يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحسين كل من البروتين وتركيزات الأجسام المضادة الأولية في لوحة واحدة، وإجراء اثنين من المقايسات باستخدام إعداد عينة واحدة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لمدة 2 1/2 يوم من العمل في المختبر بما في ذلك تحليل البيانات ، ليتم الانتهاء منها في 3 1/2 ساعة. هذه التقنية توفر تنسيق تحليل عالية الإنتاجية لتطوير علامة حيوية تعتمد على الدم ل ALS وهي طريقة مثالية لإجراء التجارب السريرية الكبيرة.
يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على ملامح البروتين المستهدفة أثناء تشخيص المرض ويمكن أن تسهل رصد آثار الأدوية من التجارب السريرية مثيرة للاهتمام. بعد جمع 100 ميكرولترات من الصفائح الدموية البشرية من مرضى ALS والموضوعات الصحية ، قم بملء القوالب التي تم إنشاؤها في المنزل لتخطيط الشعيرات الدموية وإعداد العينة. جدول إعداد خليط العينة هو دينامية وسوف تحسب تلقائيا كم حجم ينبغي إزالتها من المصدر.
ضع كل الكواشف على الجليد باستثناء حزمة القياسية، والتي ينبغي أن تبقى في درجة حرارة الغرفة. لإعداد المزيج الرئيسي الفلورسنت، إضافة 40 ميكرولترات من المياه الأيونية إلى أنبوب واضح من DTT، وإضافة 20 ميكرولترات من 10X عينة العازلة.
و 20 ميكرولترات من 400 ملليمتر DTT الحل أعدت إلى أنبوب وردي من عدة فحص. لإعداد سلم biotinylated، إضافة 16 ميكرولترات من المياه الأيونة، واثنين من ميكرولترات من 10X عينة العازلة واثنين من ميكرولترات من الحل DTT 400 ملليمولار أعدت إلى أنبوب أبيض المقدمة في مجموعة. بعد خلط لطيف، نقل حل سلم إلى أنبوب PCR 200 ميكرولتر قبل denaturing.
إضافة 1.5 ميكرولترات من 10X عينة العازلة و 148.5 ميكرولترات من المياه ديوند إلى 600 ميكرولتر microcentrifuge أنبوب ودوامة لخلط، قبل وضع الأنبوب على الجليد. إضافة الأجسام المضادة من مصلحة مباشرة diluent كما هو مبين في الجدول وتدفق تلميح ماصة عدة مرات في حل الأجسام المضادة متجانسة. لإعداد مزيج عينة الشعيرات الدموية، فتح جميع أنابيب PCR وإضافة 1.6 ميكرولتر aliquots من الفلورسنت 5X عينة العازلة لكل أنبوب كما هو مبين في الجدول باستخدام أسلوب الأنابيب العكسية.
إغلاق كل أنبوب على الفور كما يتم إضافة المخزن المؤقت. عند إضافة كافة المخزن المؤقت، افتح كافة الأنابيب وإضافة مخزن عينة 0.1X في وحدات التخزين كما هو مشار إليه في الجدول، على الفور إغلاق كل أنبوب كما تتم إضافة المخزن المؤقت. بعد ذلك، افتح جميع الأنابيب وأضف عينات البروتين كما هو مبين في الجدول وأغلق على الفور كل غطاء أنبوبي.
وعندما تضاف جميع العينات، تقوم أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة بالطرد المركزي في جهاز طرد مركزي. دوامة لخلط وطاردة مركزية العينات مرة أخرى. في نهاية الطرد المركزي الثاني، ضع كل الأنابيب في دراجة حرارة مع غطاء ساخن.
وتحريف العينات تحت الشروط المشار إليها. في نهاية denaturation، الطرد المركزي، مزيج والطرد المركزي العينات مرة أخرى ووضع جميع الأنابيب في رف أنبوب على الجليد. باستخدام هذا الرقم كدليل، إضافة 10 ميكرولترات من streptavidin الفجل بيروكسيديز إلى D1 جيدا، 10 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لآبار D2 من خلال D5، 10 ميكرولترات من الأجسام المضادة diluent إلى كل بئر في الصف B وأيضا C1، 10 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية المناسبة لآبار C2 من خلال C25، خمسة ميكرولترات من سلم biotinylated من أنبوب PCR رقم واحد إلى A1 جيدا ، ثلاثة ميكرولتررس من عينة إلى الصفوف A2 من خلال A25 و 15 ميكرولترات من بيروكسيد لومينول الطازجة المعدة إلى كل بئر من الصف E.Pipetting مزيج العينة والكواشف في بئر صغيرة في أوامر الصحيح أمر بالغ الأهمية لنجاح التجربة، لذلك ينبغي أن يتم ذلك بعناية فائقة.
ثم إضافة 500 ميكرولترات من مخزن الغسيل إلى كل مخزن غسيل مخصص جيدًا. وتدور أسفل محتويات لوحة عن طريق الطرد المركزي. لإجراء تحليل الشعيرات الدموية على لوحة المقايسة، قم بتوصيل محلل الشعيرات الدموية بالنظام عبر الإنترنت وانقر على أداة والاتصال في برنامج المحلل.
حدد الرقم التسلسلي للصك ضمن القائمة المنبثقة، وانقر على الاتصال. حدد علامة التبويب فحص، وحدد فحص جديد، أدخل المعلمات المقايسة وحفظ اسم الملف والموقع. ثم تأكد من أن المؤشر الأزرق الوامض في المحلل هو أزرق خالص وإزالة خرطوشة الشعيرات الدموية من عبوته.
إزالة الختم واقية من لوحة المقايسة ومراقبة بصريا الآبار المملوءة مسبقا لفقاعات الهواء. ضع لوحة المقايسة في حامل اللوحة وتمسك خرطوشة الشعيرات الدموية بزاوية، وأدخل الكارتريدج في فتحة الشعيرات الدموية واغلق باب المحلل. ثم انقر فوق ابدأ في برنامج محلل.
استخدام خليط الصفائح الدموية الكاملة في المقايسة قد يقلل من كثافة إشارة البروتينات المستهدفة والمساهمة في إشارة خلفية عالية. لذلك ، في هذا الفحص ، تم استخدام مُنصفة واضحة بعد تمزق الصفائح الدموية. تم تأسيس نطاق ديناميكي خطي لتركيز بروتين السيتول بالصفائح الدموية عند 0.2 إلى 0.8 ملليغرام لكل ملليلتر ، وتم اعتماد قالب مقال بحيث يكون تركيز البروتين و titation الأجسام المضادة الأولية قادرين على القيام به في مقايسة واحدة.
يوفر ملف تعريف الكشف عن النطاق الديناميكي العالي نطاقًا ديناميكيًا أوسع نظرًا لحساسية أكبر من المقايسة الشعرية ، مما يؤدي إلى اكتشاف وتقدير أفضل على نطاق تركيز العينة الأكبر. ويمكن أيضاً تحديد أوقات التعرض الفردي. باستخدام ظروف الفحص الأمثل، هذا التحليل للكسور السيتوسوليك الصفيحية التي تم الحصول عليها من مرضى ALS باستخدام مجموعتين من الأجسام المضادة تسمح بتحديد TDP-43 الخاصة بالمرض ومشتقها الفوسفوري داخل العينات.
ويمكن بعد ذلك تحديد مجموع TDP-43 كميا باستخدام منحنى المعايرة. وتم اختبار التقلبات داخل وداخلية بين المدى في الكسور الدموية المضادة ل للدم البشري تجمع. تسمح هذه الطريقة باستخدام الأجسام المضادة الأولية ، مما يسهل تحديد ما يصل إلى خمسة بروتينات مستهدفة مختلفة داخل نفس العينة في اختبار واحد.
ليس فقط هذه التقنية تقلل إلى حد كبير من وقت تحليل البروتين، فإنه يتطلب وحدات تخزين العينة ميكروليتر ويولد نتائج مع درجة عالية من الاستنساخ. وتعتبر بعض المواد الكيميائية المستخدمة في هذا الفحص وجميع العينات البشرية هي الخطر البيولوجي، لذلك ينبغي دائماً استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة عند إجراء هذه التجارب.
