Name: monitoring pd-1-blocking antibodies bound to t cells derived from a drop of peripheral blood
Uploaded: 2020-02-05T13:00:00
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이 작품은 일본과학진흥회(JP17K16045)와 일본의학연구개발원(JP18cm0106335, 19cm0106310)의 보조금을 지원받았습니다.

샘플링은 일상적인 임상 절차 동안 수행되었다. 모든 인간 샘플은 헬싱키 선언에 따라, 일본 오사카 대학(15383 및 752)의 윤리검토위원회의 승인을 받아 피험자가 제공한 동의를 얻은 후 얻어졌습니다.
1. 전혈 샘플 준비 및 염색
<ol><li>에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 포함하는 혈액 수집 튜브로 전체 혈액 샘플을 수집합니다. 참고: 혈액 수집은 일반 바늘 이나 혈액 ?...

<ol>
	<li>Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+PD-1+and+PD-L1+inhibitors+as+a+form+of+cancer+immunotherapy:+a+comprehensive+review+of+registration+trials+and+future+considerations.">Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8 (2018).</li><li>Borghaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Nonsquamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).</li><li>Brahmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Squamous-Cell+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).</li><li>Herbst, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+versus+docetaxel+for+previously+treated,+PD-L1-positive,+advanced+non-small-cell+lung+cancer+(KEYNOTE-010):+a+randomised+controlled+trial.">Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial.</a> The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).</li><li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-Related+Adverse+Events+Associated+with+Immune+Checkpoint+Blockade.">Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li><li>Weber, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+Profile+of+Nivolumab+Monotherapy:+A+Pooled+Analysis+of+Patients+With+Advanced+Melanoma.">Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).</li><li>Champiat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+immune+checkpoint+blockade+dysimmune+toxicities:+a+collaborative+position+paper.">Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper.</a> Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).</li><li>Brahmer, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+(MDX-1106)+in+refractory+solid+tumors:+safety,+clinical+activity,+pharmacodynamics,+and+immunologic+correlates.">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).</li><li>Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-parametric+flow+cytometry+staining+procedure+for+analyzing+tumor-infiltrating+immune+cells+following+oncolytic+herpes+simplex+virus+immunotherapy+in+intracranial+glioblastoma.">Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma.</a> Journal of Biological Methods. 6 (2), 112 (2019).</li><li>Osa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+monitoring+nivolumab+immunokinetics+in+non-small+cell+lung+cancer+patients.">Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients.</a> JCI Insight. 3 (19), 59125 (2018).</li><li>Zelba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantification+of+T-cells+expressing+PD-1+in+patients+on+anti-PD-1+immunotherapy.">Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).</li><li>Simoni, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bystander+CD8(+)+T+cells+are+abundant+and+phenotypically+distinct+in+human+tumour+infiltrates.">Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates.</a> Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).</li><li>Chiu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+general+method+for+quantifying+IgG-based+therapeutic+monoclonal+antibodies+in+human+plasma+using+protein+G+purification+coupled+with+a+two+internal+standard+calibration+strategy+using+LC-MS/MS.">Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS.</a> Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).</li></ol>

이 기사에서는, 우리는 우리가 원래 nivolumab 검출을 위해 개발한 말초 혈액의 한 방울에서 파생된 T 세포에 결합된 PD-1-차단 항체를 검출하기 위하여 유세포계를 이용한 방법을 보고합니다10. 이 기술은 매우 간단하고 수행하기 쉽지만 정확한 결과를 얻으려면 두 가지 중요한 사항을 주목해야합니다. 하나는 PD-1 분자를 검출하기 위해 니볼루맙 및 펨브롤리주맙과 경쟁하는 적절한 ...

PD-1-차단 항체는 비소세포 폐암(NSCLC)1,2,3,4를포함하는 다양한 유형의 암치료를 위한 표준 선택이 되고 있다. 그(것)들은 전통적인 세포 독성 화학요법에 반응하지 않은 암 환자의 부분 집합에 있는 현저한 치료 효력을 보여줍니다. 그러나, PD-1-차단 항체를 포함하는 면역 체크포인트 억제제(ICIs)는, 면역 관련 부작용(irAEs)이라고 불리는 특이적 스펙트럼의 독특하고 뚜렷한 스펙트럼을 유발할 수있다 5. irAEs는 거의 모든 조직에 영향을 미칠 수 있지만, 그들은 가장 일반적으로 위장관에서 관찰, 내분비 땀샘, 피부, 간, 그들은 소양증을 일으킬 수 있습니다, 발진, 구역질, 설사, 및 갑상선 질환6,7. 일반적으로 대부분의 iAEs는 ICI가 발생한 후 1~2개월 이내에 나타납니다. 그러나, 어떤 경우에는, 그(것)들은 처리의 시작 후에 1 년 이상 또는 처리중단후에6,7후에 생길 수 있습니다 . 그(것)들은 또한 그밖 병리에서 구별하기 어려울 지도 모르다 각종 현상을 일으키는 원인이 됩니다. 따라서 iAE를 신속하게 진단하고 적절하게 치료하는 것이 어려울 수 있습니다. irAEs는 모든 조직에 영향을 미칠 수 있고, 그들의 개시는 강하게 PD-1-차단 항체에 묶인 면역 세포, 특히 T 세포를 순환에 의해 영향을 받습니다. 따라서 항체 표적 T 세포를 모니터링하는 간단하고 최소 침습적인 방법은 임상 설정에서 중요하다.
여기에서, 우리는 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙을 수신한 암 환자에게서 말초 전혈의 한 방울을 사용하여 T 세포에 PD-1-차단 항체의 결합을 평가하는 간단한 방법을 개발했습니다. 이러한 접근법을 사용하여, 우리는 1) T 세포에 결합하는 항체의 지속 시간, 2) 치료 항체에 의한 T 세포 PD-1 분자의 점유, 3) T 세포의 활성화 상태 및 면역학적 특징을 각각 모니터링할 수 있었다. 이 방법은 이전에 보고된 기술8의수정입니다. 필요한 혈액의 양은 포도당 검사에 필요한 것과 거의 동일하며, 접근법은 단핵 세포 농축 또는 PD-1-차단 항체와의 공동 배양을 필요로 하지 않는다. 우리는 이 방법이 또한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 흉막 삼출액, 심낭 삼출액, 기관지 정맥 세척액 및 뇌척수액에서 세포를 포함하여 동결 된 샘플을 사용하여 수행 될 수 있음을 확인, 이 전략은 다센터 연구의 맥락에서 유용 할 수 있음을 시사. 이 방법은 iAEs의 조기 진단을 용이하게 할 수 있고, 또한 그들의 증상을 통제하고 PD-1 억제제 후에 후속 치료를 개시하기 위한 최적의 시간을 식별하는 적절한 면역 억제 치료를 결정하는 데 도움이 될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X RBC Lysis Buffer (Multi-species)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4300-54</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300518</td>
			<td>Clone RPA-T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>301048</td>
			<td>Clone RPA-T8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>14249-95</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>352058</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLOWJO</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12676029</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 monoclonal - Isotype control</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab81200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal Anti-Human IgG4 Fc</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab99825</td>
			<td>Clone HP6025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>558117</td>
			<td>Clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)</td>
			<td>BD</td>
			<td>561272</td>
			<td>Clone EH12.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse IgG1 &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD</td>
			<td>557646</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring pd-1-blocking antibodies bound to t cells derived from a drop of peripheral blood

PD-1-차단 항체를 포함한 면역 체크포인트 억제제는 다양한 유형의 암에서 치료 결과를 크게 개선했습니다. 이 면역 요법의 약리학적 인 효능은 오래 지속되며 지속적인 혈중 농도로 인해 주사 중단을 넘어서도 연장됩니다. 여기서 우리는 PD-1-차단 항체 니볼루맙 및 펨브롤리주맙의 T 세포 결합 상태를 평가하기 위한 간단한 유동 세포 분석기를 개발했다. 포도당 검사같이, 이 분석실험은 말초 혈액의 단지 1 방울을 요구합니다. T 세포에 결합하는 항체를 시각화하는 것은 항체 혈중 농도를 측정하는 것보다 더 신뢰할 수 있습니다. 추가적으로, 필요한 경우에, 우리는 잠재적으로 PD-1-차단 항체에 묶인 T 세포에 많은 특유한 면역 관련 마커를 분석할 수 있습니다. 따라서, 이것은 암 환자에서 PD-1-차단 항체의 약리효과를 분석하기 위한 간단하고 최소침습적인 전략이다.

게이팅 전략 및 유세포분석분석(도1)은NSCLC 환자 말초 혈액의 한 방울로부터 수득된 T 세포에 결합하는 PD-1-차단 항체를 검출할 수 있다. PD-1-차단 항체가 투여되기 전에, 인간 IgG4 양성 CD8 또는 CD4 T 세포가 존재하지 않으며, PD-1-검출 항체(EH12.1)에 의해 PD-1 발현이 확인될 수있다(그림 2A). 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙 투여 후, IgG4(니볼루맙, ?...

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Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

우리는 암 환자에게서 말초 혈액의 단지 한 방울을 요구하는 T 세포에 PD-1-차단 항체의 결합을 평가하기 위한 간단한 유동 세포 분석분석서를 개발했습니다.

말초 혈액 한 방울에서 파생 된 T 세포에 바인딩된 PD-1 차단 항체 모니터링

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

이 방법은 환자로부터 말초 혈액을 사용하여 PD-1 차단 항체 결합 세포를 결정하기 때문에, 항종양 효과 및 면역 관련 부작용에 대한 특정 하위 집합을 확인할 수 있다. 이 방법은 소량의 혈액 샘플만 필요하며 분석 과정은 매우 간단하고 빠합니다. 그것은 단지 흐름 세포 측정 기계가 필요합니다.시작하려면 EDTA가 함유 된 혈액 수집 튜브로 전혈 샘플을 수집하십시오. PBS에서 2%의 태아 소 혈청의 1 밀리리터로 각 5 밀리리터 둥근 바닥 폴리스티렌 플로우 세포측정관을 치료하십시오. 10 초 동안 소용돌이.그런 다음 전혈 샘플 20 마이크로리터를 처리된 5밀리리터 라운드 하단 튜브로 이송합니다. PBS에 2%의 FBS 20마이크로리터와 인간 전용 FC 수용체 차단 시약10마이크로리터를 추가합니다. 잘 섞고 실온에서 15분간 배양하세요.다음으로, 적혈구 리시스 버퍼의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 잘 섞어서 실온에서 10분간 배양하세요. PBS에 2%FBS의 4밀리리터를 추가하고 섭씨 4도에서 5분 동안 400배 g로 셀을 회전시합니다.열망으로 상체를 제거합니다. 세척 및 포부 과정을 반복합니다. PBS에서 2%FBS의 100 마이크로리터에서 세포를 다시 중단하고 각각 50 마이크로리터의 2개의 튜브로 분할합니다.표면 마커 항체를 추가합니다. 잘 섞어서 어둠 속에서 실온에서 20분 간 배양하세요. PBS에서 2%FBS에서 샘플을 2회 세척합니다.PBS에서 2%FBS의 200 마이크로리터에서 세포를 다시 중단합니다. 튜브를 유동 세포계에 삽입하고 권장 프로토콜에 따라 세포를 습득합니다. 분석을 위해 10, 000 이벤트를 림프구 게이트로 기록하고 흐름 데이터를 FCS 파일로 내보냅니다.분석 소프트웨어에서 파일을 열고 등색형 제어 파일을 클릭하여 측면 분산 플롯 및 게이트 림프구에 비해 전방 분산에 있는 셀을 시각화합니다. FSCH 대 FSCW 및 SSCH 대 SSCH를 사용하여 단일 셀을 선택하고 CD3 대 CD8 또는 CD3 대 CD4 플롯에 표시합니다. CD8 T 세포 및 CD4 T 셀을 각각 게이트합니다.게이트된 셀을 선택하고 PD-1대 인간 IgG4 플롯에 표시합니다. 그리고 동종형 제어를 기반으로, PD-1 차단 항체 바인딩 CD8 및 CD4 T 세포를 식별하기 위해 Q3을 선택합니다. 이 연구에서는, 게이팅 전략 및 유동 세포측정 분석은 환자 말초 혈액의 한 방울로부터 얻은 T 세포에 대한 PD-1 차단 항체 결합을 검출하였다.인간 IgG4 플롯대 PD-1 플롯은 T 세포에 PD-1 차단 항체의 결합 상태를 나타낸다. 주황색 점과 검은 점은 각각 안티 IgG4 항체 및 동형 대조군 염색을 나타낸다. PD-1 차단 항체가 투여되기 전에, 인간 IgG4 양성 CD8 또는 CD4 T 세포가 존재하지 않았으며 PD-1 발현은 항체를 검출하는 PD-1에 의해 확인되었다.니볼루맙 또는 펨브롤리주맙 투여 후, IgG4는 항-IgG4 항체에 의해 T 세포에서 검출될 수 있는 반면, PD-1 검출 항체 EH12.1은 T 세포에 대한 어떤 PD-1도 인식하지 못한다. 빨간색, 파란색 및 녹색 게이트는 각각 완전한 바인딩, 부분 바인딩 및 바인딩 손실을 나타냅니다. 환자가 니볼루맙과 펨브롤리주맙을 중단한 후, CD8 T 세포에 결합하는 PD-1 차단 항체의 상태가 감소하였다.부분 바인딩이 있었고 마침내 바인딩이 완전히 손실되었습니다. 혈액 샘플을 RBC 리시스와 혼합하십시오. 또한 표면 마커 염색 전에 RBC 리시스를 혼합하는 것이 이 방법의 핵심 단계이다.연구원이 고급 유동 세포측정기에 접근할 수 있는 경우, PD-1 차단 항체-바운드 T-세포는 이 전략과 관련된 점점 더 많은 마커로 평가될 수 있으며 PD-1 차단 항체에 의한 부작용을 담당하는 T세포 표현형을 프로파일링할 수 있다. 개발 된 부작용을 가진 환자에서 샘플링이 전략의 유용성을 평가하는 것이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

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연구

의학

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Lipoaspirate에서 수확 지방 - 파생 Stromal 셀을 사용하여 임계 크기 Calvarial 결함 모델의 수리

Craniofacial skeletal repair and regeneration offers the promise of de novo tissue formation through a cell-based approach utilizing stem cells. ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

급성 이식 - 대 - 호스트 질병의 생체의 유효성을 검사에 대한 높은 처리량 순차적 엘리사

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

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인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

II-45 동계 쥐의 Mesothelioma 모델에서 소성을 주입 및 주변 면역 세포 모니터링

The enormous upsurge of interest in immune-based treatments for cancer such as vaccines and immune checkpoint inhibitors, and increased understanding of ...

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전립선 암 환자의 발생은 종양 세포를 순환에서 이종 이식 모델을 파생

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Blood can be collected from rats in a number of sampling locations. For instance, the tail vein is a superior location for blood sampling. However, the ...

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