Name: multidimensional coculture system to model lung squamous carcinoma progression
Uploaded: 2020-03-17T14:00:00
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我们感谢马加里·古夫罗伊、约翰·克雷格和辉瑞肿瘤学组织病理学和生物标志物小组为病理学/组织学支持而对手稿进行批判性审查的斯蒂芬尼·比苏尔科。我们还感谢辉瑞博士后计划和肿瘤研发小组，特别是罗伯特·亚伯拉罕、普贾·萨普拉、卡伦·维布丁和詹妮弗·特杰达对该计划的支持。

1. 在 2D 培养中传递和培养 TUM622 细胞和 CAF
<ol><li>传路和培养TUM622细胞<ol>
<li>37°C的TUM622细胞的加热3D培养基和细胞分离试剂（参见材料表）。</li>
		<li>在 2D 烧瓶中以 80% 的汇合度通过 TUM622 细胞。通常，这发生在传递后 1 周。</li>
		<li>从 T75 烧瓶中丢弃旧介质，用 6 mL 的 HEPES 缓冲液洗涤一次。避免移液直接移到细胞上。</li>
		<li>吸气 HEPES 缓冲器。加入4 mL的胰蛋白酶/EDTA（0.25毫克/mL，...

<ol>
	<li>Cancer Genome Atlas Research Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genomic+characterization+of+squamous+cell+lung+cancers.">Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers.</a> Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).</li><li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Extracellular+Matrix,+Scaffolds,+and+Signaling:+Tissue+Architecture+Regulates+Development,+Homeostasis,+and+Cancer.">Of Extracellular Matrix, Scaffolds, and Signaling: Tissue Architecture Regulates Development, Homeostasis, and Cancer.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (1), 287-309 (2006).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+at+a+glance.">The tumor microenvironment at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125 (23), 5591-5596 (2012).</li><li>Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue-specific+signaling+and+organ+function+in+three+dimensions.">Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.</a> Journal of Cell Science. 116 (Pt 12), 2377-2388 (2003).</li><li>Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bronchial+epithelial+cells+differentiate+to+3D+glandular+acini+on+basement+membrane+matrix.">Human bronchial epithelial cells differentiate to 3D glandular acini on basement membrane matrix.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (6), 914-921 (2011).</li><li>Godugu, C., Singh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AlgiMatrix-Based+3D+Cell+Culture+System+as+an+In+Vitro+Tumor+Model:+An+Important+Tool+in+Cancer+Research.">AlgiMatrix-Based 3D Cell Culture System as an In Vitro Tumor Model: An Important Tool in Cancer Research.</a> Methods in Molecular Biology. 1379, 117-128 (2016).</li><li>Amann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+innovative+3D+cell+culture+system+to+study+tumour--stroma+interactions+in+non-small+cell+lung+cancer+cells.">Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells.</a> PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+suppress+SOX2-induced+dysplasia+in+a+lung+squamous+cancer+coculture.">Cancer-associated fibroblasts suppress SOX2-induced dysplasia in a lung squamous cancer coculture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), E11671-E11680 (2018).</li><li>Damelin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineation+of+a+cellular+hierarchy+in+lung+cancer+reveals+an+oncofetal+antigen+expressed+on+tumor-initiating+cells.">Delineation of a cellular hierarchy in lung cancer reveals an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells.</a> Cancer Research. 71 (12), 4236-4246 (2011).</li><li>Sapra, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+tumor+regression+induced+by+an+antibody-drug+conjugate+that+targets+5T4,+an+oncofetal+antigen+expressed+on+tumor-initiating+cells.">Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4, an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12 (1), 38-47 (2013).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning.">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb.prot4989 (2008).</li></ol>

肿瘤是由癌细胞与巨发细胞并存的异质组织，如癌症相关成纤维细胞、内皮细胞和ECM内的免疫细胞。这些不同的成分相互交扰并影响肿瘤微环境，在推动肿瘤形成方面起着积极的作用，这个过程涉及肿瘤结构的渐进变化。理想情况下，肿瘤发育的体外模型应该能够捕捉人体肿瘤体内观察到的动态组织结构变化，在肿瘤微环境中各种细胞类型的复杂相互作用，同时允许对TME中的肿瘤细胞和成分进行?...

肺癌是全世界癌症相关死亡的主要原因。肺鳞状细胞癌（LUSC），是非小细胞肺癌（NSCLC）的第二常见类型，约占所有肺癌的30%，通常诊断为晚期，预后差1。LUSC 患者的治疗选择是一个主要未满足的需求，可以通过更好地了解推动 LUSC 肿瘤生成的基础细胞和分子机制来改进。
与大多数人类癌症一样，LUSC的发病机制的特点是破坏完整、有序的上皮组织架构2。在这个过程中，适当的肛门-基底细胞极性、细胞细胞和细胞基质接触丢失，从而允许肿瘤细胞不受控制的生长和侵入性行为。现在人们普遍认识到，癌细胞的恶性特征不能表现出，没有癌细胞与局部肿瘤微环境（TME）3之间的重要相互作用。3TME中的关键成分包括细胞外基质（ECM）、癌症相关成纤维细胞（CAFs）以及内皮细胞和渗透免疫细胞，积极塑造TME并驱动肿瘤发生4。然而，我们目前对TME中肿瘤细胞和这些关键成分在LUSC进展过程中如何相互作用以驱动组织架构变化的理解非常有限。
三维（3D）培养是研究细胞内在和外在调节正常组织和病变组织中组织结构变化的生物活动的重要工具。3D 区域性提供了传统二维 （2D） 区域性中通常缺少的合适结构和功能上下文。这些系统的附加维度更密切地模仿体内组织在细胞生理学和细胞行为的许多方面，包括增殖、分化、迁移、蛋白质表达和对药物治疗的反应。近年来，各实验室的努力已导致正常肺和NSCLC66、7、87,8的体外3D模型的发展。然而，一个肺鳞状癌的模型，可以重述肿瘤发生期间的动态组织结构变化，以及纳入关键的基质成分是不可用的。
在这里，我们描述了使用主要PDX衍生的LUSC细胞（称为TUM622）和CAF9、10,10建立新型三维（3D）共培养系统的方法。TUM622和CAF均来自肿瘤不良的NSCLC患者10。当作为单个细胞嵌入ECM时，TUM622细胞的罕见亚群能够形成具有类似甲形结构的器官，以显示适当的锥形基底细胞极性。这些类似同形的构造是超塑性的，在保持非侵入性的同时，表现出类似茎的异质表达和分化标记物，同时保持非侵入性，从而模仿LUSC发展的最早阶段。重要的是，我们表明，通过抑制带有小分子抑制剂的细胞内通信号通路或加入ECM中的关键组分（如CAF）来改变类似阿基纳尔结构的组织结构，后者可增强阿基尼的形成，并进一步促使阿基尼在近距离侵入。这些数据共同表明，LUSC器官的这种3D共同培养系统为研究LUSC细胞与TME之间的动态互惠提供了一个有价值的平台，并可用于监测LUSC细胞对药物治疗的反应。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bronchial Epithelial Growth Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3170</td>
			<td>BEGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 40um</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>352340</td>
			<td>For passing TUM622 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase 3 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661 (RRID:AB_2341188)</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolRack CFT30</td>
			<td>Biocision</td>
			<td>BCS-138</td>
			<td>For 3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSink XT96F</td>
			<td>Biocision</td>
			<td>BCS-536</td>
			<td>For 3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex 3D Cell Harvesting Kit</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>3448-020-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex (preferred for co-culture)</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>3443-005-01</td>
			<td>For 3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab124824 (RRID:AB_10975635)</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610182 (RRID:AB_397581)</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCount</td>
			<td>Oxford Optronix</td>
			<td></td>
			<td>For Acini counts and measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM130 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610822 (RRID:AB_398141)</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>S1000 (RRID:AB_2336615)</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082-147</td>
			<td>For CAFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology sample gel</td>
			<td>Richard Allan Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrin alpha 6 antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Mab1378 (RRID:AB_2128317)</td>
			<td>Rat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Involucrin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab68 (RRID:AB_305656)</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab15580 (RRID:AB_443209)</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System</td>
			<td>Nalge Nunc International</td>
			<td>155379 (2)</td>
			<td>For 3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System</td>
			<td>Nalge Nunc International</td>
			<td>155409 (8)</td>
			<td>For 3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>For CAFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (preferred for mono-culture)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>For 3D culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p63 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13109 (SRRID:AB_2637091)</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For CAFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReagentPack Subculture Reagents</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5034</td>
			<td>For TUM622 cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>For CAFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3579 (RRID:AB_2195767)</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>For CAF dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell</td>
			<td>Bechman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Automatic cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab92547 (RRID:AB_10562134)</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-catenin antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2677s (RRID:AB_1030943)</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multidimensional coculture system to model lung squamous carcinoma progression

肿瘤-斯特罗马相互作用在肺鳞癌（LUSC）的发展中起着关键作用。然而，由于缺乏适当的模型，了解这些动态相互作用如何促进肿瘤发生期间观察到的组织结构变化仍然具有挑战性。在此协议中，我们描述了使用 LUSC 主细胞培养（称为 TUM622）生成 3D 共培养模型。TUM622细胞由LUSC患者衍生的异种移植物（PDX）建立，具有独特的特性，在地下室膜基质中播种时形成类似甲烷的结构。我们演示了在3D共同培养中TUM622 acini在LUSC进展期间重述组织结构的关键特征，以及LUSC细胞与肿瘤微环境（TME）组件之间的动态相互作用，包括细胞外基质 （ECM） 和癌症相关成纤维细胞 （CAFs）。我们进一步调整我们的主要3D培养协议，以演示如何将该系统用于各种下游分析。总体而言，这个器官模型创造了一个生物学丰富和适应性强的平台，使人们能够深入了解细胞内在和外在机制，促进上皮结构在癌变过程中破坏，并将有助于寻找新的治疗靶点和诊断标记。

TUM622 和 2D 区域性中的 CAF 图 1显示了 2D 培养中 TUM622 细胞和 CAF 的典型形态。TUM622细胞用大核四舍五入，而CAF是扁平和细长的。TUM622细胞在培养中可达到80%-90%的汇合度。进一步的增殖导致更多的，但较小的细胞聚合在菌落，不直接接触。相反，CAF更喜欢在更高的细胞密度下生长，如果提供足够的营养，则会保持完全汇合的增殖。
<p ...

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Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression

开发了一个体外模型系统，用于捕捉与癌症相关成纤维细胞 （CAF） 共同培养的三维 （3D） 共同培养中肺鳞状癌 （LUSC） 进展期间的组织结构变化。该器官系统提供了一个独特的平台来研究各种肿瘤细胞内在和外在变化的作用，调节肿瘤表型。

多维共同培养系统模拟肺鳞癌进展

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions ...

我们的培养系统捕获肺鳞状细胞癌细胞的表型可塑性，以响应肿瘤-频闪相互作用，以及这些相互作用在肺鳞状细胞癌进展期间如何调节肿瘤形态。我们系统的主要优点是能够在三维环境中对肺鳞状细胞生物学进行建模，同时保持恶性细胞的可塑性。这种3D共培养提供了一个独特的系统来研究肿瘤-频闪细胞的相互作用，并可以适应监测肺鳞状细胞和癌症相关成纤维细胞对药物治疗的反应。首先，在四摄氏度的冰箱中解冻地下室膜基瓶过夜。在零下 20 摄氏度的温度下冷却两毫升塑料移液器和提示。第二天，在37摄氏度的水浴中加热用于分离TUM622细胞、HEPES缓冲液、三辛/EDTA和三辛中和缓冲液的试剂。将解冻的地下室膜基质从冰箱中取出，将小瓶放在冰上。冷却放置在冰上的金属平台冷却器上的组织培养板。将离心管放在冰上金属冷却架上。根据要准备的每个井中的井数和细胞浓度计算所需的细胞量。将 TUM622 电池悬浮液转移到冷却的离心管中，在 4 摄氏度的悬挂式铲斗离心机中以 300 倍 g 的速率旋转，5 分钟。将吸气移液器连接到未过滤的尖端上，小心吸升，将介质的约 200 微升留在管子中。轻轻敲击管的一侧以分离和分离颗粒，然后将其返回到冷却架。使用两毫升预冷移液器，通过上下移液几次，轻轻地将基质混合在冰上。以均匀和中等速度移液，以便在此过程中不会将气泡引入矩阵中。将1.1毫升的基质转移到每个离心管中。使用预冷尖端，移液器矩阵在每个管上下约10次，使一个均匀的细胞悬浮。将 310 微升的电池基质悬浮液转移到预冷 24 井板的每个井中。将移液器以 90 度角放置到板表面，并将悬架添加到井的中心。悬架扩散并覆盖整个井。为了便于下游免疫荧光分析，将60微升细胞基质悬浮液转移到双井腔滑轨的井中心。这允许矩阵形成一个圆顶样的结构，体积要小得多。将板和腔室滑回组织培养箱并孵育30分钟，使基质凝固。之后，在光学显微镜下检查板和滑动，以确保单个细胞均匀地分布在矩阵中。将一毫升预热 3D 培养物将完整的培养介质添加到板的每个井中，将 1.5 毫升的 3D 培养物添加到腔室幻灯片的每个井中，然后将它们返回到培养箱中。如前所述，制备 TUM622 和 CAF 的细胞悬浮液后，通过将 10 微升细胞悬浮液与 10 微升的 trypan 蓝色混合来计算 CAF 细胞密度。在血细胞计上的两个腔室中加入10微升混合物，以计算和计算细胞密度。要将TUM622细胞和CAF共同嵌入地下室膜基质中，首先根据细胞密度信息计算用于电镀的所需细胞数量。CAF 以 TUM622 细胞的 2：1 比率播种。将计算的TUM622和CAF电池悬浮液的体积转移到同一个离心管中。向下旋转并吸气所有介质。将混合物重新放入地下膜基质和板310微升的混合物中，放入24孔板的每个孔中。对于免疫荧光，将 60 微升 TUM622 和 CAF 混合物转移到室滑梯上，如前所述。要将 TUM622 与基底膜矩阵中的叠加 CAF 进行共培养，请先设置如前所述的 TUM622 单培养，将 CAF 悬浮液数的两倍转移到离心管中，并在室温下以 300 次 g 旋转，5 分钟。吸增生并重新在培养基中重新暂停 CAF，将培养基中重新暂停的 CAF 细胞数的两倍转移到包含嵌入的 TUM622 细胞的每个孔中。2D 培养中的典型 TUM622 细胞用大核四舍五入，而 CAF 则是扁平和拉长的。在3D培养中播种，单个TUM622细胞在嵌入时能够形成具有类似形态的器官。在第五天至第七天之间，流明在类似青霉的结构中变得明显，此后仍然空心。每种青霉素，由围绕空心流明的单层细胞组成，表现出与体内肺上皮相似的适当的基础极性。这些类似钙质的结构是超塑性，并持续生长，直到24天前，细胞外基质完全解体。在 TUM622-CAF 共培养中，无论是叠加还是共嵌入，CAF 的存在极大地增强了形成的球体的数量和大小。有趣的是，当TUM622阿奇尼接近CAF时，他们诱导acini变得侵入性，并迁移到CAF，形成泪滴样结构。为了确保类似辛纳的结构的强健形成，在细胞嵌入的整个过程中，保持基底膜基质的液体形式至关重要。TUM622有机物可用于各种下游分析，包括但不限于免疫荧光、免疫组织化学、流细胞学、RNA和蛋白质提取，还可以进行药物筛选。利用该系统作为平台，可以研究肿瘤细胞内在以及肿瘤微环境细胞外在变化如何影响肿瘤上皮结构及癌形成。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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癌症研究

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档案福尔马林固定，石蜡包埋的人类口咽鳞状细胞癌样品中T细胞亚群的四色荧光免疫组织化学

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Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...