Name: use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions
Uploaded: 2022-02-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions at JoVE.com

Bu araştırma, Ulusal Bilim Vakfı'ndan (MCB 1818310) RAF'a verilen bir hibe ile desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen H. Lee Moffitt Kanser Merkezi'ndeki Kimyasal Biyoloji Çekirdek Tesisi / Protein Kristalografi Birimi (NIH / NCI: P30-CA076292) tarafından desteklenmiştir.

1. Malzemelerin hazırlanması
<ol><li>Fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın: 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 ve 2 mM KH2PO4, pH 7,41.</li>
	<li>NTA-Atto 647 N boyasını hazırlayın. Stok NTA-Atto 647 N boyasını %100 DMSO çözeltisinden 100 nM'ye kadar ara olmadan PBS'ye seyreltin.</li>
	<li>Express Vam7-His8 – E. coli'de bir füzyon proteini olarak protein ve Ni-NTA ve boyut dışlama kromatografisi kullanarak saflaştırın8...

<ol>
	<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroScale+Thermophoresis:+Interaction+analysis+and+beyond.">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li><li>Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, n. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+proteins+without+primary+sequence+tryptophan+residues:+mutant+trp+repressors+with+aliphatic+substitutions+for+tryptophan+side+chains.">Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains.</a> Gene. 163 (1), 1-11 (1995).</li><li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity.">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis.">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100 (2010).</li><li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis.">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding.">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li><li>Starr, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+induces+conformational+changes+in+Sec18+protomers+that+prevent+SNARE+priming.">Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).</li><li>Miner, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Central+Polybasic+Region+of+the+Soluble+SNARE+(Soluble+N-Ethylmaleimide-sensitive+Factor+Attachment+Protein+Receptor)+Vam7+Affects+Binding+to+Phosphatidylinositol+3-Phosphate+by+the+PX+(Phox+Homology)+Domain.">The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+phosphoinositide+partitioning+into+plasma+membrane+models.">Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models.</a> Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).</li><li>Zhao, H., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+guide+to+biochemical+approaches+for+analyzing+protein-lipid+interactions.">A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).</li><li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+proteins:+virulence+factors+of+intracellular+disease+agents.">Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents.</a> Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).</li><li>le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents.">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).</li><li>Corradi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Diversity+in+Lipid-Protein+Interactions.">Emerging Diversity in Lipid-Protein Interactions.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 5775-5848 (2019).</li><li>Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Microscale+Thermophoresis+to+Characterize+Hits+from+High-Throughput+Screening:+A+European+Lead+Factory+Perspective.">Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective.</a> SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).</li><li>Sparks, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+competitive+inhibitor+of+phosphatidic+acid+binding+by+the+AAA++protein+NSF/Sec18+blocks+the+SNARE-priming+stage+of+vacuole+fusion.">A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).</li></ol>

Vam7-His8'in DiC8-PA'ya bağlanmasının belirlenmesi, verilen etkileşim için sağlam bir KD sağladı; bu, Vam7-His8'in ölçülen KD'sinden PA lipozomlarına (yayınlanmamış) biraz daha düşük afinitedir. Bu fark büyük olasılıkla membran eksikliğinden kaynaklanmaktadır, bu da genellikle membrana özgü lipit bağlanma etkileşimleri için daha düşük afinite ile sonuçlanır ve bu nedenle lipozom membran iskelesinin bu etkileşime olan rolünü <su...

Mikroölçekli termoforez, biyokimyasal olarak ilgili ligandlar arasındaki ayrışma sabitlerinin (KD) ve inhibisyon sabitlerinin (IC50) belirlenmesinde nispeten yeni bir tekniktir. MST'nin önde gelen ticari perakendecisi (örneğin, NanoTemper) iki popüler MST teknolojisi sunmaktadır: 1) Floresan etiketi gerektiren etiketsiz MST ve 2) her proteinde bulunan aromatik kalıntıların sayısına bağlı olarak proteinlerin doğal floresansını kullanan etiketli termoforez1. Etiketsiz termoforezin bir dezavantajı, çoğu durumda, protein-protein etkileşimlerinin ölçülmesine izin vermemesidir. Bununla birlikte, etiketsiz termoforezde2 kullanılmak üzere triptofan gibi aromatik amino asitler olmadan proteinlerin mühendisliği mümkün olabilir.
MST, şu anda mevcut teknolojilerde kızılötesi lazer tarafından başlatılan mikroskobik sıcaklık alanlarının indüksiyonuna yanıt olarak parçacıkların hareketini ölçer1. MST, protein-protein etkileşimlerini, protein-lipit etkileşimlerini, protein-küçük molekülü, rekabet deneylerini ve hatta yeterli sinyal ayrımı üretebildiği sürece küçük moleküller arasındaki etkileşimleri ölçmek için kullanılabilir. Ek olarak, MST, lipozomlara veya nanodisklere gömülü membran-protein bazlı etkileşimlerin ölçülmesine izin verir. Etiketli termoforez, ligand ve analit arasındaki sinyalin kimyasal olarak kontrol edilebilir bir şekilde ayrılmasını sağlayan floresan etiketli etiketlerin kullanılmasından yararlanır. KD değerleri, düşük nanomolar konsantrasyonlarda protein bağlanmasını içeren etkileşimler için termoforez kullanılarak elde edilebilir; bu, çoğu durumda izotermal kalorimetri (ITC) için gerekli olandan çok daha düşük bir protein konsantrasyonudur3. Ek olarak, MST'nin yüzey plazmon rezonansı (SPR)4 için gerekli olan katı tamponlama gereksinimleri yoktur ve etiketli termoforez, genetik olarak yerleştirilmiş floresan etiketleriyle6 tam olarak saflaştırılmamış protein çözeltilerinden5 ilgili proteinlerin bağlanma sabitlerini ölçmek için bile kullanılabilir. MST'nin bir dezavantajı, kinetik parametrelerin SPR2'de olduğu gibi MST için kolayca elde edilememesidir.
Termoforez ölçümleri, bir çözeltinin yerel sıcaklık farkına bağlıdır. Bu ısı kızılötesi lazerden üretilebilir. MST cihazı, kızılötesi (IR) ışına bağlı bir floresan dedektörüne sahiptir ve IR lazerin hedeflendiği noktada floresan moleküllerinin yerel konsantrasyon değişikliklerinden floresandaki değişiklikleri alabilir. MST cihazı, doğrudan çözeltide ısının üretildiği aynı noktaya odaklanmış bir floresan dedektörüne bağlı IR hedefli bir lazer kullanır. Bu, IR lazer tarafından üretilen ısı noktasında moleküllerin tükenmesine karşılık gelen sıcaklıktaki değişikliklerin sağlam bir şekilde algılanmasını sağlar. Ölçülen floresan genellikle sıcaklık artışlarına yanıt olarak IR lazere daha yakın azalır. Sonuç olarak ölçülen farklılıklar, yük, boyut veya çözme entropisi gibi çoklu faktörlerden kaynaklanabilir. Bu farklılıklar, ısı indüksiyonuna veya moleküllerin kılcal damarın sıcaktan soğuk kısımlarına hareketine yanıt olarak floresandaki değişiklikler olarak ölçülür.
Bir kılcal damarı belirli bir çözelti ile yüklerken, kılcal damarın her iki ucunda hava bırakmak ve kılcal damarı tamamen doldurmamak önemlidir. Ticari kılcal damar yaklaşık 10 μL çözelti tutar. Çözelti kılcal damarın merkezine manipüle edildiği sürece, 5 μL çözelti ile doğru ölçümler elde edilebilir, hava kabarcıkları yoktur (kılcal damar yüklenmeden önce potansiyel olarak gazdan arındırılır) ve biri, çözeltiyi kızılötesi lazerin hedeflendiği kılcal damarın merkezinden itmemek için rafı yüklerken dikkatli olur. Lazer çözelti ile tam olarak temas etmezse, sonuç büyük olasılıkla bu konsantrasyon için üç kullanılamaz çıkıştan biri olacaktır: 1) hiç veya düşük floresan algılama, 2) daha yüksek floresan algılama (potansiyel olarak pürüzlü tepe noktasıyla) veya 3) verilen titrasyondan diğer değerler içinde floresan algılama, ancak pürüzlü ve yuvarlanmamış bir tepe noktasıyla.
Etiketli termoforez için, 200'ün üzerinde ve 2000 floresan ünitesinin altında bir floresan sinyaline sahip olmak en uygunudur7. MST cihazı, 200'ün üzerinde veya 2000'in altında bir sinyal elde etmek için seçilebilen 0 ila 100 arasında bir dizi LED yoğunluğu kullanır. Alternatif olarak, floresan sinyalini optimum seviyeye getirmek için etiketli ligandın farklı konsantrasyonları kullanılabilir. Verileri analiz ederken referans olarak belirli bir MST ölçümüne sahip bir kapak taraması çalıştırmak önemlidir, çünkü zayıf bir kapak taraması genellikle daha sonra aykırı değer olarak belirlenebilecek bir noktaya neden olabilir. Bir kapak taraması ile tek bir MST gücü ölçülürse her çalıştırma yaklaşık 30 dakika sürmelidir. Ticari cihazlar MST gücünde değişikliklere izin verir. Eski yazılım sürümlerinde bu, 0'dan 100'e kadar ayarlanabilir; ve sonraki sürümlerde düşük, orta veya yüksek MST seçilebilir. Sağlam izler elde etmek için, bir araştırmacının bunların her birini denemesi ve hangi MST ayarının belirli bir etkileşim için en sağlam verilerle sonuçlandığına karar vermesi gerekebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>For protein labeleing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prsim</td>
			<td>Graphpad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-K022</td>
			<td>Capillaries for MST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith NT.115 machine</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td></td>
			<td>University equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-Atto 647 N</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2175</td>
			<td>label for His tags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)</td>
			<td>Echelon</td>
			<td>P-3008</td>
			<td>Lipid for binding experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of microscale thermophoresis to measure protein-lipid interactions

Lipitlerin proteinlere bağlanma afinitesini belirleme yeteneği, membran kaçakçılığı, sinyal iletimi ve sitoiskelet yeniden modellemesinde protein-lipid etkileşimlerini anlamanın önemli bir parçasıdır. Bu tür etkileşimleri ölçmek için klasik araçlar arasında yüzey plazmon rezonansı (SPR) ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) bulunur. Güçlü araçlar olsa da, bu yaklaşımların aksilikleri vardır. ITC, büyük miktarlarda saflaştırılmış proteinin yanı sıra pahalı ve üretilmesi zor olabilen lipitler gerektirir. Ayrıca, ITC ve SPR çok zaman alıcıdır ve bu da bu deneyleri gerçekleştirmenin maliyetine önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu kısıtlamaları atlamanın bir yolu, nispeten yeni mikro ölçekli termoforez (MST) tekniğini kullanmaktır. MST, belirli bir bağlanma olayı için bir doygunluk eğrisi elde etmek için az miktarda numune kullanarak hızlı ve uygun maliyetlidir. Şu anda iki tür MST sistemi mevcuttur. Bir MST türü, mavi veya kırmızı spektrumda bir florofor ile etiketlemeyi gerektirir. İkinci sistem, UV aralığındaki aromatik amino asitlerin içsel floresansına dayanır. Her iki sistem de kızılötesi lazerden lokalize ısı indüksiyonuna yanıt olarak moleküllerin hareketini algılar. Her yaklaşımın avantajları ve dezavantajları vardır. Etiketsiz MST, etiketlenmemiş doğal proteinleri kullanabilir; Bununla birlikte, farmasötikler de dahil olmak üzere birçok analit, UV aralığında floresan yapar ve bu da doğru KD değerlerinin belirlenmesine müdahale edebilir. Buna karşılık, etiketli MST, UV'nin aksine görünür aralıkta ölçülebilir absorbanslara sahip ligandlara tutturulmuş floresan etiketli problar kullanılarak ölçülebilir çift yönlü etkileşimlerin daha fazla çeşitliliğine izin verir ve analitlerden gelen sinyallere müdahale etme potansiyelini sınırlar.

Bu, benzeşim analizini kullanan örnek bir çıktıdır. Etiketli MST, Vam7-His8'in doğal substratlarından birinin çözünür dioktanoyl (DiC8) PA'sına bağlanma sabitini belirlemek için kullanıldı9. Şekil 1, 50 nM Vam7-His8'e karşı 500 μM'den başlayan 1:1 DiC8 PA titrasyonunun bir denemesinden elde edilen termoforetik izleri sunmaktadır. İlk floresan (kızılötesi lazer açılmadan önceki zaman), Tjump (başlangıçta kızılötesi lazer açıldıkta...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions at JoVE.com

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Mikro ölçekli termoforez, düşük malzeme maliyetiyle bağlanma sabitlerini hızlı bir şekilde elde eder. Etiketli veya etiketsiz mikro ölçekli termoforez ticari olarak temin edilebilir; Bununla birlikte, etiketsiz termoforez, floresan etiketler kullanılarak gerçekleştirilebilecek etkileşim ölçümlerinin çeşitliliğini sağlayamaz. Etiketli termoforez ölçümleri için bir protokol sağlıyoruz.

Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Etiketli mikro ölçekli termoforez, çeşitli biyokimyasal etkileşimlerin ayrışma sabitlerini veya KD'lerini verimli bir şekilde elde eder. Bu protokol ve eşlik eden video, mayadaki tek çözünür SNARE proteini olan Vam7'nin fosfatidik aside yaklaşık afinitesini verir. Bu, Vam7'nin diğer proteinlerle etkileşime girmeden önce iki zarla ilişki kurma şeklidir.Bu yöntem, düşük maliyetle, yüksek tekrarlanabilirlikle ve minimum protein maliyetiyle çeşitli biyokimyasal etkileşimler için KD'leri hızla elde eder. Bu teknik, potansiyel kurşun bileşiklerini belirlemek için kolayca elde edilebilen KD'lere izin veren birinci aşama farmasötik geliştirme için uygundur. Bir analize başlamadan önce, MST cihazının arkasındaki güç düğmesini açın ve kontrol yazılımını açın.Bilgisayarın aygıta bağlı ve bağlı durumda olduğunu doğrulayın ve MST Önce'yi 3 saniye, MST'yi 30 saniye ve Floresan Kurtarma'yı 1 saniye sonra olarak ayarlayın. Her kılcal boru için, otomatik doldurma titrasyon oranını kullanarak hedef ligandın adını, ligand analitinin adını, hedefin konsantrasyonunu ve en yüksek titrasyon konsantrasyonunu girin. Bir dizi MST gücü seçin ve en sağlam bağlama uyumunu test etmek için her güç için değerler girin.Etiketli MST örnekleri hazırlamak için, her ikisi de PBS'de olmak üzere bir Vam7-oktahistit çözeltisini 200 nanomolar konsantrasyona ve NTA-Atto 647 boyasını 100 nanomolar konsantrasyona seyreltin. Vam7-oktahistidin ve NTA-Atto 647 boyasını 1: 1 hacimsel oranda karıştırın ve karışımın 30 dakika boyunca ışıktan korunan oda sıcaklığında oturmasına izin verin. Kuluçkanın sonunda, boya ve protein karışımını santrifüj edin ve çözeltiyi kullanımdan birkaç saat öncesine kadar 4 santigrat derecede saklayın.Ardından, numuneyi hazırlayın, boyalı ligand alın ve analite maruz bırakın. Numunenin mikro ölçekli termoforezi için, cihazı açın ve kılcal rafı dışarı kaydırın. Numune kılcal damarlarını birinci konumda en yüksek konsantrasyona sahip rafa yükleyin ve kontrol yazılımında Kırmızı kanalı seçin.Ardından, rafı cihaza yükleyin. Ardından bir MST gücü aralığı seçin ve Cap Scan MST Ölçümünü başlatın ve vites değiştirme tepkisini değerlendirin. Vam7 etiketli 50 nanomolar NTA-Atto 647 alanına karşı 500 mikromolden başlayan 1:1 DiC8 PA titrasyonunun bir denemesinden elde edilen termoforetik izler burada gösterilmiştir.İlk floresan, zaman sıçraması ve termoforez gözlemlenebilir ve KD'nin bu ölçümlerin herhangi birinden veya bir kombinasyonundan hesaplanmasına izin verilir. Bu sonuçlardan, örneğin grafikte gösterildiği gibi, zaman atlama çıkışına sahip termoforez için bir doygunluk eğrisi çizilebilir. Genel olarak, MST sonuçları, KD modelini seçerek ve protein konsantrasyonunu girerek bağlanma afinitesini belirlemek için protein konsantrasyonunu dikkate alarak, log ölçeği kullanılarak belirlenir.Bu protokolü uygularken, çözeltinin kılcal damarın merkezinde olduğundan ve hava kabarcığı olmadığından ve kılcal damarın dışında toz veya çözelti bulunmadığından emin olun. İzotermal titrasyon kalorimetrisi veya yüzey plazmon rezonansı, elde edilen deneysel KD'yi doğrulamak için kullanılabilir. Potansiyel işbirlikçi bağlama varsa, ITC, kaynaklar göz önüne alındığında gerçekleştirilen bir sonraki mantıksal yöntem olacaktır.Bu teknik, geleneksel biyoloji araştırmacılarının biyofiziksel tarama tekniklerini yol ilişkilerini belirlemek için araştırmalarına dahil etmelerini sağlamıştır. Bu tekniğin bir örneği, GFP etiketinin geleneksel bir pull-down testi yapmanın yeni bir yolu olduğu endojen olarak ifade edilen hedef proteine sahip hücre lizazıdır.

use-of-microscale-thermophoresis-to-measure-protein-lipid-interactions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Mikro Termoforesis kullanarak ATP bir aptamer Bağlama Sitesi Haritalama

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Biyokimya

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) ve Microscale Thermophoresis (MST) tarafından küresel ve ipliksi protein etkileşimleri ölçme

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in proteins and generating redox stress. Pathological conditions that lead to metal depletion or accumulation are causal agents of different human diseases. Some examples include anemia, acrodermatitis enteropathica, and Wilson&#8217;s and Menkes&#8217; diseases. It is therefore important to be able to measure the levels and transport of transition metals in biological samples with high sensitivity and accuracy in order to facilitate research exploring how these elements contribute to normal physiological functions and toxicity. Zinc (Zn), for example, is a cofactor in many mammalian proteins, participates in signaling events, and is a secondary messenger in cells. In excess, Zn is toxic and can inhibit absorption of other metals, while in deficit, it can lead to a variety of potentially lethal conditions.

Graphite furnace atomic absorption spectroscopy (GF-AAS) provides a highly sensitive and effective method for determining Zn and other transition metal concentrations in diverse biological samples. Electrothermal atomization via GF-AAS quantifies metals by atomizing small volumes of samples for subsequent selective absorption analysis using wavelength of excitation of the element of interest. Within the limits of linearity of the Beer-Lambert Law, the absorbance of light by the metal is directly proportional to concentration of the analyte. Compared to other methods of determining Zn content, GF-AAS detects both free and complexed Zn in proteins and possibly in small intracellular molecules with high sensitivity in small sample volumes. Moreover, GF-AAS is also more readily accessible than inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) or synchrotron-based X-ray fluorescence. In this method, the systematic sample preparation of different cultured cell lines for analyses in a GF-AAS is described. Variations in this trace element were compared in both whole cell lysates and subcellular fractions of proliferating and differentiated cells as proof of principle.

Cultured primary or established cell lines are commonly used to address fundamental biological and mechanistic questions as an initial approach before using animal models. This protocol describes how to prepare whole cell extracts and subcellular fractions for studies of zinc (Zn) and other trace elements with atomic absorbance spectroscopy.

Mammalin hücrelerinde hücre Içi çinko havuzlarını ölçmek için atomik absorbance spektroskopisi

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an upstream 3&#39; splice site within a pre-mRNA, a process called back-splicing. This circularization is likely aided by secondary structures in the pre-mRNA that bring the splice sites into close proximity. In human genes, Alu elements are thought to promote these secondary RNA structures, as Alu elements are abundant and exhibit base complementarities with each other when present in opposite directions in the pre-mRNA. Here, we describe the generation and analysis of large, Alu element containing reporter genes that form circular RNAs. Through optimization of cloning protocols, reporter genes with up to 20 kb insert length can be generated. Their analysis in co-transfection experiments allows the identification of regulatory factors. Thus, this method can identify RNA sequences and cellular components involved in circular RNA formation.

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

We clone and analyze reporter genes generating circular RNAs. These reporter genes are larger than constructs to analyze linear splicing and contain Alu elements. To investigate the circular RNAs, the constructs are transfected into cells and resulting RNA is analyzed using RT-PCR after removal of linear RNA.

Dairesel RNA'ları Analiz Etmek Için Minigen İçeren Alu Elementin Kullanımı

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent advancements in CD spectroscopy have enabled the study of DNA-protein interactions and conformational dynamics of DNA in different microenvironments in detail for a better understanding of transcriptional regulation in vivo. The area around a potential transcription zone needs to be unwound for transcription to occur. This is a complex process requiring the coordination of histone modifications, binding of the transcription factor to DNA, and other chromatin remodeling activities. Using CD spectroscopy, it is possible to study conformational changes in the promoter region caused by regulatory proteins, such as ATP-dependent chromatin remodelers, to promote transcription. The conformational changes occurring in the protein can also be monitored. In addition, queries regarding the affinity of the protein towards its target DNA and sequence specificity can be addressed by incorporating mutations in the target DNA. In short, the unique understanding of this sensitive and inexpensive method can predict changes in chromatin dynamics, thereby improving the understanding of transcriptional regulation.

The interaction of an ATP-dependent chromatin remodeler with a DNA ligand is described using CD spectroscopy. The induced conformational changes on a gene promoter analyzed by the peaks generated can be used to understand the mechanism of transcriptional regulation.

DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için CD Spektroskopisi

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

Glukan Fosfatazların Substrat Bağlanmasını Ölçmek için Konkanavalin A Bazlı Sedimantasyon Testi

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

DHODH ve SDH Aktivitelerini Ölçmek için Kararlı İzotop İzleme ve LC-MS Analizi

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

Yazar Spotlight: Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Testler  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...