Denna metod kan användas för att asses hur nya terapeutiska medel eller strategier, inflytande eller öka cytotoxiska T-cellen svar under cancer i bukspottskörteln. Denna teknik gör att tumörer snabbt kan smältas och stimuleras in vitro, vilket möjliggör analys av flera parametrar av T-cellen svar samtidigt, som lätt kan anpassas för andra tillämpningar. Till att börja använda tes, överföra tumören på en petriskål.
Förvara fem milliliter digestionsmedium i ett 50 milliliterrör på is för att förhindra att enzymaktiviteten börjar. Ta en liten alikvot av denna lösning, för att täcka tumören på Petri-skålen. Använd en steril skalpell och tövrängor för att skära tumören i små bitar, ungefär mindre än tre millimeter i längd.
Skrapa tumörbitarna i röret, och försiktigt invertera röret tills alla bitar är nedsänkta i matsmältningsmedia. Överför röret på en skakanordning i 20 minuter vid 37 grader celsius för att smälta. Se till att alla bitar av tumör är nedsänkt, och inte fastnat i kanten av röret.
Omedelbart efter matsmältningssteget, placera röret på is för att bromsa enzymaktivitet. Tillsätt EDTA för att uppnå en slutlig koncentration på 20 millimolar, och kort virvel provet att blanda för att ytterligare bromsa enzymaktivitet. Öppna röret och skölj någon tumör smälta bort locket på röret med färskt RPMI medium.
Förbered sedan en 70 mikron sil, placera den på en 50 milliliter öppet rör på is. Förväta filtret med medium. Resuspend de smälta cellerna och tvätta sidorna av röret med hjälp av en 25 milliliter eller större Stripette.
Den bredare öppningen av Stripette gör att den tjocka smältan lätt kan passera. Överför all digest på silen, med hjälp av 25 milliliter Stripette. Mosa upp och ner tumören ovanpå filtret med hjälp av en milliliter spruta kolven.
Tvätta celler kontinuerligt genom silen med RPMI. Se till att tvätta med tillräckligt med kraft för att driva cellerna igenom. Fortsätt tvätta tills alla celler har passerat genom silen.
Centrifugera röret i fem minuter vid 300 gånger G, och fyra grader Celsius. Försiktigt resuspend cell pelleten, och komplett RPMI, och passera direkt genom ett annat filter för att ta bort eventuella extracellulära matris, eller stora cell klumpar som inte kan vara tillräckligt återanvänds. Om ingen stimulering krävs, omedelbart fläck isolerade celler för flöde cytometri analys, eller återanvända dem i frysning medium av 10%DMSO och FBS, och lagra på minus 80 grader Celsius.
För att utföra stimulering, räkna först cellerna. Späd cellerna i komplett medium för att uppnå en koncentration på två gånger tio till de sex per 100 mikroliter. Plate 100 mikroliter av celler i varje brunn av en U-botten 96 väl platta.
Tillsätt 100 mikroliter av komplett medium, innehållande en 2X-beredning av PMA, och Ionomycin. Placera plattan i en inkubator på 37 grader celsius, men 5%Koldioxid i en timme. Sedan, vid 20 mikroliter av en 10X beredning av Brefeldin A, och Monensin, och kompletta medier för att uppnå en slutlig koncentration av 1,06 mikromolar, och 2,0 mikromolar, respektive.
Sätt tillbaka plattan i inkubatorn i ytterligare fyra timmar. Efter att ha injicerat 1000 TB32048 celler i bukspottkörteln, tar orthotopic tumörer cirka 30 dagar att utveckla. Efter matsmältning och stimulering av de skördade orthotopic tumörer, en fluorescens minus en utfördes för att fastställa bakgrunden fluorescens för gating.
Och Brefeldin A Monensin endast kontroll utfördes för att bestämma basal produktion av cytokiner. För interferon-gamma inkubation med Brefeldin A och Monensin, resulterade i någon ökning av interferon gamma över FMO kontroll, i både mjälte och tumör prover. Tillägg av PMA och jonomin, ökade dock andelen intracellulära interferon gamma detekterbara i både splenic och tumör-derived CD4 positiva och CD8 positiva T-celler.
Splenic CD4 positiva och CD8 positiva T-celler, används som en positiv kontroll, har en relativt högre interferon gamma produktion, än tumör-infiltrera T cell delmängder. Indikerar immunsuppression sker inom tumören. Med hjälp av samma strategi för TNF alfa, en hög andel splenic CD4 positiva T-celler var positiva för intracellulära TNF alfa.
Jämfört med tumör-infiltrera CD4 positiva T-celler. Splenic och tumör-infiltrera CD8 positiva T-celler, producerade liknande nivåer av TNF alfa. Se till att tumören är tillräckligt hackad, och att alla bitar är nedsänkt i matsmältningsmedia.
När mosa tumören, se till att vara mild, och tvätta celler genom noggrant. Tumören matsmältningen protokollet kan kombineras med flödesassisterad cell sortering, att rena enskilda immuncell delmängder för ytterligare, funktionella, eller gen uttryck analys. Vi har använt denna metod för att karakterisera hur B-celler formar immunsvaret under cancer i bukspottskörteln, generera ortopiska tumörer i både B-cell knockout och B-cell-utarmat möss.
