Bu protokol, tek bir tahlil plakasında hem protein hem de primer antikor konsantrasyonlarını optimize etmek ve tek bir numune hazırlığı kullanarak iki tahlil yapmak için kullanılabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, veri analizi de dahil olmak üzere 2,5 günlük laboratuvar çalışmasının 3,5 saat içinde tamamlanmasına olanak sağlamasıdır. Bu teknik ALS için kan bazlı biyomarker geliştirmek için yüksek bir üretim tahlili formatı sağlar ve büyük klinik çalışmalar yapmak için ideal bir yöntemdir.
Bu yöntem, hastalık prognozu sırasında hedef protein profilleri hakkında bilgi sağlayabilir ve ilginç klinik çalışmaların ilaçlarının etkilerinin izlenmesini kolaylaştırabilir. ALS hastalarından ve sağlıklı deneklerden 100 mikrolitre insan trombositi topladıktan sonra, kılcal düzen ve numune hazırlama için oluşturulan şablonları doldurun. Numune karışımı hazırlama tablosu dinamiktir ve kaynaktan ne kadar hacim alınması gerektiğini otomatik olarak hesaplar.
Tüm titrereretileri buzüzerine yerleştirin. Oda sıcaklığında kalması gereken standart paket hariç. Floresan ana karışımı hazırlamak için, DTT net bir tüp için deiyonize su 40 mikrolitre ekleyin ve 10X örnek tampon 20 mikrolitre ekleyin.
Ve hazırlanan 400 milimolar DTT çözeltisinin 20 mikrolitresi, parmak izi kitinden pembe tüpe. Biyotinylated merdiven hazırlamak için, kiti sağlanan beyaz tüp için hazırlanan 400 milimolar DTT çözeltisi 16 mikrolitre deiyonize su, 10X örnek tampon iki mikrolitre ve iki mikrolitre ekleyin. Hafifçe karıştırdıktan sonra, merdiven çözeltisini denatüre etmeden önce 200 mikrolitrelik bir PCR tüpüne aktarın.
Tüpü buzüzerine yerleştirmeden önce karıştırmak için 600 mikrolitrelik mikrosantrifüj tüpüne 10X numune tamponu ve 148,5 mikrolitre deiyonize su ekleyin. İlgi antikorlarını doğrudan tabloda belirtildiği gibi dilüent ekleyin ve pipet ucunu homojen bir antikor çözeltisinde birden fazla kez temize çıkarın. Kapiller numune karışımını hazırlamak için, tüm PCR tüplerini açın ve ters pipetleme tekniği kullanılarak tabloda belirtildiği gibi her tüpe 1,6 mikrolitre floresan 5X numune tamponu ekleyin.
Tampon eklendikçe her tüpü hemen kapatıyor. Arabellek tüm eklendiğinde, tüm tüpleri açın ve tabloda belirtildiği gibi hacimlerde 0.1X örnek arabellek ekleyin, tampon eklendikçe hemen her tüp kapatArak. Daha sonra, tüm tüpleri açın ve tabloda belirtildiği gibi protein örnekleri ekleyin ve hemen her tüp kapağı nı kapatın.
Tüm numuneler eklendiğinde, bir tezgah üstü santrifüjtüm tüpler kısaca santrifüj. Girdap karıştırmak ve tekrar örnekleri santrifüj. İkinci santrifüjün sonunda, tüm tüpleri ısıtmalı kapaklı bir termocycler içine yerleştirin.
Ve belirtilen koşullar altında örnekleri dennature. Denatürasyon sonunda, santrifüj, karıştırın ve tekrar örnekleri santrifüj ve buz üzerinde bir tüp raf tüm tüpler yerleştirin. Bir rehber olarak rakam kullanarak, iyi D1 streptavidin horseradish peroksidaz 10 mikrolitre ekleyin, D2 ile D5 kuyularına uygun ikincil antikor 10 mikrolitre, B satırında her kuyuya ve iyi C1'e 10 mikrolitre antikor, C2'den C25'e kadar uygun birincil antikora 10 mikrolitre, PCR tüpünden bir den a1'e kadar biyotinylated merdivenin beş mikrolitresi , A2 ile A25 ve 15 mikrolitre taze hazırlanmış luminol peroksit için örnek karışımı ve doğru sıralarla küçük kuyuya reaktif için örnek üç mikrolitre deneyin başarısı için çok önemlidir, bu yüzden çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.
Sonra iyi belirlenen her yıkama tampon 500 mikrolitre yıkama tampon ekleyin. Ve plaka içeriğini santrifüjle aşağı çevirin. Tahlil plakası üzerinde kılcal analiz gerçekleştirmek için, kapiller analizör online sisteme bağlayın ve analizör yazılımında Instrument and Connect'e tıklayın.
Açılan menüdeki enstrüman seri numarasını seçin ve Bağlan'ı tıklatın. Assay sekmesini seçin ve Yeni Tsed'i seçin, arama parametrelerini girin ve dosya adını ve konumunu kaydedin. Ardından, analizördeki yanıp sönen mavi göstergenin katı mavi olduğunu onaylayın ve kılcal kartuşun ambalajından çıkarın.
Koruyucu mührü temizleme plakasından çıkarın ve hava kabarcıkları için önceden doldurulmuş kuyuları görsel olarak gözlemleyin. Tezplakayı plakaya yerleştirin ve kılcal kartuşunu bir açıyla tutarak kartuşun kapiller yuvaya yerleştirin ve analizör kapısını kapatın. Ardından çözümleyici yazılımında Başlat'ı tıklatın.
Tüm trombosit lysate karışımının tsurürde kullanılması hedef proteinlerin sinyal yoğunluğunu azaltabilir ve yüksek arka plan sinyaline katkıda bulunabilir. Bu nedenle, bu tozta trombositler yırtıldıktan sonra net supernatant kullanılmıştır. Trombosit sitosol protein konsantrasyonu için doğrusal dinamik aralık mililitrebaşına 0,2 ila 0,8 miligram olarak belirlendi ve hem protein konsantrasyonu hem de primer antikor titrasyonunun tek bir tahsinte yapılabilmeleri için bir deneme şablonu benimsenmiştir.
Yüksek dinamik aralık algılama profili, kılcal testin daha fazla hassasiyeti sayesinde önemli ölçüde daha geniş bir dinamik aralık sağlar ve daha geniş bir numune konsantrasyon aralığında daha iyi bir algılama ve niceleme sağlar. Bireysel maruz kalma süreleri de tanımlanabilir. En iyi analiz koşulları kullanılarak, ALS hastalarından elde edilen trombosit litosolik fraksiyonlarının iki set antikor kullanılarak incelenmesi, numunelerde hastalığa özgü TDP-43 ve fosforlu türevinin tanımlanmasına olanak sağlar.
Daha sonra toplam TDP-43 kalibrasyon eğrisi kullanılarak ölçülebilir. Ve intra ve inter-run test çeşitleri havuzlu insan ALS trombosit sitomatik fraksiyonları test edildi. Bu yöntem, birincil antikorların kullanılmasını sağlar ve aynı numune içinde beş farklı hedef proteinin tek bir test çalışmasında tanımlanmasını kolaylaştırır.
Bu teknik sadece protein analiz süresini önemli ölçüde azaltmakla kalmıyor, mikrolitre numune hacimleri gerektirir ve yüksek derecede tekrarlanabilirlik ile sonuçlar üretir. Bu testte kullanılan kimyasalların bazıları ve tüm insan numuneleri biyolojik olarak tehlikeli olarak kabul edilir, bu nedenle bu deneyler icra edilirken her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılmalıdır.
