Name: use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions
Uploaded: 2022-02-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions at JoVE.com

Denna forskning stöddes av ett bidrag från National Science Foundation (MCB 1818310) till RAF. Detta arbete stöddes delvis av Chemical Biology Core Facility/Protein Crystallography Unit vid H. Lee Moffitt Cancer Center (NIH/NCI: P30-CA076292).

1. Beredning av material
<ol><li>Förbered fosfatbuffrad saltlösning (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 och 2 mM KH2PO4, pH 7,41.</li>
	<li>Förbered NTA-Atto 647 N färgämne. Späd beståndet NTA-Atto 647 N färgämne till 100 nM från en 100% DMSO-lösning till PBS utan interpolering.</li>
	<li>Express Vam7-His8 – Protein som fusionsprotein i E. coli och rena med Ni-NTA och storleksuteslutningskromatografi8.<...

<ol>
	<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroScale+Thermophoresis:+Interaction+analysis+and+beyond.">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li><li>Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, n. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+proteins+without+primary+sequence+tryptophan+residues:+mutant+trp+repressors+with+aliphatic+substitutions+for+tryptophan+side+chains.">Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains.</a> Gene. 163 (1), 1-11 (1995).</li><li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity.">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis.">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100 (2010).</li><li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis.">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding.">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li><li>Starr, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+induces+conformational+changes+in+Sec18+protomers+that+prevent+SNARE+priming.">Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).</li><li>Miner, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Central+Polybasic+Region+of+the+Soluble+SNARE+(Soluble+N-Ethylmaleimide-sensitive+Factor+Attachment+Protein+Receptor)+Vam7+Affects+Binding+to+Phosphatidylinositol+3-Phosphate+by+the+PX+(Phox+Homology)+Domain.">The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+phosphoinositide+partitioning+into+plasma+membrane+models.">Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models.</a> Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).</li><li>Zhao, H., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+guide+to+biochemical+approaches+for+analyzing+protein-lipid+interactions.">A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).</li><li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+proteins:+virulence+factors+of+intracellular+disease+agents.">Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents.</a> Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).</li><li>le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents.">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).</li><li>Corradi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Diversity+in+Lipid-Protein+Interactions.">Emerging Diversity in Lipid-Protein Interactions.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 5775-5848 (2019).</li><li>Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Microscale+Thermophoresis+to+Characterize+Hits+from+High-Throughput+Screening:+A+European+Lead+Factory+Perspective.">Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective.</a> SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).</li><li>Sparks, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+competitive+inhibitor+of+phosphatidic+acid+binding+by+the+AAA++protein+NSF/Sec18+blocks+the+SNARE-priming+stage+of+vacuole+fusion.">A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).</li></ol>

Bestämningen av Vam7-His8binding till DiC8-PA gav en robust monterad KD för den givna interaktionen, vilket är något lägre affinitet än den uppmätta KD av Vam7-His8 till PA liposomer (opublicerade). Denna skillnad beror sannolikt på bristen på ett membran, vilket i allmänhet resulterar i lägre affinitet för membranspecifika lipidbindningsinteraktioner och visar därför rollen för liposommembranställningen till denna interaktion11</...

Mikroskala termofores är en relativt ny teknik för att bestämma disassociation konstanter (KD) samt hämningskonstanter (IC50) mellan biokemiskt relevanta ligands. Den ledande kommersiella återförsäljaren för MST (t.ex. NanoTemper) erbjuder två populära MST-tekniker: 1) Etikettfri MST som kräver en fluorescerande tagg och 2) märkt termofores med hjälp av den inneboende fluorescensen av proteiner beroende på antalet aromatiska rester som finns i varje protein1. En nackdel med etikettfri termofores är att det i de flesta fall inte tillåter mätning av protein-proteininteraktioner. Det kan dock vara möjligt att konstruera proteiner utan aromatiska aminosyror såsom tryptofan för användning i etikettfri termofores2.
MST mäter partiklarnas rörelse som svar på induktion av mikroskopiska temperaturfält som initierats av en infraröd laser i den teknik som för närvarande finns tillgänglig1. MST kan användas för att mäta protein-proteininteraktioner, protein-lipidinteraktioner, protein-liten molekyl, tävlingsexperiment och till och med interaktioner mellan småmolekyler så länge man kan producera tillräckligt med signalseparation. Dessutom möjliggör MST mätning av membran-proteinbaserade interaktioner inbäddade i antingen liposomer eller nanodiscs. Märkt termofores utnyttjar användningen av fluorescerande märkta taggar som möjliggör kemiskt kontrollerbar separation av signal mellan ligand och analyt. KD-värden kan erhållas med termofores för interaktioner som involverar proteinbindning vid låga nanomolära koncentrationer, vilket i de flesta fall är en mycket lägre koncentration av protein än vad som krävs för isotermisk kalorimetri (ITC)3. Mst har inte heller strikta buffringskrav som krävs för ytplasmonresonans (SPR)4 och märkt termofores kan till och med användas för att mäta bindningskonstanter av proteiner av intresse från icke-helt renade proteinlösningar5 med genetiskt insatta fluorescerande taggar6. En nackdel med MST är att kinetiska parametrar inte lätt kan erhållas för MST som i SPR2.
Termoforesmätningar beror på den lokala temperaturskillnaden för en lösning. Denna värme kan genereras från en infraröd laser. MST-enheten har en fluorescensdetektor kopplad till en infraröd (IR) stråle och kan fånga upp förändringar i fluorescens från lokala koncentrationsförändringar av fluorescerande molekyler vid den punkt där IR-lasern är riktad. MST-enheten använder en IR-riktad laser kopplad direkt till en fluorescensdetektor fokuserad vid samma punkt där värmen genereras i lösningen. Detta möjliggör robust detektion av temperaturförändringar som motsvarar utarmningen av molekyler vid värmepunkten som genereras av IR-lasern. Uppmätt fluorescens minskar i allmänhet närmare IR-lasern som svar på temperaturökningar. De skillnader som mäts som ett resultat kan bero på flera faktorer inklusive laddning, storlek eller solvation entropi. Dessa skillnader mäts som förändringar i fluorescens som svar på induktion av värme eller rörelse av molekyler från varma till kallare delar av kapillären.
Vid lastning av en kapillär med en given lösning är det viktigt att lämna luft i vardera änden av kapillären och inte ladda kapillären helt full. Den kommersiella kapillären rymmer ca 10 μL lösning. Man kan uppnå exakta mätningar med 5 μL lösning så länge lösningen manipuleras till mitten av kapillären, det finns inga luftbubblor (potentiellt avgas innan man laddar kapillär), och man är noga med att ladda racket för att inte jostle lösningen från mitten av kapillären, där den infraröda lasern är riktad. Om lasern inte kommer i full kontakt med lösningen kommer resultatet sannolikt att bli en av tre oanvändbara utgångar för den koncentrationen: 1) ingen eller låg fluorescensdetektering, 2) högre fluorescensdetektering (eventuellt med ojämn topp) eller 3) fluorescensdetektering inom andra värden från given titrering, men med en ojämn och oavslutad topp.
För märkt termofores är det optimalt att ha en fluorescenssignal över 200 och under 2000 fluorescensenheter7. MST-enheten använder en rad LED-intensiteter från 0 till 100, som kan väljas för att uppnå en signal över 200 eller under 2000. Alternativt kan man använda olika koncentrationer av den märkta liganden för att modifiera fluorescenssignalen till en optimal nivå. Det är viktigt att köra en cap-skanning med en viss MST-mätning som referens när du analyserar data, eftersom en dålig cap-skanning ofta kan resultera i en punkt som senare kan bestämmas vara en avvikande. Varje körning bör ta cirka 30 min om du mäter en enda MST-effekt med en cap-skanning. De kommersiella enheterna tillåter ändringar i MST-ström. I äldre programvaruversioner kan detta ställas in från 0 till 100; och i senare versioner kan man välja låg, medelhög eller hög MST. För att uppnå robusta spår kan en forskare behöva prova var och en av dessa och bestämma vilken MST-inställning som resulterar i de mest robusta data för en viss interaktion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>For protein labeleing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prsim</td>
			<td>Graphpad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-K022</td>
			<td>Capillaries for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 machine</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td></td>
			<td>University equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-Atto 647 N</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2175</td>
			<td>label for His tags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3008</td>
			<td>Lipid for binding experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions

Förmågan att bestämma lipidernas bindningstillhörighet till proteiner är en viktig del av förståelsen av protein-lipidinteraktioner i membranhandel, signaltransduktion och cytoskeletal ombyggnad. Klassiska verktyg för att mäta sådana interaktioner inkluderar ytplasmonresonans (SPR) och isoterm titreringskalkorimetri (ITC). Även om de är kraftfulla verktyg har dessa tillvägagångssätt bakslag. ITC kräver stora mängder renat protein samt lipider, vilket kan vara kostsamt och svårt att producera. Dessutom är ITC och SPR mycket tidskrävande, vilket kan öka kostnaden för att utföra dessa experiment avsevärt. Ett sätt att kringgå dessa begränsningar är att använda den relativt nya tekniken för mikroskala termofores (MST). MST är snabbt och kostnadseffektivt med små mängder prov för att erhålla en mättnadskurva för en given bindningshändelse. Det finns för närvarande två typer av MST-system tillgängliga. En typ av MST kräver märkning med fluorofor i det blå eller röda spektrumet. Det andra systemet förlitar sig på den inneboende fluorescensen hos aromatiska aminosyror i UV-området. Båda systemen detekterar molekylers rörelse som svar på lokaliserad induktion av värme från en infraröd laser. Varje tillvägagångssätt har sina fördelar och nackdelar. Etikettfri MST kan använda otaggade inhemska proteiner; emellertid, många analyter, inklusive läkemedel, fluoresce i UV-området, vilket kan störa bestämning av exakta KD värden. I jämförelse möjliggör märkt MST en större mångfald av mätbara parvis interaktioner med fluorescerande märkta sonder fästa vid ligands med mätbara absorbanser i det synliga intervallet i motsats till UV, vilket begränsar risken för störande signaler från analyter.

Det här är ett exempelutdata som använder tillhörighetsanalysen. Den märkta MST användes för att bestämma bindkonstanten av Vam7-His8 till den lösliga dioctanoyl (DiC8) PA för ett av dess naturliga substrat9. Figur 1 presenterar de termofetiska spåren från en studie av en 1:1 titrering av DiC8 PA från 500 μM mot 50 nM Vam7-His8. Initial fluorescens (tid innan infraröd laser slogs på), Tjump (tid initialt efter infraröd laser påslagen) och termofores ...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions at JoVE.com

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Mikroskala termofores erhåller bindande konstanter snabbt till låg materialkostnad. Antingen märkt eller etikettfri termofores i mikroskala är kommersiellt tillgänglig; Etikettfri termofores kan dock inte mångfald av interaktionsmätningar som kan utföras med fluorescerande etiketter. Vi tillhandahåller ett protokoll för märkta termoforesmätningar.

Användning av mikroskala termofores för att mäta protein-lipidinteraktioner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Märkt mikroskala termofores erhåller disassociation konstanter, eller KDs, av olika biokemiska interaktioner effektivt. Detta protokoll och den medföljande videon ger den ungefärliga affiniteten för Vam7, det enda lösliga SNARE-proteinet i jäst, till fosfatidsyra. Så här associerar Vam7 med två membran innan de interagerar med andra proteiner.Denna metod erhåller KDs snabbt för olika biokemiska interaktioner till låg kostnad, med hög reproducerbarhet och med minimal proteinkostnad. Denna teknik är lämplig för första etappen farmaceutisk utveckling, vilket möjliggör lätt att erhålla KDs för att bestämma potentiella blyföreningar. Innan du påbörjar en analys slår du på strömbrytaren på baksidan av MST-enheten och öppnar kontrollprogramvaran.Bekräfta att datorn är ansluten till enheten och i ansluten status och ställ in MST Före på 3 sekunder, MST till 30 sekunder och Fluorescence Recovery till efter 1 sekund. För varje kapillärrör anger du namnet på målligan, namnet på ligand analyten, koncentrationen av målet och den högsta titreringskoncentrationen med hjälp av autofyllitriteringsförhållandet. Välj en rad MST-krafter och ange värden för varje effekt som ska testas för den mest robusta bindningspassningen.För att förbereda märkta MST-prover, späd en Vam7-oktahistidinlösning till en koncentration på 200 nanomolar och ett NTA-Atto 647-färgämne till 100 nanomolarkoncentration, båda i PBS. Blanda vam7-oktahistidin och färgämnet NTA-Atto 647 med ett volymetriskt förhållande på 1:1 och låt blandningen sitta i rumstemperatur skyddad från ljus i 30 minuter. I slutet av inkubationen, centrifugera färgämnet och proteinblandningen och förvara lösningen vid 4 grader Celsius i upp till några timmar före användning.Förbered sedan provet, ta färgad ligand och exponera analyten. För mikroskala termofores av provet, öppna enheten och skjut ut kapillärstället. Ladda provkapillärerna i racket med den högsta koncentrationen i position ett och välj den röda kanalen i kontrollprogramvaran.Ladda sedan racket i instrumentet. Välj sedan ett intervall av MST-effekt och starta Cap Scan MST-mätningen och utvärdera skiftsvaret. Termoforiska spår från en studie av en 1:1 titrering av DiC8 PA från 500 mikromol mot 50 nanomolar NTA-Atto 647 märkt Vam7 domän visas här.Den första fluorescensen, tidshoppet och termoforesen kan observeras, vilket gör att KD kan beräknas från någon eller en kombination av dessa mätningar. En mättnadskurva kan ritas från dessa resultat, till exempel för termoforesen med tidshoppsutgången, som illustreras i diagrammet. I allmänhet bestäms MST-resultaten med hjälp av loggskala, med hänsyn till proteinkoncentrationen för att bestämma bindningstillhörigheten genom att välja KD-modellen och mata in proteinkoncentrationen.När du utför detta protokoll, se till att lösningen är i mitten av kapillären och att det inte finns några luftbubblor och att kapillären inte har damm eller lösning på utsidan av kapillären. Isothermal titrering kalorimetri eller ytan plasmon resonans kan användas för att validera den experimentella KD erhålls. Om det finns en potentiell samarbetsbindning skulle ITC vara nästa logiska metod som utförs, medgivna resurser.Denna teknik har gjort det möjligt för traditionella biologiforskare att införliva biofysiska screeningtekniker i sin forskning för att bestämma vägrelationer. Ett exempel på denna teknik är celllysta med målproteinet uttryckt endogent, där GFP-taggen är ett nytt sätt att utföra en traditionell pull-down-analys.

use-of-microscale-thermophoresis-to-measure-protein-lipid-interactions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Kartläggning av bindningsstället för en aptamer på ATP Använda Micro Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

Kvantitativa immunofluorescens åtgärd globala lokaliserad Översättning

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Biotinylerade Cell-penetrerande peptider att studera intracellulära Protein-protein interaktioner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Mäta interaktion av klotformig och fintrådiga proteiner av kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR) och hur provtagningsutrustningen skall Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

Atomabsorptionsspektroskopi för att mäta intracellulära Zinkpooler i däggdjurs celler

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an upstream 3&#39; splice site within a pre-mRNA, a process called back-splicing. This circularization is likely aided by secondary structures in the pre-mRNA that bring the splice sites into close proximity. In human genes, Alu elements are thought to promote these secondary RNA structures, as Alu elements are abundant and exhibit base complementarities with each other when present in opposite directions in the pre-mRNA. Here, we describe the generation and analysis of large, Alu element containing reporter genes that form circular RNAs. Through optimization of cloning protocols, reporter genes with up to 20 kb insert length can be generated. Their analysis in co-transfection experiments allows the identification of regulatory factors. Thus, this method can identify RNA sequences and cellular components involved in circular RNA formation.

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

We clone and analyze reporter genes generating circular RNAs. These reporter genes are larger than constructs to analyze linear splicing and contain Alu elements. To investigate the circular RNAs, the constructs are transfected into cells and resulting RNA is analyzed using RT-PCR after removal of linear RNA.

Användning av Alu Element som innehåller Minigenes för att analysera cirkulära RNA

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

Nonradioactive Analys för att mäta Polynukleotid Fosforylering av små Nukleotid Substrat

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent advancements in CD spectroscopy have enabled the study of DNA-protein interactions and conformational dynamics of DNA in different microenvironments in detail for a better understanding of transcriptional regulation in vivo. The area around a potential transcription zone needs to be unwound for transcription to occur. This is a complex process requiring the coordination of histone modifications, binding of the transcription factor to DNA, and other chromatin remodeling activities. Using CD spectroscopy, it is possible to study conformational changes in the promoter region caused by regulatory proteins, such as ATP-dependent chromatin remodelers, to promote transcription. The conformational changes occurring in the protein can also be monitored. In addition, queries regarding the affinity of the protein towards its target DNA and sequence specificity can be addressed by incorporating mutations in the target DNA. In short, the unique understanding of this sensitive and inexpensive method can predict changes in chromatin dynamics, thereby improving the understanding of transcriptional regulation.

The interaction of an ATP-dependent chromatin remodeler with a DNA ligand is described using CD spectroscopy. The induced conformational changes on a gene promoter analyzed by the peaks generated can be used to understand the mechanism of transcriptional regulation.

CD-spektroskopi för att studera DNA-proteininteraktioner

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

Concanavalin A-baserad sedimentationsanalys för att mäta substratbindning av glukanfosfataser

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Stabil isotopspårning och LC-MS-analys för att mäta DHODH- och SDH-aktiviteter

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

Författare i fokus: Syreoberoende analyser för att mäta mitokondriell funktion hos däggdjur  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

Syreoberoende analyser för att mäta mitokondriell funktion hos däggdjur

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...