Denne protokol kan bruges til at optimere både protein og primære antistofkoncentrationer i en enkelt analyseplade og til at udføre to analyser ved hjælp af et enkelt prøvepræparat. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for 2 1/2 dages laboratoriearbejde, herunder dataanalyse, der skal udfyldes i 3 1/2 time. Denne teknik giver en høj gennemløbsanalyse format for at udvikle en blod-baseret biomarkør for ALS og er en ideel metode til at gennemføre store kliniske forsøg.
Denne metode kan give indsigt i mål protein profiler under sygdom prognose og kan lette overvågningen af virkningerne af lægemidler af interessante kliniske forsøg. Efter indsamling af 100 mikroliter af menneskelige blodplader lysater fra ALS patienter og raske forsøgspersoner, udfylde in-house genereret skabeloner til kapillær layout og prøve forberedelse. Prøveblandingspræparattabellen er dynamisk og beregner automatisk, hvor meget volumen der skal fjernes fra kilden.
Læg alle reagenserne på is. Bortset fra standardpakken, som skal forblive ved stuetemperatur. For at forberede fluorescerende master mix, tilsæt 40 mikroliter af deioniseret vand til et klart rør af DTT, og tilsæt 20 mikroliter af 10X prøve buffer.
Og 20 mikroliter af den forberedte 400 millimolar DTT opløsning til den lyserøde rør fra analysen kit. For at forberede den biotinylerede stige tilsættes 16 mikroliter deioniseret vand, to mikroliter 10X prøvebuffer og to mikroliter af den forberedte 400 millimolar DTT-opløsning til det hvide rør, der leveres i sættet. Efter skånsom blanding overføres stigens opløsning til et 200 microliter PCR-rør før denaturering.
Der tilsættes 1,5 mikroliter 10X prøvebuffer og 148,5 mikroliter deioniseret vand til et 600 mikrolitermikrocentrifugerør og vortex, der skal blandes, før røret anbringes på is. Der tilsættes direkte de interesseantistoffer, der er angivet i tabellen, og pipettespidsen skylles flere gange i en homogen antistofopløsning. For at forberede kapillær prøveblandingen åbnes alle PCR-rørene, og der tilsættes 1,6 mikroliter aliquots af lysstofrør 5X prøvebuffer til hvert rør som angivet i tabellen ved hjælp af en omvendt pipetteringsteknik.
Øjeblikkelig lukning af hvert rør, da bufferen tilsættes. Når alle bufferen er tilføjet, skal du åbne alle rørene og tilføje en 0,1 X-prøvebuffer i diskenheder som angivet i tabellen, der straks lukker hvert rør, efterhånden som bufferen tilsættes. Åbn derefter alle rørene og tilsæt proteinprøverne som angivet i tabellen, og luk straks hver rørhætte.
Når alle prøverne er tilsat, centrifugeres alle rørene kortvarigt i en centrifugering på en bordplade. Vortex at blande og centrifuge prøverne igen. Ved afslutningen af den anden centrifugering anbringes alle rørene i en termocyr med et opvarmet låg.
Og destænke prøverne under de angivne betingelser. Ved afslutningen af denatureringen, centrifuge, mix og centrifuge prøverne igen og læg alle rørene i et rørstativ på is. Brug figuren som vejledning tilsættes 10 mikroliter streptavidin peberrodsperoxidase til brønden D1, 10 mikroliter af det relevante sekundære antistof til brønde D2 til D5, 10 mikroliter antistoffortyndingstyndingstyd til hver brønd i række B og til brønden C1, 10 mikroliter af det relevante primære antistof til brønde C2 til C25, fem mikroliter biotinyleret stige fra PCR-rør nummer et til godt A1 , tre mikroliter af prøve til række A2 gennem A25 og 15 mikroliter af frisklavet luminolperoxid til hver brønd i række E.Pipetting prøven mix og reagenset i den lille brønd i de korrekte ordrer er afgørende for succes eksperimentet, så det bør gøres meget omhyggeligt.
Derefter tilsættes 500 mikroliter vaskebuffer til hver udpeget vaskebufferbde. Og drej pladeindholdet ned ved centrifugering. For at udføre kapillær analyse på analysen plade, skal du tilslutte kapillær analysator til online-systemet og klik på Instrument og Connect i analysatoren software.
Vælg instrumentserienummeret i pop op-menuen, og klik på Opret forbindelse. Vælg fanen Analyse, og vælg Ny analyse, angiv analyseparametrene, og gem filnavnet og placeringen. Bekræft derefter, at den blinkende blå indikator i analysatoren er en konstant blå, og fjern kapillærpatronen fra emballagen.
Fjern beskyttelsesforseglingen fra analysepladen, og overhold visuelt de fyldte brønde til luftbobler. Anvend analysepladen i pladeholderen og hold kapillærpatronen i en vinkel, sæt patronen i kapillæråbningen, og luk analysatordøren. Klik derefter på Start i analysatorsoftwaren.
Brugen af en hel blodplade lysat blanding i analysen kan reducere signalintensiteten af målet proteiner og bidrage til en høj baggrund signal. Derfor, i denne analyse, klar supernatant blev brugt efter brud blodpladerne. Et lineært dynamisk område for trombocytosolproteinkoncentrationen blev etableret ved 0,2 til 0,8 mg pr. milliliter, og der blev vedtaget en essayskabelon, således at både proteinkoncentrationen og den primære antistoftitrering kunne udføres i en enkelt analyse.
Den høje profil for detektion af detektionsområder med et meget bredere dynamisk område på grund af kapillær analysens større følsomhed, hvilket resulterer i en bedre detektion og kvantificering over et større prøvekoncentrationsområde. Individuelle eksponeringstider kan også defineres. Ved hjælp af de optimerede analysebetingelser gør denne analyse af blodplade cytosolic fraktioner fra ALS-patienter, der anvender to sæt antistoffer, det muligt at identificere sygdomsspecifikke TDP-43 og dets fosforylerede derivat i prøverne.
Den samlede TDP-43 kunne derefter kvantificeres ved hjælp af kalibreringskurven. Og intra og inter-run assay vari evner blev testet i pooled humane ALS blodplade cytosolic fraktioner. Denne metode gør det muligt at anvende primære antistoffer, hvilket letter identifikationen af op til fem forskellige målproteiner i samme prøve i en enkelt analysekørsel.
Ikke alene reducerer denne teknik proteinanalysetiden betydeligt, den kræver mikroliterprøvemængder og genererer resultater med en høj grad af reproducerbarhed. Nogle af de kemikalier, der anvendes i denne analyse, og alle humane prøver betragtes som biologiske, så passende personlige værnemidler bør altid anvendes, når disse eksperimenter udføres.