Deze methode kan worden gebruikt om te beces hoe nieuwe therapeutische middelen of strategieën, invloed of vergroting van de cytotoxische T-cel respons tijdens alvleesklierkanker. Deze techniek maakt het mogelijk tumoren snel worden verteerd en gestimuleerd in vitro, waardoor analyse van meerdere parameters van de T-cel respons tegelijkertijd, die gemakkelijk kan worden aangepast voor andere toepassingen. Om te beginnen, gebruik tangen, breng de tumor op een petrischaaltje.
Bewaar vijf milliliter spijsverteringsmedium in een buis van 50 milliliter op ijs om te voorkomen dat enzymactiviteit begint. Neem een kleine aliquot van deze oplossing, om de tumor op de Petri schotel te dekken. Gebruik een steriele scalpel en tangen om de tumor te snijden in kleine stukjes, ongeveer minder dan drie millimeter in lengte.
Schraap de tumor stukken in de buis, en voorzichtig omkeren van de buis totdat alle stukken worden ondergedompeld in de spijsvertering media. Breng de buis op een schudden apparaat gedurende 20 minuten op 37 graden Celsius te verteren. Zorg ervoor dat alle stukjes tumor zijn ondergedompeld, en niet vast aan de rand van de buis.
Onmiddellijk na de spijsvertering stap, plaats de buis op ijs om enzymactiviteit te vertragen. Voeg EDTA toe om een uiteindelijke concentratie van 20 millimolar te bereiken en laat het monster kort mengen om de enzymactiviteit verder te vertragen. Open de buis en spoel elke tumor verteren van het deksel van de buis met verse RPMI medium.
Bereid vervolgens een 70 micron zeef, plaats het op een 50 milliliter open buis op ijs. Maak het filter voor nat met medium. Resuspend de verteerde cellen en was de zijkanten van de buis met behulp van een 25 milliliter of grotere Stripette.
De bredere opening van de Stripette zorgt ervoor dat de dikke verteerbaarte gemakkelijk voorbij gaat. Breng alle digesten over op de zeef, met behulp van de 25 milliliter Stripette. Mash op en neer de tumor op de top van het filter met behulp van een een milliliter spuit zuiger.
Continu cellen wassen door de zeef met RPMI. Zorg ervoor dat je met voldoende kracht wast om de cellen erdoor te duwen. Doorgaan met wassen totdat alle cellen zijn doorgegeven door de zeef.
Centrifuge de buis gedurende vijf minuten op 300 keer G, en vier graden Celsius. Zorgvuldig resuspend de cel pellet, en volledige RPMI, en direct door een ander filter om een extracellulaire matrix te verwijderen, of grote celklonen die niet adequaat kunnen worden geresuspended. Als er geen stimulatie nodig is, bevlek dan onmiddellijk de geïsoleerde cellen voor flow cytometrieanalyse, of zet ze opnieuw op in het vriesmedium van 10%DMSO en FBS en bewaar ze bij min 80 graden Celsius.
Om stimulatie uit te voeren, eerst tellen de cellen. Verdun de cellen in volledig medium om een concentratie van twee keer tien tot zes per 100 microliter te bereiken. Plaat 100 microliter cellen in elke put van een U-bottomed 96 putplaat.
Voeg 100 microliter van compleet medium toe, met een 2x preparaat van PMA en Ionomycine. Plaats de plaat in een couveuse op 37 graden Celsius, maar 5%Kooldioxide gedurende een uur. Dan, bij 20 microliter van een 10X voorbereiding van Brefeldin A, en Monensin, en volledige media om een definitieve concentratie van 1.06 micromolar, en 2.0 micromolar, respectievelijk te bereiken.
Zet de plaat nog vier uur terug in de couveuse. Na het injecteren van 1000 TB32048 cellen in de alvleesklier, orthotopische tumoren duurt ongeveer 30 dagen te ontwikkelen. Na de vertering en stimulatie van de geoogste orthotopische tumoren werd een fluorescentie minus één uitgevoerd om achtergrondfluorescentie voor gating te bepalen.
En Brefeldin A Monensin enige controle werd uitgevoerd om de basale productie van cytokinen te bepalen. Voor interferon-gamma incubatie met Brefeldin A en Monensin, resulteerde in geen toename van interferon gamma over FMO controle, in zowel milt en tumor monsters. Echter, de toevoeging van PMA en ionomycine, verhoogde het percentage intracellulaire interferon gamma detecteerbaar in zowel milt en tumor-afgeleide CD4 positieve en CD8 positieve T-cellen.
Miltige CD4 positieve en CD8 positieve T-cellen, gebruikt als een positieve controle, hebben een relatief hogere interferon gamma productie, dan tumor-infiltreren T cel subsets. Wat aangeeft dat immunosuppressie optreedt in de tumor. Met dezelfde strategie voor TNF alpha was een hoog percentage milt-CD4-positieve T-cellen positief voor intracellulaire TNF-alfa.
Vergeleken met tumor-infiltrerende CD4 positieve T-cellen. Milt en tumor-infiltrerend CD8 positieve T-cellen, geproduceerd vergelijkbare niveaus van TNF alpha. Zorg ervoor dat de tumor voldoende is gehakt, en dat alle stukken worden ondergedompeld in de spijsvertering media.
Bij het stampen van de tumor, zorg ervoor dat voorzichtig te zijn, en was cellen door grondig. Het tumorverteringsprotocol kan worden gecombineerd met het sorteren van door stroom ondersteunde cellen, om individuele immuuncelsubsets te zuiveren voor aanvullende, functionele of genexpressieanalyse. We hebben deze methode gebruikt om te karakteriseren hoe B-cellen de immuunrespons vormen tijdens alvleesklierkanker, het genereren van orthotopische tumoren in zowel B-cel knock-out als B-cel-uitgeputte muizen.