SPR2.
Termoforesemålinger avhenger av den lokale temperaturforskjellen til en løsning. Denne varmen kan genereres fra en infrarød laser. MST-enheten har en fluorescensdetektor koblet til en infrarød (IR) stråle og kan plukke opp endringer i fluorescens fra lokale konsentrasjonsendringer av fluorescerende molekyler på det punktet hvor IR-laseren er målrettet. MST-enheten bruker en IR-målrettet laser koblet direkte til en fluorescensdetektor fokusert på samme tidspunkt som varmen genereres i løsningen. Dette muliggjør robust deteksjon av temperaturendringer som tilsvarer uttømming av molekyler ved varmepunktet generert av IR-laseren. Målt fluorescens reduseres vanligvis nærmere IR-laseren som følge av temperaturøkninger. Forskjellene målt som et resultat kan skyldes flere faktorer, inkludert ladning, størrelse eller solvasjon entropi. Disse forskjellene måles som endringer i fluorescens som følge av induksjon av varme eller bevegelse av molekyler fra varme til kaldere deler av kapillæren.
Når du laster en kapillær med en gitt løsning, er det viktig å forlate luft i hver ende av kapillæren og ikke laste kapillæren helt full. Den kommersielle kapillæren har ca 10 μL løsning. Man kan oppnå nøyaktige målinger med 5 μL løsning så lenge løsningen er manipulert til midten av kapillæren, det er ingen luftbobler (potensielt degas før lasting av kapillær), og man er forsiktig med å laste stativet for ikke å jostle løsningen fra midten av kapillæren, hvor den infrarøde laseren er målrettet. Hvis laseren ikke kommer i kontakt fullt ut med løsningen, vil resultatet mest sannsynlig være en av tre ubrukelige utganger for den konsentrasjonen: 1) ingen eller lav fluorescensdeteksjon, 2) høyere fluorescensdeteksjon (potensielt med hakket topp), eller 3) fluorescensdeteksjon innenfor andre verdier fra gitt titrering, men med en hakket og uberørt topp.
For merket termoforese er det optimalt å ha et fluorescenssignal over 200 og under 2000 fluorescensenheter7. MST-enheten bruker en rekke LED-intensiteter fra 0 til 100, som kan velges for å oppnå et signal over 200 eller under 2000. Alternativt kan man bruke forskjellige konsentrasjoner av den merkede liganden for å endre fluorescenssignalet til et optimalt nivå. Det er viktig å kjøre en cap scan med en gitt MST-måling som referanse når du analyserer data, da en dårlig cap scan ofte kan resultere i et punkt som senere kan bestemmes å være en outlier. Hver kjøring bør ta omtrent 30 minutter hvis du måler en enkelt MST-strøm med en hetteskanning. De kommersielle enhetene tillater endringer i MST-strøm. I eldre programvareversjoner kan dette angis fra 0 til 100. og i senere versjoner kan man velge lav, middels eller høy MST. For å oppnå robuste spor, kan det hende at en forsker må prøve hver av disse og bestemme hvilken MST-innstilling som resulterer i de mest robuste dataene for en gitt interaksjon.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>For protein labeleing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prsim</td>
			<td>Graphpad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-K022</td>
			<td>Capillaries for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 machine</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td></td>
			<td>University equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-Atto 647 N</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2175</td>
			<td>label for His tags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3008</td>
			<td>Lipid for binding experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions

Evnen til å bestemme lipidenes bindende affinitet til proteiner er en viktig del av forståelsen av protein-lipid interaksjoner i membranhandel, signaltransduksjon og cytoskeletal ombygging. Klassiske verktøy for måling av slike interaksjoner inkluderer overflateplasmon resonans (SPR) og isotermisk titreringskalorimetri (ITC). Mens kraftige verktøy, disse tilnærmingene har tilbakeslag. ITC krever store mengder renset protein samt lipider, noe som kan være kostbart og vanskelig å produsere. Videre er ITC så vel som SPR svært tidkrevende, noe som kan legge betydelig til kostnadene ved å utføre disse eksperimentene. En måte å omgå disse begrensningene på er å bruke den relativt nye teknikken for mikroskala termoforese (MST). MST er rask og kostnadseffektiv ved hjelp av små mengder prøve for å oppnå en metningskurve for en gitt bindingshendelse. Det finnes for øyeblikket to typer MST-systemer tilgjengelig. En type MST krever merking med fluorofor i det blå eller røde spekteret. Det andre systemet er avhengig av den iboende fluorescensen av aromatiske aminosyrer i UV-serien. Begge systemene oppdager bevegelsen av molekyler som svar på lokalisert induksjon av varme fra en infrarød laser. Hver tilnærming har sine fordeler og ulemper. Etikettfri MST kan bruke ukodede innfødte proteiner; Imidlertid er mange analytter, inkludert legemidler, fluoresce i UV-området, noe som kan forstyrre bestemmelsen av nøyaktige KD-verdier. Til sammenligning gir merket MST mulighet for et større mangfold av målbare parvise interaksjoner ved hjelp av fluorescerende merkede sonder festet til ligander med målbare absorbanser i det synlige området i motsetning til UV, noe som begrenser potensialet for å forstyrre signaler fra analytter.

Dette er et eksempel på utdata som bruker affinitetsanalysen. Den merkede MST ble brukt til å bestemme bindingskonstanten til Vam7-His8 til den løselige dioktanoyl (DiC8) PA av et av sine naturlige substrater9. Figur 1 presenterer de termoforetiske sporene fra en studie av en 1:1-titrering av DiC8 PA fra 500 μM mot 50 nM Vam7-His8. Innledende fluorescens (tid før infrarød laser slått på), Tjump (tid først etter at infrarød laser slått på) og termoforese (n...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions at JoVE.com

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Mikroskala termoforese oppnår bindende konstanter raskt til lav materialkostnad. Enten merket eller etikettfri mikroskala termoforese er kommersielt tilgjengelig; Etikettfri termoforese er imidlertid ikke i stand til mangfoldet av interaksjonsmålinger som kan utføres ved hjelp av fluorescerende etiketter. Vi tilbyr en protokoll for merkede termoforesemålinger.

Bruk av mikroskala termoforese for å måle protein-lipid interaksjoner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Merket mikroskala termoforese oppnår disassosiasjonskonstanter, eller KDer, av forskjellige biokjemiske interaksjoner effektivt. Denne protokollen og den fulgte videoen gir omtrentlig affinitet for Vam7, det eneste oppløselige SNARE-proteinet i gjær, til fosfatidsyre. Dette er måten Vam7 forbinder med to membraner før han samhandler med andre proteiner.Denne metoden oppnår KDs raskt for ulike biokjemiske interaksjoner til lav pris, med høy reproduserbarhet og med minimal proteinkostnad. Denne teknikken er egnet for førstetrinns farmasøytisk utvikling, slik at lett oppnåelige KDs kan bestemme potensielle blyforbindelser. Før du starter en analyse, slår du på strømbryteren på baksiden av MST-enheten og åpner kontrollprogramvaren.Kontroller at datamaskinen er koblet til enheten og i tilkoblet status, og sett MST Før til 3 sekunder, MST til 30 sekunder og Fluorescence Recovery til etter 1 sekund. For hvert kapillærrør skriver du inn navnet på målligen, navnet på ligandanalytten, konsentrasjonen av målet og den høyeste titreringskonsentrasjonen ved hjelp av autofylltitreringsforholdet. Velg en rekke MST-krefter, og angi verdier for hver kraft som skal testes for den mest robuste bindingstilpasning.For å forberede merkede MST-prøver, fortynn en Vam7-octahistidine-løsning til en 200 nanomolarkonsentrasjon og en NTA-Atto 647 fargestoff til 100 nanomolarkonsentrasjon, begge i PBS. Bland Vam7-octahistidine og NTA-Atto 647 fargestoff med et volumtrisk forhold på 1:1 og la blandingen sitte ved romtemperatur beskyttet mot lys i 30 minutter. På slutten av inkubasjonen sentrifugerer du fargestoff- og proteinblandingen og lagrer løsningen ved 4 grader Celsius i opptil noen timer før bruk.Deretter forbereder du prøven, tar farget ligand og eksponerer analytten. For mikroskala termoforese av prøven, åpne enheten og skyv kapillærstativet ut. Last prøvekapillærene inn i stativet med den høyeste konsentrasjonen i posisjon én, og velg den røde kanalen i kontrollprogramvaren.Deretter legger du stativet i instrumentet. Velg deretter et område med MST-strøm og start CAP Scan MST-målingen og evaluer skiftresponsen. Termoforetiske spor fra en studie av en 1:1 titrering av DiC8 PA fra 500 mikromol mot 50 nanomolar NTA-Atto 647 merket Vam7 domene er vist her.Den første fluorescens, tidshopp og termoforese kan observeres, slik at KD kan beregnes fra en hvilken som helst eller en kombinasjon av disse målingene. En metningskurve kan plottes fra disse resultatene, for eksempel for termoforesen med tidshopputgangen, som illustrert i grafen. Generelt bestemmes MST-resultatene ved hjelp av loggskala, med tanke på proteinkonsentrasjonen for å bestemme bindingsaffiniteten ved å velge KD-modellen og legge inn proteinkonsentrasjonen.Når du utfører denne protokollen, må du sørge for at løsningen er i midten av kapillæren og at det ikke er luftbobler, og at kapillæren ikke har støv eller løsning på utsiden av kapillæren. Isotermisk titreringskalorimetri eller overflateplasmonresonans kan brukes til å validere den eksperimentelle KD oppnådd. Hvis det finnes potensielle kooperative bindinger, vil ITC være den neste logiske metoden som utføres, gitt ressurser.Denne teknikken har gjort det mulig for tradisjonelle biologiforskere å innlemme biofysiske screeningteknikker i sin forskning for å bestemme veiforhold. Et eksempel på denne teknikken er cellelysase med målproteinet uttrykt endogenet, der GFP-koden er en ny måte å utføre en tradisjonell nedtrekksanalyse på.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescens anisotropi som et verktøy for å studere protein-protein interaksjoner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Kartlegging av bindingssetet på en Aptamer på ATP Bruke mikro termodiffusjon

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Kvantitativ Immunofluorescence å måle globale lokalisert oversettelse

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated celle-gjennomtrengende peptider å studere intracellulær Protein-protein interaksjoner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Måle interaksjoner Globular og trådformede proteiner av kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi (NRM) og Mikroskala Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomic absorbansen spektroskopi å måle intracellulære zinc Pools i pattedyrceller

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Bruk av Alu Element som inneholder minigenes å analysere sirkulære RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Ikke-radioaktiv analyse for å måle polynukleotidfosforylering av små nukleotids underlag

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

CD-spektroskopi for å studere DNA-proteininteraksjoner

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Concanavalin A-basert sedimenteringsanalyse for å måle substratbinding av glukanfosfataser

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...