Denne protokollen kan brukes til å optimalisere både protein- og primær antistoffkonsentrasjoner i en enkelt analyseplate, og til å utføre to analyser ved hjelp av et enkelt prøvepreparat. Den største fordelen med denne teknikken er at det tillater 2 1 / 2 dager med laboratoriearbeid inkludert dataanalyse, som skal fullføres i 3 1 / 2 timer. Denne teknikken gir et høyt gjennomstrømningsanalyseformat for å utvikle en blodbasert biomarkør for ALS og er en ideell metode for å gjennomføre store kliniske studier.
Denne metoden kan gi innsikt i målproteinprofiler under sykdomsprognose og kan lette overvåkingen av effekten av legemidler av interessante kliniske studier. Etter å ha samlet 100 mikroliter av humane blodplater lysater fra ALS-pasienter og friske forsøkspersoner, fyll ut in-house genererte maler for kapillær layout og prøve forberedelse. Prøveblandingsforberedelsestabellen er dynamisk og beregner automatisk hvor mye volum som skal fjernes fra kilden.
Plasser alle analysereagensene på isen. Bortsett fra standardpakken, som skal forbli ved romtemperatur. For å forberede den fluorescerende masterblandingen, tilsett 40 mikroliter av deionisert vann til et klart rør med DTT, og tilsett 20 mikroliter med 10X prøvebuffer.
Og 20 mikroliter av den tilberedte 400 millimolar DTT-løsningen til det rosa røret fra analysesettet. For å forberede den biotinylererte stigen, tilsett 16 mikroliter av deionisert vann, to mikroliter på 10X prøvebuffer og to mikroliter av den tilberedte 400 millimolar DTT-løsningen til det hvite røret som følger med i settet. Etter skånsom blanding, overfør stigen løsningen til en 200 mikroliter PCR rør før denaturing.
Tilsett 1,5 mikroliter med 10X prøvebuffer og 148,5 mikroliter av deionisert vann til et 600 mikrocentrifugerør og virvel for å blande, før du plasserer røret på is. Tilsett antistoffene av interesse direkte fortynningsvæsken som angitt i tabellen og skyll pipettespissen flere ganger i en homogen antistoffløsning. For å klargjøre kapillærprøveblandingen, åpne alle PCR-rørene og legg til 1,6 mikroliter aliquots av fluorescerende 5X prøvebuffer til hvert rør som angitt i tabellen ved hjelp av en omvendt pipetteringsteknikk.
Umiddelbart lukke hvert rør som bufferen er lagt til. Når hele bufferen er lagt til, åpner du alle rørene og legger til en 0,1 X prøvebuffer i volumer som angitt i tabellen, og lukker umiddelbart hvert rør når bufferen legges til. Deretter åpner du alle rørene og legger til proteinprøvene som angitt i tabellen og lukker umiddelbart hver rørhette.
Når alle prøvene er lagt til, sentrifuger kort alle rørene i en benkeplate sentrifuge. Vortex å blande og sentrifuge prøvene igjen. På slutten av den andre sentrifugeringen plasserer du alle rørene i en termocycler med oppvarmet lokk.
Og denatur prøvene under de angitte forholdene. På slutten av denningen, sentrifuge, bland og sentrifuge prøvene igjen og legg alle rørene i et rørstativ på is. Bruk figuren som en guide, tilsett 10 mikroliter streptavidin pepperrot peroxidase til godt D1, 10 mikroliter av riktig sekundært antistoff til brønner D2 til D5, 10 mikroliter antistofffortynningsmiddel til hver brønn på rad B og til godt C1, 10 mikroliter av riktig primærantistoff til brønner C2 til C25, fem mikroliter biotinylert stige fra PCR tube nummer én til brønn A1 , tre mikroliter prøve til rader A2 gjennom A25 og 15 mikroliter av nylaget luminolperoksid til hver brønn av rad E.Pipetting prøveblandingen og reagensen i den lille brønnen i de riktige ordrene er avgjørende for suksessen til eksperimentet, så det bør gjøres veldig nøye.
Tilsett deretter 500 mikroliter vaskebuffer til hver utpekte vaskebuffer godt. Og spinn ned plateinnholdet ved sentrifugering. For å utføre kapillæranalysen på analyseplaten, koble kapillæranalysatoren til det elektroniske systemet og klikk Instrument og Koble til i analysatorprogramvaren.
Velg instrumentserienummeret i popup-menyen, og klikk på Koble til. Velg kategorien Analyse, og velg Ny analyse, skriv inn analyseparameterne og lagre filnavnet og plasseringen. Bekreft deretter at den blinkende blå indikatoren i analysatoren er en solid blå og fjern kapillærkassetten fra emballasjen.
Fjern beskyttelsesforseglingen fra analyseplaten og følg visuelt de ferdigfylte brønnene for luftbobler. Plasser analyseplaten i plateholderen og hold kapillærkassetten i en vinkel, sett patronen inn i kapillærsporet og lukk analysatordøren. Klikk deretter Start i analysatorprogramvaren.
Bruken av en hel blodplatelylatblanding i analysen kan redusere signalintensiteten til målproteinene og bidra til et høyt bakgrunnssignal. Derfor, i denne analysen, ble det brukt klart supernatant etter rupturing av blodplatene. Et lineært dynamisk område for blodplatecytosolproteinkonsentrasjonen ble etablert ved 0,2 til 0,8 milligram per milliliter, og en essaymal ble vedtatt slik at både proteinkonsentrasjonen og den primære antistofftitreringen kunne utføres i en enkelt analyse.
Den høye dynamiske områdedeteksjonsprofilen gir et betydelig bredere dynamisk område på grunn av den større følsomheten til kapillæranalysen, noe som resulterer i en bedre deteksjon og kvantifisering over et større prøvekonsentrasjonsområde. Individuelle eksponeringstider kan også defineres. Ved hjelp av de optimaliserte analyseforholdene tillater denne analysen av blodplatelylatcytokløse karfraksjoner hentet fra ALS-pasienter ved hjelp av to sett med antistoffer identifisering av sykdomsspesifikke TDP-43 og dets fosforederivat i prøvene.
Den totale TDP-43 kan deretter kvantifiseres ved hjelp av kalibreringskurven. Og de intra og inter-run analyse variasjoner ble testet i samlede menneskelige ALS blodplate cytosoliske fraksjoner. Denne metoden tillater bruk av primære antistoffer, noe som letter identifisering av opptil fem forskjellige målproteiner i samme prøve i en enkelt analysekjøring.
Ikke bare reduserer denne teknikken proteinanalysetiden betydelig, det krever mikroliter prøvevolumer og genererer resultater med høy grad av reproduserbarhet. Noen av kjemikaliene som brukes i denne analysen og alle menneskelige prøver anses som biofarlige, så passende personlig verneutstyr bør alltid brukes når du utfører disse eksperimentene.
