Name: use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions
Uploaded: 2022-02-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантом Национального научного фонда (MCB 1818310) RAF. Эта работа была частично поддержана Центром химической биологии ядра / Отделом кристаллографии белка в Онкологическом центре Х. Ли Моффитта (NIH / NCI: P30-CA076292).

1. Подготовка материалов
<ol><li>Приготовьте фосфатный буферный физиологический раствор (PBS): 137 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ NaH2PO4 и 2 мМ KH2PO4, рН 7,41.</li>
	<li>Готовят краситель NTA-Atto 647 N. Разбавляйте раствор NTA-Atto 647 N до 100 нМ из 100% раствора ДМСО в PBS без анимации движения.</li>
...

<ol>
	<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroScale+Thermophoresis:+Interaction+analysis+and+beyond.">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li><li>Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, n. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+proteins+without+primary+sequence+tryptophan+residues:+mutant+trp+repressors+with+aliphatic+substitutions+for+tryptophan+side+chains.">Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains.</a> Gene. 163 (1), 1-11 (1995).</li><li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity.">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis.">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100 (2010).</li><li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis.">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding.">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li><li>Starr, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+induces+conformational+changes+in+Sec18+protomers+that+prevent+SNARE+priming.">Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).</li><li>Miner, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Central+Polybasic+Region+of+the+Soluble+SNARE+(Soluble+N-Ethylmaleimide-sensitive+Factor+Attachment+Protein+Receptor)+Vam7+Affects+Binding+to+Phosphatidylinositol+3-Phosphate+by+the+PX+(Phox+Homology)+Domain.">The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+phosphoinositide+partitioning+into+plasma+membrane+models.">Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models.</a> Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).</li><li>Zhao, H., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+guide+to+biochemical+approaches+for+analyzing+protein-lipid+interactions.">A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).</li><li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+proteins:+virulence+factors+of+intracellular+disease+agents.">Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents.</a> Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).</li><li>le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents.">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).</li><li>Corradi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Diversity+in+Lipid-Protein+Interactions.">Emerging Diversity in Lipid-Protein Interactions.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 5775-5848 (2019).</li><li>Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Microscale+Thermophoresis+to+Characterize+Hits+from+High-Throughput+Screening:+A+European+Lead+Factory+Perspective.">Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective.</a> SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).</li><li>Sparks, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+competitive+inhibitor+of+phosphatidic+acid+binding+by+the+AAA++protein+NSF/Sec18+blocks+the+SNARE-priming+stage+of+vacuole+fusion.">A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).</li></ol>

Определение привязки Vam7-His8 к DiC8-PA обеспечило надежный установленный KD для данного взаимодействия, который несколько ниже сродства, чем измеренный KD липосом Vam7-His8 к PA (неопубликованный). Это различие, скорее всего, связано с отсутствием мембраны, что обычно...

Микромасштабный термофорез является относительно новым методом определения констант диссоциации (KD), а также констант ингибирования (IC50) между биохимически значимыми лигандами. Ведущий коммерческий ритейлер MST (например, NanoTemper) предлагает две популярные технологии MST: 1) MST без маркировки, требующей флуоресцентной метки, и 2) меченый термофорез с использованием присущей флуоресценции белков в зависимости от количества ароматических остатков, присутствующих в каждом белке1. Недостатком термофореза без меток является то, что в большинстве случаев он не позволяет измерить белково-белковые взаимодействия. Тем не менее, может быть возможно спроектировать белки без ароматических аминокислот, таких как триптофан, для использования в термофорезе без меток2.
MST измеряет движение частиц в ответ на индукцию микроскопических температурных полей, инициированных инфракрасным лазером в доступных в настоящее время технологиях1. MST может быть использован для измерения белково-белковых взаимодействий, белково-липидных взаимодействий, белково-малых молекул, экспериментов с конкуренцией и даже взаимодействий между малыми молекулами, если можно произвести достаточное разделение сигналов. Кроме того, MST позволяет измерять взаимодействия на основе мембранных белков, встроенные либо в липосомы, либо в нанодиски. Меченый термофорез использует преимущества использования флуоресцентно меченых меток, позволяющих химически контролируемое разделение сигнала между лигандом и анализируемым веществом. Значения KD могут быть получены с помощью термофореза для взаимодействий, включающих связывание белка при низких наномолярных концентрациях, что в большинстве случаев является гораздо более низкой концентрацией белка, чем то, что требуется для изотермической калориметрии (ITC)3. Кроме того, MST не имеет строгих требований к буферизации, как это требуется для поверхностного плазмонного резонанса (SPR)4, и меченый термофорез может даже использоваться для измерения констант связывания интересующих белков из неполно очищенных белковых растворов5 с генетически вставленными флуоресцентными метками6. Недостатком MST является то, что кинетические параметры не могут быть легко получены для MST, как в SPR2.
Измерения термофореза зависят от локальной разницы температур раствора. Это тепло может генерироваться инфракрасным лазером. Устройство MST имеет флуоресцентный детектор, соединенный с инфракрасным (ИК) лучом, и может улавливать изменения флуоресценции от локальных изменений концентрации флуоресцентных молекул в точке, куда нацелен ИК-лазер. Устройство MST использует ИК-направленный лазер, связанный непосредственно с флуоресцентным детектором, сфокусированным в той же точке, в которой тепло генерируется в растворе. Это позволяет надежно обнаруживать изменения температуры, соответствующие истощению молекул в точке тепла, генерируемого ИК-лазером. Измеренная флуоресценция обычно уменьшается ближе к ИК-лазеру в ответ на повышение температуры. Различия, измеренные в результате, могут быть обусловлены несколькими факторами, включая заряд, размер или энтропию сольватации. Эти различия измеряются как изменения флуоресценции в ответ на индукцию тепла или движение молекул из горячих в более холодные части капилляра.
При загрузке капилляра данным раствором важно оставлять воздух на обоих концах капилляра и не нагружать капилляр полностью. Коммерческий капилляр содержит около 10 мкл раствора. Можно достичь точных измерений с 5 мкл раствора до тех пор, пока раствор манипулируется к центру капилляра, нет пузырьков воздуха (потенциально дегаз перед загрузкой капилляра), и кто-то осторожно загружает стойку, чтобы не толкать раствор из центра капилляра, куда нацелен инфракрасный лазер. Если лазер не вступает в полный контакт с раствором, результатом, скорее всего, будет один из трех непригодных для использования выходов для этой концентрации: 1) обнаружение отсутствия или низкой флуоресценции, 2) обнаружение более высокой флуоресценции (потенциально с зубчатым пиком) или 3) обнаружение флуоресценции в пределах других значений от заданного титрования, но с зубчатым и неокругленным пиком.
Для маркированного термофореза оптимально иметь флуоресцентный сигнал выше 200 и ниже 2000 единиц флуоресценции7. Устройство MST использует диапазон интенсивности светодиодов от 0 до 100, которые могут быть выбраны для достижения сигнала выше 200 или ниже 2000. Альтернативно, можно использовать различные концентрации меченого лиганда для модификации флуоресцентного сигнала до оптимального уровня. При анализе данных важно запускать сканирование колпачка с заданным измерением MST в качестве эталона, так как сканирование плохого колпачка часто может привести к точке, которая впоследствии может быть определена как выброс. Каждый запуск должен занимать около 30 минут при измерении одной мощности MST с помощью сканирования колпачка. Коммерческие устройства позволяют изменять мощность MST. В старых версиях программного обеспечения это может быть установлено от 0 до 100; а в более поздних версиях можно выбрать низкий, средний или высокий MST. Чтобы достичь надежных следов, исследователю может потребоваться попробовать каждый из них и решить, какая настройка MST приводит к наиболее надежным данным для данного взаимодействия.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>For protein labeleing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prsim</td>
			<td>Graphpad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-K022</td>
			<td>Capillaries for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 machine</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td></td>
			<td>University equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-Atto 647 N</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2175</td>
			<td>label for His tags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3008</td>
			<td>Lipid for binding experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions

Способность определять сродство связывания липидов с белками является неотъемлемой частью понимания белково-липидных взаимодействий в мембранном трафике, сигнальной трансдукции и цитоскелетном ремоделировании. Классические инструменты для измерения таких взаимодействий включают поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и изотермическую титрационную калориметрию (ITC). Несмотря на то, что эти подходы являются мощными инструментами, они имеют недостатки. ITC требует большого количества очищенного белка, а также липидов, которые могут быть дорогостоящими и трудными в производстве. Кроме того, ЦМТ, а также ОСП отнимают очень много времени, что может значительно увеличить стоимость проведения этих экспериментов. Одним из способов обойти эти ограничения является использование относительно новой техники микромасштабного термофореза (MST). MST является быстрым и экономически эффективным с использованием небольших количеств образца для получения кривой насыщения для данного события связывания. В настоящее время существует два типа систем MST. Один тип MST требует маркировки флуорофором в синем или красном спектре. Вторая система опирается на внутреннюю флуоресценцию ароматических аминокислот в УФ-диапазоне. Обе системы обнаруживают движение молекул в ответ на локализованную индукцию тепла от инфракрасного лазера. Каждый подход имеет свои преимущества и недостатки. MST без меток может использовать непомеченные нативные белки; однако многие аналиты, включая фармацевтические препараты, флуоресцируют в УФ-диапазоне, что может мешать определению точных значений КД. Для сравнения, меченый MST обеспечивает большее разнообразие измеримых парных взаимодействий с использованием флуоресцентно меченых зондов, прикрепленных к лигандам с измеримыми поглощениями в видимом диапазоне, в отличие от ультрафиолета, ограничивая потенциал для мешающих сигналов от аналитов.

Это пример выходных данных с использованием аффинити-анализа. Меченый MST использовался для определения константы связывания Vam7-His8 с растворимым диоктаноилом (DiC8) PA одного из его природных субстратов9. На рисунке 1 представлены термофоретические следы одног...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions at JoVE.com

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Микромасштабный термофорез быстро получает константы связывания при низких материальных затратах. Микромасштабный термофорез без маркировки или этикетки коммерчески доступен; однако термофорез без меток не способен к разнообразию измерений взаимодействия, которые могут быть выполнены с использованием флуоресцентных этикеток. Мы предоставляем протокол для маркировки измерений термофореза.

Использование микромасштабного термофореза для измерения белково-липидных взаимодействий

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Меченый микромасштабный термофорез эффективно получает константы диссоциации, или KD, различных биохимических взаимодействий. Этот протокол и сопровождаемое видео дают приблизительное сродство К Vam7, единственному растворимому белку SNARE в дрожжах, к фосфатидной кислоте. Это способ, которым Vam7 связывается с двумя мембранами перед взаимодействием с другими белками.Этот метод быстро получает KD для различных биохимических взаимодействий при низких затратах, с высокой воспроизводимостью и с минимальными затратами на белок. Этот метод подходит для первой стадии фармацевтической разработки, что позволяет легко получить KD для определения потенциальных соединений свинца. Перед началом анализа включите выключатель питания на задней панели устройства MST и откройте управляющее программное обеспечение.Убедитесь, что компьютер подключен к устройству и находится в состоянии подключения, и установите для параметра MST Before значение 3 секунды, для MST — значение 30 секунд, а для параметра Восстановление флуоресценции — значение через 1 секунду. Для каждой капиллярной трубки введите название целевого лиганда, название анализируемого лиганда, концентрацию мишени и самую высокую концентрацию титрования с использованием коэффициента титрования автозаполнения. Выберите диапазон степеней MST и введите значения для каждого питания, чтобы проверить наиболее надежную посадку привязки.Чтобы подготовить меченые образцы MST, разбавьте раствор Vam7-октагистидина до концентрации 200 наномоляров и краситель NTA-Atto 647 до 100 наномолярной концентрации, оба в PBS. Смешайте Vam7-октагистидин и краситель NTA-Atto 647 в объемном соотношении 1:1 и дайте смеси постоять при комнатной температуре, защищенной от света, в течение 30 минут. В конце инкубации центрифугируют смесь красителя и белка и хранят раствор при 4 градусах Цельсия в течение нескольких часов перед использованием.Затем подготовьте образец, возьмите окрашенный лиганд и подвергните анализируемому веществу. Для микромасштабного термофореза образца откройте устройство и выдвиньте капиллярную стойку наружу. Загрузите капилляры образца в стойку с наибольшей концентрацией в первом положении и выберите красный канал в управляющем программном обеспечении.Затем загрузите стойку в инструмент. Затем выберите диапазон мощности MST и запустите измерение Cap Scan MST и оцените реакцию сдвига. Здесь показаны термофоретические следы одного испытания титрования DiC8 PA 1:1, начиная с 500 микромолей против 50 наномоляров NTA-Atto 647, меченых доменом Vam7.Можно наблюдать начальную флуоресценцию, скачок во времени и термофорез, что позволяет рассчитать KD из любого одного или комбинации этих измерений. Кривая насыщения может быть построена на основе этих результатов, например, для термофореза с выходом временного скачка, как показано на графике. Как правило, результаты MST определяются с использованием логарифмической шкалы, принимая во внимание концентрацию белка для определения сродства связывания путем выбора модели KD и ввода концентрации белка.При выполнении этого протокола убедитесь, что раствор находится в центре капилляра и что нет пузырьков воздуха и что капилляр не имеет пыли или раствора на внешней стороне капилляра. Изотермическая титрующая калориметрия или поверхностный плазмонный резонанс могут быть использованы для проверки полученного экспериментального KD. Если существует потенциальная совместная привязка, то следующим логическим методом, используемым с учетом ресурсов, будет МТЦ.Этот метод позволил традиционным исследователям биологии включить методы биофизического скрининга в свои исследования для определения взаимосвязей путей. Одним из примеров этого метода является клеточная лизаза с целевым белком, экспрессируемым эндогенно, где метка GFP является новым способом выполнения традиционного анализа.

use-of-microscale-thermophoresis-to-measure-protein-lipid-interactions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Картирование участок связывания аптамер на АТФ Использование Microscale Термофорез

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

Количественные иммунофлюоресценции для измерения глобального локализованный перевод

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Биотинилированным клеток-проникая пептиды для изучения внутриклеточный белок белковых взаимодействий

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Измерения взаимодействий шаровых и волокнистых белков спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и микромасштабной Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

Атомная спектроскопия поглощения для измерения внутриклеточного цинка бассейны в клетках млекопитающих

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an upstream 3&#39; splice site within a pre-mRNA, a process called back-splicing. This circularization is likely aided by secondary structures in the pre-mRNA that bring the splice sites into close proximity. In human genes, Alu elements are thought to promote these secondary RNA structures, as Alu elements are abundant and exhibit base complementarities with each other when present in opposite directions in the pre-mRNA. Here, we describe the generation and analysis of large, Alu element containing reporter genes that form circular RNAs. Through optimization of cloning protocols, reporter genes with up to 20 kb insert length can be generated. Their analysis in co-transfection experiments allows the identification of regulatory factors. Thus, this method can identify RNA sequences and cellular components involved in circular RNA formation.

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

We clone and analyze reporter genes generating circular RNAs. These reporter genes are larger than constructs to analyze linear splicing and contain Alu elements. To investigate the circular RNAs, the constructs are transfected into cells and resulting RNA is analyzed using RT-PCR after removal of linear RNA.

Использование элемента Alu, содержащего минигены, для анализа циркулярных РНК

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

Нерадиоактивный анализ для измерения полинуклеотида фосфорилирования малых нуклеотидных субстратов

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent advancements in CD spectroscopy have enabled the study of DNA-protein interactions and conformational dynamics of DNA in different microenvironments in detail for a better understanding of transcriptional regulation in vivo. The area around a potential transcription zone needs to be unwound for transcription to occur. This is a complex process requiring the coordination of histone modifications, binding of the transcription factor to DNA, and other chromatin remodeling activities. Using CD spectroscopy, it is possible to study conformational changes in the promoter region caused by regulatory proteins, such as ATP-dependent chromatin remodelers, to promote transcription. The conformational changes occurring in the protein can also be monitored. In addition, queries regarding the affinity of the protein towards its target DNA and sequence specificity can be addressed by incorporating mutations in the target DNA. In short, the unique understanding of this sensitive and inexpensive method can predict changes in chromatin dynamics, thereby improving the understanding of transcriptional regulation.

The interaction of an ATP-dependent chromatin remodeler with a DNA ligand is described using CD spectroscopy. The induced conformational changes on a gene promoter analyzed by the peaks generated can be used to understand the mechanism of transcriptional regulation.

CD-спектроскопия для изучения взаимодействий ДНК и белка

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

Седиментационный анализ на основе конканавалина А для измерения связывания субстрата глюканфосфатаз

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Трассировка стабильных изотопов и анализ LC-MS для измерения активности DHODH и SDH

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

В центре внимания автора: Кислородно-независимые анализы для измерения функции митохондрий у млекопитающих  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

Кислородно-независимые анализы для измерения функции митохондрий у млекопитающих

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...