Dit protocol kan worden gebruikt om zowel eiwit- als primaire concentraties van antilichamen in één testplaat te optimaliseren en om twee tests uit te voeren met behulp van één monsterpreparaat. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt 2 1/2 dagen lab werk inclusief data-analyse, worden voltooid in 3 1/2 uur. Deze techniek biedt een hoge doorvoertest voor het ontwikkelen van een bloedgebaseerde biomarker voor ALS en is een ideale methode voor het uitvoeren van grote klinische proeven.
Deze methode kan inzicht geven in doeleiwitprofielen tijdens de ziekteprognose en kan de monitoring van de effecten van geneesmiddelen van interessante klinische studies vergemakkelijken. Na het verzamelen van 100 microliter menselijke bloedplaatjes van ALS-patiënten en gezonde proefpersonen, vul je in-house gegenereerde sjablonen in voor de capillaire lay-out en monstervoorbereiding. De bereidingstabel voor het monstermengsel is dynamisch en berekent automatisch hoeveel volume uit de bron moet worden verwijderd.
Zet alle testreagentia op ijs. Behalve de standaard verpakking, die moet blijven op kamertemperatuur. Om de fluorescerende mastermix voor te bereiden, voeg je 40 microliter gedeïmiseerd water toe aan een duidelijke buis van DTT en voeg je 20 microliter 10x monsterbuffer toe.
En 20 microliter van de bereide 400 millimolar DTT oplossing voor de roze buis uit de testkit. Om de biotinylated ladder voor te bereiden, voeg 16 microliter gedeïmiseerd water, twee microliters van 10X monsterbuffer en twee microliters van de voorbereide 400 millimolar DTT-oplossing toe aan de witte buis in de kit. Na het zachte mengen, breng de ladder oplossing in een 200 microliter PCR buis voor het denatureren.
Voeg 1,5 microliter 10x monsterbuffer en 148,5 microliter gedeïmiseerd water toe aan een 600 microliter microcentrifugebuis en vortex om te mengen, voordat je de buis in ijs plaatst. Voeg de antilichamen van belang direct het verdunningsmiddel zoals aangegeven in de tabel en spoel de pipet tip meerdere malen in een homogene antilichaam oplossing. Om de capillaire monstermix voor te bereiden, opent u alle PCR-buizen en voegt u 1,6 microliter 5x-monsterbuffer toe aan elke buis, zoals aangegeven in de tabel met behulp van een omgekeerde pipettingtechniek.
Onmiddellijk sluiten van elke buis als de buffer wordt toegevoegd. Wanneer alle buffer is toegevoegd, opent u alle buizen en voegt u een monsterbuffer van 0,1 X toe in volumes zoals aangegeven in de tabel, waarbij elke buis onmiddellijk wordt gesloten wanneer de buffer wordt toegevoegd. Open vervolgens alle buizen en voeg de eiwitmonsters toe zoals aangegeven in de tabel en sluit onmiddellijk elke tube cap.
Wanneer alle monsters zijn toegevoegd, kort centrifuge alle buizen in een benchtop centrifuge. Vortex om de monsters opnieuw te mengen en te centrifugeren. Plaats aan het einde van de tweede centrifugatie alle buizen in een thermocycler met een verwarmd deksel.
En denature de monsters onder de aangegeven omstandigheden. Aan het einde van de denaturatie, centrifuge, meng en centrifuge de monsters opnieuw en plaats alle buizen in een buis rek op ijs. Met behulp van de figuur als een gids, voeg 10 microliters van streptavidin mierikswortel peroxidase goed D1, 10 microliter van de juiste secundaire antilichaam tegen putten D2 tot en met D5, 10 microliter antilichaamverwijdtingsmiddelen voor elke put in rij B en te goed C1, 10 microliters van de juiste primaire antilichamen tegen putten C2 tot en met C25, vijf microliter van biotinylated ladder van PCR buis nummer een tot goed A1 , drie microliter van monster naar rijen A2 door A25 en 15 microliters van vers bereide luminolperoxide aan elke put van rij E.Pipetting de monstermix en het reagens in de kleine put in de juiste orders is van cruciaal belang voor het succes van het experiment, dus het moet zeer zorgvuldig worden gedaan.
Voeg vervolgens 500 microliter wasbuffer toe aan elke aangewezen wasbuffer. En draai de inhoud van de plaat naar beneden door centrifugatie. Om de capillaire analyse op de testplaat uit te voeren, sluit u de capillaire analyzer aan op het online systeem en klikt u op Instrument en Connect in de analyzersoftware.
Selecteer het serienummer van het instrument in het pop-upmenu en klik op Verbinden. Selecteer het tabblad Testen en selecteer Nieuwe test, voer de testparameters in en sla de bestandsnaam en -locatie op. Bevestig vervolgens dat de knipperende blauwe indicator in de analyzer een effen blauw is en verwijder de capillaire cartridge uit de verpakking.
Verwijder de beschermafdichting van de testplaat en observeer visueel de voorgevulde putten voor luchtbellen. Plaats de testplaat in de plaathouder en houd de capillaire patroon onder een hoek, steek de cartridge in de capillaire sleuf en sluit de analyzer deur. Klik vervolgens op Start in de analyzersoftware.
Het gebruik van een hele bloedplaatjesmengsel in de test kan de signaalintensiteit van de doeleiwitten verminderen en bijdragen aan een hoog achtergrondsignaal. Daarom werd in deze test duidelijke supernatant gebruikt na het scheuren van de bloedplaatjes. Een lineair dynamisch bereik voor de bloedplaatjes cytosol eiwitconcentratie werd vastgesteld op 0,2 tot 0,8 milligram per milliliter, en een essay sjabloon werd aangenomen, zodat zowel de eiwitconcentratie en de primaire antilichaam titratie in staat waren om te worden uitgevoerd in een enkele test.
Het detectieprofiel met een hoog dynamisch bereik biedt een aanzienlijk groter dynamisch bereik vanwege de grotere gevoeligheid van de capillaire test, wat resulteert in een betere detectie en kwantificering over een groter monsterconcentratiebereik. Individuele belichtingstijden kunnen ook worden gedefinieerd. Met behulp van de geoptimaliseerde testomstandigheden maakt deze analyse van bloedplaatjescyslaatcytosolische breuken verkregen van ALS-patiënten met behulp van twee sets antilichamen de identificatie mogelijk van ziektespecifieke TDP-43 en het fosforyleerde derivaat in de monsters.
De totale TDP-43 kan dan worden gekwantificeerd met behulp van de kalibratiecurve. En de intra en inter-run assay variabilities werden getest in gepoolde menselijke ALS bloedplaatjes cytosolische fracties. Deze methode maakt het gebruik van primaire antilichamen mogelijk, waardoor maximaal vijf verschillende doeleiwitten binnen hetzelfde monster in één testrun kunnen worden geïdentificeerd.
Niet alleen vermindert deze techniek de eiwitanalysetijd aanzienlijk, het vereist microlitermonstervolumes en genereert resultaten met een hoge mate van reproduceerbaarheid. Sommige van de chemische stoffen die worden gebruikt in deze test en alle menselijke monsters worden beschouwd als biogevaarlijk, dus passende persoonlijke beschermingsmiddelen moeten altijd worden gebruikt bij het uitvoeren van deze experimenten.
