Name: use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions
Uploaded: 2022-02-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Fundação Nacional de Ciência (MCB 1818310) para a RAF. Este trabalho foi apoiado em parte pela Unidade de Cristalidade de Biologia Química/Proteína do H. Lee Moffitt Cancer Center (NIH/NCI: P30-CA076292).

1. Preparação de materiais
<ol><li>Preparar soro fisco tampão de fosfato (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 e 2 mM KH2PO4, pH 7.41.</li>
	<li>Prepare o corante NTA-Atto 647 N. Diluir o estoque NTA-Atto 647 N corante para 100 nM de uma solução DMSO 100% em PBS sem Interpol.</li>
	<li>Express Vam7-His8 – Proteína como proteína de fusão em E. coli e purificar usando Ni-NTA e exclusão de tamanho cromatografia8.<sup class="xre...

<ol>
	<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroScale+Thermophoresis:+Interaction+analysis+and+beyond.">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li><li>Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, n. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+proteins+without+primary+sequence+tryptophan+residues:+mutant+trp+repressors+with+aliphatic+substitutions+for+tryptophan+side+chains.">Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains.</a> Gene. 163 (1), 1-11 (1995).</li><li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity.">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis.">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100 (2010).</li><li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis.">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding.">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li><li>Starr, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+induces+conformational+changes+in+Sec18+protomers+that+prevent+SNARE+priming.">Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).</li><li>Miner, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Central+Polybasic+Region+of+the+Soluble+SNARE+(Soluble+N-Ethylmaleimide-sensitive+Factor+Attachment+Protein+Receptor)+Vam7+Affects+Binding+to+Phosphatidylinositol+3-Phosphate+by+the+PX+(Phox+Homology)+Domain.">The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+phosphoinositide+partitioning+into+plasma+membrane+models.">Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models.</a> Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).</li><li>Zhao, H., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+guide+to+biochemical+approaches+for+analyzing+protein-lipid+interactions.">A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).</li><li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+proteins:+virulence+factors+of+intracellular+disease+agents.">Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents.</a> Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).</li><li>le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents.">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).</li><li>Corradi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Diversity+in+Lipid-Protein+Interactions.">Emerging Diversity in Lipid-Protein Interactions.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 5775-5848 (2019).</li><li>Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Microscale+Thermophoresis+to+Characterize+Hits+from+High-Throughput+Screening:+A+European+Lead+Factory+Perspective.">Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective.</a> SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).</li><li>Sparks, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+competitive+inhibitor+of+phosphatidic+acid+binding+by+the+AAA++protein+NSF/Sec18+blocks+the+SNARE-priming+stage+of+vacuole+fusion.">A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).</li></ol>

A determinação de Vam7-His8binding para DiC8-PA forneceu um KD robusto para a interação dada, que é um pouco menor do que o KD medido de Vam7-His8 para lipossomos pa (inédito). Essa diferença é mais provável devido à falta de uma membrana, o que geralmente resulta em menor afinidade para interações de ligação lipídica específica da membrana e, portanto, demonstra o papel do andaime de membrana liposso para esta interação11</sup...

A termoforese de microescala é uma técnica relativamente nova na determinação das constantes de desassociação (KD), bem como as constantes de inibição (IC50) entre ligantes bioquimicamente relevantes. O principal varejista comercial para MST (por exemplo, NanoTemper) oferece duas tecnologias populares de MST: 1) Rotular MST livre exigindo uma marca fluorescente, e 2) rotulada termoforese usando a fluorescência inerente de proteínas dependentes do número de resíduos aromáticos presentes em cada proteína1. Uma desvantagem da termoforese sem rótulo é que, na maioria dos casos, não permite a medição de interações proteína-proteína. No entanto, pode ser possível projetar proteínas sem aminoácidos aromáticos, como o triptofano para uso na termoforese gratuita de rótulo2.
O MST mede o movimento das partículas em resposta à indução de campos de temperatura microscópicos iniciados por um laser infravermelho em tecnologias atualmente disponíveis1. O MST pode ser usado para medir interações proteína-proteína, interações proteína-lipídicas, moléculas proteicas pequenas, experimentos de competição e até interações entre pequenas moléculas, desde que se possa produzir separação de sinal suficiente. Além disso, o MST permite a medição de interações à base de proteína de membrana embutidas em lipossomos ou nanodiscos. A termoforese rotulada aproveita o uso de etiquetas fluorescentes rotuladas permitindo a separação quimicamente controlável do sinal entre ligante e analito. Os valores de KD podem ser obtidos utilizando termoforese para interações envolvendo ligação proteica em baixas concentrações de nanomolar, que na maioria dos casos é uma concentração de proteína muito menor do que a necessária para a calimeto isotermal (ITC)3. Além disso, o MST não possui requisitos rigorosos de tampão, conforme exigido para a ressonância de plasmon superficial (SPR)4 e a termoforese rotulada pode até mesmo ser usada para medir constantes vinculantes de proteínas de interesse de soluções proteicas não totalmente purificadas5 com tags fluorescentes geneticamente inseridas6. Uma desvantagem do MST é que os parâmetros cinéticos não podem ser obtidos prontamente para o MST como no SPR2.
As medidas de termoforese dependem da diferença de temperatura local de uma solução. Este calor pode ser gerado a partir de um laser infravermelho. O dispositivo MST tem um detector de fluorescência acoplado a um feixe infravermelho (IR) e pode captar alterações na fluorescência das mudanças de concentração locais das moléculas fluorescentes no ponto em que o laser IR é alvo. O dispositivo MST utiliza um laser direcionado ao IR acoplado diretamente a um detector de fluorescência focado no mesmo ponto em que o calor é gerado na solução. Isso permite uma detecção robusta de mudanças de temperatura correspondentes ao esgotamento das moléculas no ponto de calor gerado pelo laser IR. A fluorescência medida geralmente diminui mais perto do laser ir em resposta ao aumento da temperatura. As diferenças medidas como resultado podem ser devido a vários fatores, incluindo carga, tamanho ou entropia de solvação. Essas diferenças são medidas como mudanças na fluorescência em resposta à indução do calor ou movimento de moléculas de partes quentes a mais frias do capilar.
Ao carregar um capilar com uma determinada solução, é importante deixar o ar em cada extremidade do capilar e não carregar o capilar completamente cheio. O capilar comercial contém cerca de 10 μL de solução. Pode-se obter medições precisas com 5 μL de solução desde que a solução seja manipulada para o centro do capilar, não há bolhas de ar (potencialmente degas antes do carregamento capilar), e é preciso carregar o rack para não sacudir a solução do centro do capilar, onde o laser infravermelho é alvo. Se o laser não entrar em contato totalmente com a solução, o resultado provavelmente será uma das três saídas inutilizáveis para essa concentração: 1) não ou baixa detecção de fluorescência, 2) maior detecção de fluorescência (potencialmente com pico irregular), ou 3) detecção de fluorescência dentro de outros valores a partir dada titulação, mas com um pico irregular e não encaminhado.
Para termoforese rotulada é ideal ter um sinal de fluorescência acima de 200 e abaixo de 2000 unidades de fluorescência7. O dispositivo MST usa uma gama de intensidades led de 0 a 100, que podem ser selecionadas para alcançar um sinal acima de 200 ou abaixo de 2000. Alternativamente, pode-se usar diferentes concentrações do ligante rotulado para modificar o sinal de fluorescência a um nível ideal. É importante executar uma varredura de tampa com uma determinada medição MST como referência ao analisar dados, pois uma verificação de tampa ruim pode muitas vezes resultar em um ponto que pode ser mais tarde determinado como um outlier. Cada execução deve levar aproximadamente 30 minutos se medir uma única potência MST com uma varredura de tampa. Os dispositivos comerciais permitem alterações na potência do MST. Em versões de software mais antigas isso poderia ser definido de 0 a 100; e nas versões posteriores pode-se selecionar MST baixo, médio ou alto. Para alcançar traços robustos, um pesquisador pode precisar tentar cada um desses e decidir qual configuração do MST resulta nos dados mais robustos para uma determinada interação.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>For protein labeleing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prsim</td>
			<td>Graphpad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-K022</td>
			<td>Capillaries for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 machine</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td></td>
			<td>University equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-Atto 647 N</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2175</td>
			<td>label for His tags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3008</td>
			<td>Lipid for binding experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions

A capacidade de determinar a afinidade vinculante dos lipídios às proteínas é uma parte essencial da compreensão das interações proteína-lipídicas no tráfico de membranas, transdução de sinais e remodelagem citoesquelética. Ferramentas clássicas para medir tais interações incluem ressonância de plasmon superficial (SPR) e calorimetria de titulação isotermal (ITC). Embora ferramentas poderosas, essas abordagens têm contratempos. O ITC requer grandes quantidades de proteína purificada, bem como lipídios, que podem ser caros e difíceis de produzir. Além disso, o ITC e o SPR são muito demorados, o que poderia agregar significativamente ao custo de realizar esses experimentos. Uma maneira de contornar essas restrições é usar a técnica relativamente nova de termoforese de microescala (MST). O MST é rápido e econômico usando pequenas quantidades de amostra para obter uma curva de saturação para um determinado evento de vinculação. Atualmente existem dois tipos de sistemas MST disponíveis. Um tipo de MST requer rotulagem com um fluoróforo no espectro azul ou vermelho. O segundo sistema conta com a fluorescência intrínseca de aminoácidos aromáticos na faixa UV. Ambos os sistemas detectam o movimento das moléculas em resposta à indução localizada de calor de um laser infravermelho. Cada abordagem tem suas vantagens e desvantagens. O MST sem rótulos pode usar proteínas nativas não cometas; no entanto, muitos analitos, incluindo farmacêuticos, fluoresce na faixa UV, que podem interferir com a determinação de valores de KD precisos. Em comparação, o MST rotulado permite uma maior diversidade de interações paridas mensuráveis utilizando sondas fluorescentes rotuladas ligadas a ligantes com absorções mensuráveis na faixa visível em oposição à UV, limitando o potencial de interferência de sinais de analitos.

Esta é uma saída amostral usando a análise de afinidade. O MST rotulado foi usado para determinar a constante de ligação do Vam7-His8 ao dioctanoyl solúvel (DiC8) PA de um de seus substratos naturais9. A Figura 1 apresenta os traços termoforéticos de um ensaio de uma titulação de 1:1 de DiC8 PA a partir de 500 μM contra 50 nM de Vam7-His8. Fluorescência inicial (tempo antes do laser infravermelho ligado), Tjump (tempo inicialmente após o laser infravermel...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions at JoVE.com

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

A termoforese de microescala obtém constantes de ligação rapidamente a baixo custo de material. A termoforese de microescala rotulada ou sem rótulo está comercialmente disponível; no entanto, a termoforese livre de rótulos não é capaz da diversidade de medidas de interação que podem ser realizadas usando rótulos fluorescentes. Fornecemos um protocolo para medições de termoforese rotuladas.

Uso de Termoforese microescala para medir interações proteína-lipídicas

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

A termoforese de microescala rotulada obtém constantes de dissociação, ou KDs, de diversas interações bioquímicas de forma eficiente. Este protocolo e o vídeo acompanhado dão a afinidade aproximada por Vam7, a única proteína snare solúvel na levedura, ao ácido fosfídico. Esta é a maneira que Vam7 associa com duas membranas antes de interagir com outras proteínas.Este método obtém KDs rapidamente para diversas interações bioquímicas a baixo custo, com alta reprodutibilidade e com custo mínimo de proteína. Esta técnica é adequada para o desenvolvimento farmacêutico de primeiro estágio, permitindo que KDs facilmente obtidos determinem potenciais compostos de chumbo. Antes de iniciar uma análise, ligue o interruptor de alimentação na parte de trás do dispositivo MST e abra o software de controle.Confirme se o computador está conectado ao dispositivo e ao status conectado e defina o MST antes de 3 segundos, o MST para 30 segundos e a Recuperação de Fluorescência para depois de 1 segundo. Para cada tubo capilar, digite o nome do ligante alvo, o nome do ligante analito, a concentração do alvo e a maior concentração de titulação usando a razão de titulação de preenchimento automático. Selecione uma gama de poderes MST e digite valores para cada potência para testar o ajuste de ligação mais robusto.Para preparar amostras rotuladas de MST, diluir uma solução de Vam7-octahistidina para uma concentração de 200 nanomolares e um corante NTA-Atto 647 para 100 de concentração de nanomolar, ambos em PBS. Misture o Vam7-octahistidina e o corante NTA-Atto 647 a uma proporção volumosa de 1:1 e deixe a mistura sentar-se à temperatura ambiente protegida da luz por 30 minutos. Ao final da incubação, centrifufique a mistura de corante e proteína e armazene a solução a 4 graus Celsius por até algumas horas antes do uso.Em seguida, prepare a amostra, pegue o ligante tingido e exponha o analito. Para termoforese de microescala da amostra, abra o dispositivo e deslize o rack capilar para fora. Coloque os capilares de amostra no rack com a maior concentração na posição um e selecione o canal Vermelho no software de controle.Em seguida, carregue o rack no instrumento. Em seguida, selecione uma faixa de potência MST e inicie a medição do Cap Scan MST e avalie a resposta de mudança. Traços termoforéticos de um teste de uma titulação de 1:1 de DiC8 PA a partir de 500 micromoles contra 50 nanomolar NTA-Atto 647 rotulado domínio Vam7 são mostrados aqui.A fluorescência inicial, o salto de tempo e a termoforese podem ser observados, permitindo que o KD seja calculado a partir de qualquer uma ou uma combinação dessas medidas. Uma curva de saturação pode ser traçada a partir desses resultados, por exemplo, para a termoforese com a saída de salto de tempo, como ilustrado no gráfico. Geralmente, os resultados do MST são determinados por meio da escala de log, levando em conta a concentração de proteínas para determinar a afinidade vinculante selecionando o modelo KD e inserindo a concentração de proteínas.Ao executar este protocolo, certifique-se de que a solução está no centro do capilar e que não há bolhas de ar e que o capilar não tenha poeira ou solução na parte externa do capilar. A calorimetria de titulação isotérmica ou ressonância plasmon superficial poderia ser usada para validar o KD experimental obtido. Se houver potencial vinculação cooperativa, o ITC seria o próximo método lógico realizado, dado os recursos.Essa técnica permitiu que pesquisadores tradicionais de biologia incorporassem técnicas de triagem biofísica em suas pesquisas para determinar relações de caminho. Um exemplo dessa técnica é a lise celular com a proteína alvo expressa endógena, onde a tag GFP é uma nova maneira de realizar um ensaio tradicional de puxar para baixo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Bioquímica

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Mapear o sítio de ligação de um Aptamer no ATP Usando MicroScale termoforese

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Imunofluorescência quantitativa a medida Global localizadas Tradução

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Peptídeos biotinylated célula-penetrante para estudar interações da proteína-proteína intracelular

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Interações de proteínas globulares e filamentosas por espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (NMR) e Thermophoresis de microescala (MST) de medição

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Espectroscopia de absorvância atômica para medir piscinas de zinco intracelular em células de mamíferos

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Uso do elemento Alu contendo Minigenes para analisar RNAs circulares

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Ensaio nãoradioativo para medir a fosforilação de polinucleotídeos de substratos de pequenos nucleotídeos

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Espectroscopia de CD para estudar interações DNA-proteína

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Ensaio de Sedimentação à Base de Concanavalina A para Medir a Ligação ao Substrato de Fosfatases Glucanas

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...