Использование капиллярного электрофореза иммуноанализ для поиска потенциальных биомаркеров бокового амиотрофического склероза в тромбоцитах человека

Этот протокол может быть использован для оптимизации концентрации белка и первичных антител в одной анализной пластине, а также для выполнения двух анализов с использованием одного образца подготовки. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет 2 1 / 2 дней лабораторных работ, включая анализ данных, которые будут завершены в 3 1 / 2 часа. Этот метод обеспечивает высокий формат анализа пропускной способности для разработки биомаркера на основе крови для ALS и является идеальным методом для проведения крупных клинических испытаний.

Этот метод может дать представление о целевых профилях белка во время прогноза заболевания и может облегчить мониторинг воздействия препаратов интересных клинических испытаний. Собрав 100 микролитров лизатов человеческих тромбоцитов у пациентов с АЛС и здоровых испытуемых, заполните в доме созданные шаблоны для капиллярной компоновки и подготовки образца. Таблица подготовки образцовой смеси является динамической и автоматически вычисляет, сколько объема должно быть удалено из источника.

Поместите все анализные реагенты на лед. Кроме стандартной упаковки, которая должна оставаться при комнатной температуре. Чтобы подготовить флуоресцентную мастер-смесь, добавьте 40 микролитров деионизированной воды в чистую трубку DTT и добавьте 20 микролитров буфера образца 10X.

И 20 микролитров подготовленного 400-миллиметрового раствора DTT к розовой трубке из комплекта анализа. Для подготовки биотинилированной лестницы добавьте 16 микролитров деионизированной воды, два микролитров буфера образца 10X и два микролитров подготовленного 400-миллиметрового раствора DTT в белую трубку, предусмотренную в комплекте. После нежного смешивания перенесите решение лестницы в 200 микролитровую ПЦР-трубку перед денатурированием.

Добавьте 1,5 микролитера буфера образца 10X и 148,5 микролитров деионизированной воды в 600 микроцентрифуг микроцентрифуг трубки и вихря для смешивания, прежде чем поместить трубку на лед. Добавить антитела, представляющие интерес непосредственно разгруг, как указано в таблице и промыть наконечник пипетки несколько раз в однородном растворе антитела. Чтобы подготовить капиллярный образец смеси, откройте все трубки ПЦР и добавьте 1,6 микролитровых алицитов флуоресцентного буфера образца 5X к каждой трубке, как указано в таблице, используя технику обратного пипетки.

Немедленное закрытие каждой трубки при добавлении буфера. Когда весь буфер будет добавлен, откройте все трубки и добавьте буфер образца 0.1X в объемах, указанных в таблице, немедленно закрывая каждую трубку по мере добавления буфера. Затем откройте все трубки и добавьте образцы белка, как указано в таблице, и немедленно закройте каждую крышку трубки.

Когда все образцы были добавлены, кратко центрифуга все трубы в центрифуге скамейки. Vortex смешивать и центрифугировать образцы снова. В конце второй центрифугации поместите все трубки в термоциклер с нагретой крышкой.

И денатуратуры образцов в указанных условиях. В конце денатурации центрифуга, смесь и центрифуга образцы снова и поместить все трубки в трубку стойку на льду. Используя фигуру в качестве руководства, добавьте 10 микролитров стрептавидина пероксидазы хрена в хорошо D1, 10 микролитров соответствующего вторичного антитела к скважинам D2 через D5, 10 микролитров разбомбительного антитела к каждой скважине подряд В и хорошо С1, 10 микролитров соответствующего первичного антитела к скважинам C2 через C25, пять микролитров биотинилированной лестницы от ПЦР трубки номер один до скважины А1 , три микролитров образца строк A2 через A25 и 15 микролитров свежеприготовленного перекиси люминола к каждой колодец строки E.Pipetting образца смеси и реагент в крошечные хорошо в правильных заказов имеет решающее значение для успеха эксперимента, так что это должно быть сделано очень тщательно.

Затем добавьте 500 микролитров буфера мытья к каждому назначенному буферу мытья хорошо. И спина вниз содержимое пластины центрифугации. Для выполнения капиллярного анализа на анализе пластины, подключить капиллярный анализатор к онлайн-системе и нажмите инструмент и подключиться в программном обеспечении анализатора.

Выберите серийный номер инструмента в меню всплывающего окна и нажмите Connect. Выберите вкладку Assay и выберите New Assay, введите параметры анализа и сохраните имя и местоположение файла. Затем подтвердите, что мигающий синий индикатор в анализаторе является сплошным синим и удалите капиллярный картридж из упаковки.

Снимите защитное уплотнение с анализной пластины и визуально наблюдайте за заранее заполненными колодцами для пузырьков воздуха. Поместите анализную пластину в держатель пластины и удерживая капиллярный картридж под углом, вставьте картридж в капиллярный слот и закройте дверь анализатора. Затем нажмите Кнопку Начало в программном обеспечении анализатора.

Использование целой смеси лизата тромбоцитов в анализе может снизить интенсивность сигнала целевых белков и способствовать высокому фоновому сигналу. Поэтому в этом анализе после разрыва тромбоцитов использовался чистый супернатант. Линейный динамический диапазон концентрации белка цитозола тромбоцитола был установлен на уровне от 0,2 до 0,8 миллиграмма на миллилитр, и был принят шаблон эссе, так что и концентрация белка, и первичное титрование антител могли быть выполнены в одном анализе.

Профиль обнаружения высокого динамического диапазона обеспечивает значительно более широкий динамический диапазон благодаря большей чувствительности анализа капилляров, что приводит к лучшему обнаружению и количественной оценке в более широком диапазоне концентрации выборки. Индивидуальное время экспозиции также может быть определено. Используя оптимизированные условия анализа, этот анализ лизолированных фракций лизоли тромбоцитов, полученных от пациентов с ALS с использованием двух наборов антител, позволяет идентифицировать специфический для болезни TDP-43 и его фосфорилированную производную в образцах.

Общий объем TDP-43 можно было бы количественно оценить с помощью кривой калибровки. И внутри- и межпродюсовые вариабильности анализа были протестированы в объединяются человеческие цитозоловые фракции тромбоцитов ALS. Этот метод позволяет использовать первичные антитела, облегчая идентификацию до пяти различных целевых белков в пределах одного образца в одном анализе перспективе.

Этот метод не только существенно сократит время анализа белка, но и требует объемов микролитерной выборки и дает результаты с высокой степенью воспроизводимости. Некоторые химические вещества, используемые в этом анализе, и все человеческие образцы считаются биоопасным, поэтому при проведении этих экспериментов всегда следует использовать соответствующее средства индивидуальной защиты.