ठोस ट्यूमर की भविष्य कहनेवाला प्रतिरक्षा मॉडलिंग

इम्यूनो-ऑन्कोलॉजी अनुसंधान में ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट की व्यापक विशेषता आवश्यक है। यह परख ठोस ट्यूमर ऊतक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं को मापने के लिए आरएनए आधारित स्वास्थ्य अभिव्यक्ति मॉडल का उपयोग करने के लिए पहली बार है । यह परख शोधकर्ताओं को एफएफबी ठोस ट्यूमर ऊतकों में प्रतिरक्षा संदर्भ के अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट माप हासिल करने और इन परिणामों को बहु-आयामी बायोमार्कर में संयोजित करने में सक्षम बनाती है।

सभी कैंसर उपचार, न सिर्फ इम्यूनोथेरपी, ठोस ट्यूमर की साइट पर एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना । इस प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को मापने रोग प्रगति और चिकित्सा प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । यह प्रोटोकॉल लक्षित कैप्चर के साथ पारंपरिक आरएनए पुस्तकालय तैयारी तकनीकों को जोड़ती है।

जबकि समय लेने वाली, धोने के कदम के बाद और गुणवत्ता नियंत्रण चौकियों की निगरानी के रूप में सुझाव दिया सफलता के लिए बहुत महत्वपूर्ण है । फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड नमूनों से अत्यधिक अपमानित आरएनए के लिए, मेज के अनुसार बर्फ पर पहली कतरा संश्लेषण प्रतिक्रिया को इकट्ठा करें। एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज में नमूनों को संक्षेप में नीचे घूमते हुए कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके प्रतिक्रियाओं को अच्छी तरह से मिलाएं।

अपकेंद्रित्र के अंत में, तुरंत टेबल से कार्यक्रम नंबर तीन के बाद नमूनों को पहले से गरम थर्मल साइकिलर में रखें। उच्च गुणवत्ता वाले बरकरार आरएनए के लिए, टेबल में उल्लिखित नाभिक मुक्त पीसीआर ट्यूब में बर्फ पर पहली कतरा संश्लेषण प्रतिक्रिया को इकट्ठा करें। इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, एक नाभिक मुक्त पीसीआर ट्यूब में दो माइक्रोग्राम कॉट-1 डीएनए और ओलिगोस को अवरुद्ध करने के दो माइक्रोलीटर के साथ ब्याज की बारकोडेड लाइब्रेरी के 200 नैनोग्राम मिलाएं।

फिर ट्यूब की सामग्री को सुखाने के लिए 30 से 45 डिग्री सेल्सियस तक वैक्यूम सांसिंगेटर सेट का उपयोग करें। संकरण के बाद, थर्मल साइकिलर से नमूनों को हटा दें और थर्मल साइकिलर को गर्म ढक्कन सेट के साथ 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने के लिए 70 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। नमूनों को पूरी तरह से समरूप मोतियों के 17 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें और 10 बार अच्छी तरह से ऊपर और नीचे पिपेट करें।

मोतियों के लिए डीएनए बांधने के लिए, थर्मल cycler में ट्यूबों जगह कार्यक्रम के बाद 10 संक्षेप में छीन ट्यूबों को हटाने के लिए कोमल भंवर के तीन सेकंड के लिए हर 10 से 12 मिनट मोती फिर से निलंबित रखने के लिए । बाध्यकारी इनक्यूबेशन के तुरंत बाद, थर्मल साइकिलर से ट्यूबों की एक पट्टी को हटा दें और ट्यूबों में प्रीहीटेड वॉश बफर के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। पिपेट अच्छी तरह से ऊपर और नीचे 10 बार और एक चुंबकीय रैक पर ट्यूबों जगह मोती पूरी तरह से धोने के समाधान से अलग करने से पहले अनबाउंड डीएनए सुपरनेट युक्त अनुमति देते हैं ।

रैक से ट्यूबों को हटा दें और बुलबुले से बचने के लिए ध्यान रखने वाले मोतियों को पूरी तरह से फिर से खर्च करने के लिए पूरी तरह से मिश्रण के साथ प्रीहीटेड कड़े वॉश बफर के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें। ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर वापस रखने से पहले पांच मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर थर्मल साइकिलर में वापस रखें ताकि मोतियों को सुपरनेटेंट से पूरी तरह से अलग किया जा सके । सुपरनेटेंट युक्त अनबाउंड डीएनए को त्यागें, मोतियों को एक बार फिर से गरम कठोर वॉश बफर के साथ धोएं क्योंकि कुल दो कड़े वॉश के लिए प्रदर्शन किया गया था।

आखिरी वॉश के बाद, सुपरनेट को हटा दें और ट्यूबों में एक कमरे के तापमान धोने के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें। मोतियों को पूरी तरह से पुनर्स्थानाने के लिए 10 से 20 बार धोने को पिपेट करें और 30 सेकंड के लिए भंवर के बीच बारी-बारी से दो मिनट के लिए सील किए गए ढक्कन के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करें और 30 सेकंड के लिए आराम करें। इनक्यूबेशन के अंत में, अपकेंद्रित्र संक्षेप में और चुंबकीय रैक पर ट्यूबों जगह है और सुपरनैंट को हटा एक बार मोती पूरी तरह से चुंबक का पालन किया है ।

अपकेंद्रित्र टोपियां बंद के साथ संक्षेप में ट्यूबों और चुंबकीय रैक के लिए नमूने वापस । किसी भी अवशिष्ट वॉश बफर को हटाने के लिए 10 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करें और कमरे के तापमान धोने बफर दो के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें। मोनेट मोतियों को पूरी तरह से पुनर्व्यवस्थित करने के लिए 10 से 20 बार धोएं और 30 सेकंड के लिए भंवर के बीच बारी-बारी से दो मिनट के लिए सील किए गए ढक्कन के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करें और 30 सेकंड के लिए आराम करें।

एक संक्षिप्त अपकेंद्रित्र के बाद, प्रत्येक ट्यूब से मोतियों की पूरी मात्रा को साफ नाभिक मुक्त पीसीआर ट्यूबों में स्थानांतरित करें और ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर रखें। सुपरनेटेंट युक्त अनबाउंड डीएनए को त्यागने के बाद, संक्षेप में नमूनों को फिर से अपकेंद्री करें और चुंबकीय रैक में रहते हुए मोतियों से किसी भी अवशिष्ट धोने बफर को हटाने के लिए 10 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करें। मोतियों को पूरी तरह से पुनर्उड करने के लिए 10 से 20 बार ऊपर और नीचे वॉश बफर तीन के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें।

संक्षेप में अपकेंद्रित्र से पहले कोमल भंवर के 30 सेकंड और आराम के 30 सेकंड के बीच बारी दो मिनट के लिए ट्यूब इनक्यूबेट । सुपरनेटेंट्स को एस्पिरेट करने के लिए ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर रखें और मनका के नमूनों को फिर से संक्षेप में अपकेंद्री करें। मोतियों से किसी भी अवशिष्ट धोने बफर को हटाने के लिए एक 10 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करें, जबकि वे रैक से ट्यूबों को हटाने और नाभिक मुक्त पानी प्रति ट्यूब के 20 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से खर्च करने से पहले चुंबकीय रैक में हैं ।

फिर यह सुनिश्चित करने के लिए 10 बार मोतियों को पिपेट करें कि ट्यूबों के किनारे पर अटके किसी भी मोतियों को फिर से निलंबित कर दिया गया है। यह निर्धारित करने के लिए एडाप्टर डिमर्स की उपस्थिति का मूल्यांकन किया जाना चाहिए कि अतिरिक्त सफाई आवश्यक है या नहीं। उदाहरण के लिए, यह इलेक्ट्रोफेरोग्राम एडाप्टर डाइमर का एक स्वीकार्य स्तर दिखाता है जो 128 आधार जोड़े के आसपास एक तेज चोटी के रूप में दिखाई देता है जबकि यह इलेक्ट्रोफेरोग्राम एडाप्टर डाइमर का अस्वीकार्य स्तर दिखाता है।

प्रतिरक्षा प्रोफाइल पूर्व और उपचार के बाद इस प्रतिनिधि विश्लेषण के रूप में ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट पर एक विशिष्ट चिकित्सा के प्रभाव को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जिसके लिए ब्याज की प्रत्येक प्रतिरक्षा कोशिका के लिए प्रतिशत में परिवर्तन और कुल प्रतिरक्षा सामग्री एक ही रोगी के लिए पूर्व और बाद कीमोथेरेपी दिखाया जाता है । इस विश्लेषण में, रोगी समूहों के बीच नमूनों के उपचार के बाद रोग प्रगति के लिए अपने समय के अनुसार तुलना की गई । रोगियों के एक सबसेट 18 महीने के बाद रोग पुनरावृत्ति दिखाया, जबकि एक और सबसेट 18 या उससे कम महीनों में तेजी से प्रगति की ।

औसत डेल्टा मूल्य तो रोग प्रगति के ख्यात बायोमार्कर की पहचान करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए तुलना की जा सकती है । उदाहरण के लिए, यहां दो प्रतिरक्षा एस्केप जीन को नमूना समूहों के सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर के रूप में पहचाना गया था। क्योंकि व्यक्तिगत जीन बायोमार्कर स्पष्ट सांख्यिकीय महत्व के साथ मजबूत थे, बहुआयामी बायोमार्कर ने महत्वपूर्ण भविष्य कहनेवाला मूल्य नहीं जोड़ा।

नमूना ठंडा करने को रोकने के लिए एक समय में गर्म धोता एक पट्टी प्रदर्शन करने के लिए सुनिश्चित करें और बंद लक्ष्य संदूषण से बचने के लिए ताजा ट्यूबों के लिए मोती हस्तांतरण करने के लिए याद है । यह प्रोटोकॉल प्रतिरक्षा कोशिकाओं और ट्यूमर ऊतक की मात्रा निर्धारित करने के लिए जीन अभिव्यक्ति मॉडल के उपयोग को दर्शाता है। थकावट या सक्रियण जैसे सेल राज्यों को मापने के लिए नए मॉडल विकसित किए जा रहे हैं।