Name: testing targeted therapies in cancer using structural dna alteration analysis and patient-derived xenografts
Uploaded: 2020-07-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts at JoVE.com

メイヨークリニック個人医学センター(CIM)のリン・ヤン博士とフェイ・R・ハリスさん(MS)のメンバーに、実験の支援をいただきありがとうございます。この作品は、ニール・E・エックルズ夫妻のメイヨー個別医療センターへの贈り物によって支えられました。

卵巣癌の同意された患者からの新鮮な組織は、メイヨークリニック機関審査委員会(IRB)によって承認されたプロトコルに従って、脱バルク手術の時点で収集されました。このプロトコルで使用されるすべての動物の手順と治療は、メイヨークリニックの施設動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認され、動物ケアガイドラインに従いました。
1. 合致ペアのシーケンシング?...

我々は、検査のための最良の選択薬を決定するためにゲノムプロファイリングによって得られる腫瘍の分子特性を利用するPDXモデルで「臨床試験」を行うために使用したアプローチとプロトコルを説明する。現在、全ゲノムシーケンシング、RNAseq、カスタマイズされた遺伝子パネルを含む原発性腫瘍のゲノム特性解析には、複数のシーケンシングプラットフォームが使用されています。高品?...

患者由来の異種移植片(PDXs)は、患者の腫瘍片を免疫不全マウスに移植して生成し、パーソナライズされた抗癌ケアを支援する強力な前臨床モデルとして登場した。PDXモデルは、さまざまなヒト悪性腫瘍のために開発に成功しています。これらには、乳癌および卵巣癌、悪性黒色腫、大腸癌、膵臓腺癌、および非小細胞肺癌11、2、3、4、52,3,4,5が含まれる。腫瘍組織は、異所性または異所性に移植することができる。前者は、より正確であるが技術的に困難であると考えられ、腫瘍起源の器官に直接移植することを含む。これらのタイプのモデルは、腫瘍,6,7の「自然」微小環境のために、元の腫瘍の組織学を正確に模倣すると考えられている。例えば、マウス卵巣のブルサへの異形性移植は、腹腔への腫瘍の播種および腹水の産生をもたらし、卵巣癌8の典型的な。同様に、腹部乳腺の代わりに胸部腫瘍を胸部に注入すると、PDXの成功率と行動9に影響を及した。しかし、直交性のモデルには、腫瘍の成長を監視するための高度なイメージングシステムが必要です。固形腫瘍の異所性移植は、典型的には、腫瘍の成長の容易なモニタリングを可能にし、より安価で時間のかかるマウスの皮下側面に組織を移植することによって行われる7。しかしながら、皮下に成長した腫瘍は、正交性移植10の場合に観察されたように転移することはほとんどありません。
生着の成功率は、腫瘍の種類によって異なり、大きく依存することが示されている。より高い割合の腫瘍細胞を含むより積極的な腫瘍および組織標本は、より良い成功率12,13,13を有することが報告された。これと一致して、転移部位に由来する腫瘍は50〜80%の頻度で生着することが示され、原発部位からの腫瘍は14%の低い頻度で生着する。対照的に、壊死細胞を含む組織は、生存可能な腫瘍細胞が少ないが、生着が悪い。腫瘍増殖はまた、元の腫瘍の特性を損なうことなくマウス14への注入時の組織ミックスに基膜マトリックスタンパク質を加えることによって促進することができる。移植を目的とした組織片の大きさと数は、生着の成功率に影響を与えることも判明した。より大きな腫瘍取り速度は、元の腫瘍間質を維持し、宿主間質細胞を提供するサブ腎嚢の能力による皮下移植と比較して、腎臓下のカプセルへの移植のために報告された。
ほとんどの研究は、NOD/SCID免疫不全マウスを使用し、これはナチュラルキラー細胞16を欠き、他の株14と比較して腫瘍の生着、成長および転移を増加させることが示されている。しかし、13歳の早い時期に3~4ヶ月の間に胸腺リンパ腫を発症する可能性があるため、追加のモニタリングが必要である。SCIDマウスで増殖した卵巣腫瘍移植では、B細胞の成長はリツキシマブによって正常に阻害され、リンパ腫の発症を予防するが、卵巣腫瘍17の生着に影響を与えない。
最近では、NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)マウスは、インターロイキン2受容体γ鎖18をコードする遺伝子にヌル突然変異を運び、PDXモデルの生成に頻繁に使用される株となった。確立されたPDXモデルからマウスの将来の世代に継代された腫瘍は、3〜6世代の19、20,20の組織学的および分子特性を保持すると報告されている。多くの研究は、PDXモデルの治療結果が,対応する患者2、3、4、21、22、233,の患者のものを模倣することを示,21,22している。2423非小肺癌および大腸癌に対するPDXモデルにおける化学療法に対する応答率は、同じ薬剤24,25,25の臨床試験におけるそれと同様であった。臨床試験に登録された患者のために開発されたPDXモデルで行われた研究は、対応する患者22、3、43で臨床的に観察されたものと同様の試験薬に対する応答を実証した。
PDXモデルと組み合わせた患者腫瘍のハイスループットゲノム解析は、特定のゲノム変化と治療応答との間の相関関係を研究するための強力なツールを提供します。これらはいくつかの出版物26,27,27に記載されている。例えば、EGFR阻害剤セツキシマブに対する治療応答は、EGFR増幅を担う大腸PDXモデルのセットにおいて、患者28におけるセツキシマブに対する並行した臨床的応答である。
PDX モデルの開発と適用に関連するいくつかの課題があります。その中には、PDX内でより高い増殖能力を有する単一細胞クローンとしての治療応答解釈の精度を損なう可能性のある腫瘍不均一性29、30,30が、他のもの31を上回ることができ、したがって異質性の喪失をもたらす。さらに、PDXの開発に単一腫瘍生検を使用すると、細胞集団の一部が見逃され、最終的な移植片では表されない。この問題を解決するために、同じ腫瘍からの複数のサンプルが移植に推奨されます。PDX腫瘍は、元のドナー腫瘍のすべての細胞型を含む傾向があるが、これらの細胞は、マウス起源3のものに徐々に置換される。PDXモデルにおけるマウス間質とヒト腫瘍細胞の相互作用はよく理解されていない。それにもかかわらず、間質細胞は腫瘍微小環境33を再現することが示された。
これらの制限にもかかわらず、PDXモデルは、患者の治療を選択するための個別化された医療だけでなく、翻訳研究のための最も貴重なツールの一つです。PDXの主な用途には、バイオマーカーの発見と薬物検査が含まれます。PDXモデルは薬剤耐性メカニズムの研究や薬剤耐性34、35,35を克服するための戦略を特定するためにもうまく使用される。本稿に記載されているアプローチは、研究者がヒト腫瘍における潜在的な治療標的を同定し、最初に属的に特徴付けられた生着腫瘍を収容するマウスにおいて生体内の対応する薬物の有効性を評価することを可能にする。プロトコルは、腹腔,内に生着した卵巣腫瘍を使用するが、マウス2、3、123で成長するのに十分2に積極的なあらゆるタイプの腫瘍に適用可能である。12

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>3M, Co.</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AKT antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td>
			<td>9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH antibody(G-9)</td>
			<td>Santa Cruz Biotech. Inc.</td>
			<td>sc-365062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAPK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td>
			<td>9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-AKT antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td>
			<td>9271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mTOR antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td>
			<td>2972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Phospho-mTOR antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td>
			<td>2971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Phospho-S6 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td>
			<td>4858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rictor antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td>
			<td>2114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-S6 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td>
			<td>2217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Captisol</td>
			<td>ChemScene, Inc.</td>
			<td>cs-0731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboplatin</td>
			<td>NOVAPLUS, Inc.</td>
			<td>61703-360-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme</td>
			<td>Agilent, Inc.</td>
			<td>600404-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant</td>
			<td>Cardinal Healthcare</td>
			<td>82-280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning, Inc.</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s media</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>10-050-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MK-2206</td>
			<td>ApexBio, Inc.</td>
			<td>A3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MK-8669</td>
			<td>ARIAD Pharmaceuticals, Inc.</td>
			<td>AP23573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair Sensitive Skin</td>
			<td>Church &#38; Dwight Co.</td>
			<td>Nair Hair Remover Shower Power Sensitive</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD/SCID mice</td>
			<td>Charles River, Inc.</td>
			<td>NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>NOVAPLUS, Inc.</td>
			<td>55390-304-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG400</td>
			<td>Millipore Sigma, Inc.</td>
			<td>88440-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perjeta</td>
			<td>Genetech, Co.</td>
			<td>Pertuzumab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rituximab</td>
			<td>Genetech, Co.</td>
			<td>Rituxan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCID mice</td>
			<td>Harlan Laboratories, Inc.</td>
			<td>C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLAx 13-6MHz linear transducer</td>
			<td>FUJIFILM SonoSite, Inc</td>
			<td>HFL38xp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SonoSite S-series Ultrasound machine</td>
			<td>FUJIFILM SonoSite, Inc</td>
			<td>SonoSite SII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Millipore Sigma, Inc.</td>
			<td>P4780-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

testing targeted therapies in cancer using structural dna alteration analysis and patient-derived xenografts

ここでは、次世代シーケンシングテクノギー、治療対象分析、患者由来異種移植片(PDX)を用いた薬物応答モニタリングを組み合わせた標的療法の有効性をテストするための統合的なアプローチを紹介します。この戦略は、例として卵巣腫瘍を使用して検証されました.mate ペア次世代シーケンシング(MpPeq)プロトコルは、構造変化を特定し、その後、潜在的に標的可能な変更の分析に使用されました。免疫不全マウスで増殖したヒト腫瘍は、ゲノム解析に基づいて選択された薬物で治療した。結果は、PDXモデルにおける予測応答と観測応答との間の良好な相関を示した。提示されたアプローチは、組み合わせ治療の有効性をテストし、特に標準的な治療が失敗し、ラベル外の薬物を使用する必要がある場合に、再発癌患者のためのパーソナライズされた治療を支援するために使用することができる。

脱バルク手術時に切除された卵巣腫瘍からの組織をIRBガイダンスに従って採取し、1)遺伝子組み換えおよび2)免疫不全マウスにおける生着に使用した(図1)。Mateペアシーケンシングプロトコル36,37は36、損失、利益および増幅を含むDNAの構造的変化を同定するために使用された。1つの腫瘍におけるゲノム変化の風景を示す代表的?...

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Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

ここでは、腫瘍のゲノム構成に基づいて選択された標的療法の有効性を試験するプロトコルを提示する。このプロトコルは、構造的DNA再構成の同定と検証、患者の腫瘍のマウスへの生着、および対応する薬物に対する応答のテストを記述する。

構造DNA改変解析と患者由来異種移植片を用いたがんの標的治療の試験

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

ここで説明するプロトコルは、生体内癌モデルを用いて治療効果をテストするためのアルゴリズムを実証することを目的としている。プロトコルは、いくつかの手法の組み合わせで構成されています。ヒト腫瘍標本の全ゲノムバイオシーケンシングは、ゲノム変化を同定するために使用される。これらには、遺伝子の再調整と遺伝子コピー数の変化の両方が含まれる。したがって、特定された変更の分析は、潜在的に薬物可能な変化を選択するために行われます。ゲノム解析に基づいて選択された薬物は、免疫不全マウスで増殖した対応する腫瘍のインビボ治療に使用される。開発されたアルゴリズムは、がん患者のケアのための治療決定を支援するための有望なアプローチを表しています。パンダツールまたは類似のソフトウェアを使用して、ターゲット可能な変更を特定します。標準的な遺伝子シンボルを使用して単純なタブの区切りファイルとして生じた微小配列決定によって同定された遺伝子をリストアップすることができます。テーブルヘッダーがソフトウェアの経路レベルUに転送されるように、リストのヘッダラインにポンド記号を追加します。対応するナビゲーションタブをクリックしてファイルをアップロードします。選択したアイコンをクリックし、[ファイナライズ] タブをクリックして、基になるデータを表す 1 つのアイコンを割り当てます。患者ファイルがアップロードされたら、ページをプレビューして、経路ごとのアポイントト付き遺伝子数を表示する列を特定します。これは、右側の最後の列です。メイン ウィンドウの左上にある経路フィルターを使用して、表示される経路の数を、対象の遺伝子を含むものに制限します。偶然に予想されるよりも多くの遺伝子に注意を付けた経路を特定するには、濃縮タブの下にある関数を使用します。その後、フィッシャーの正確検定の対応するp値を示すメインテーブルに列が追加されます。メイン ウィンドウの左側にある適切なアイコンをチェックして、事前設定アノテーションから潜在的な薬物性遺伝子を表示するデータベースを選択します。ビジュアライゼーション用の経路を選択するには、経路ビューアページに表示されている名前をクリックします。各アノテーションセットを表すアイコンが、関連するジーンの横に表示されます。経路内の任意の遺伝子をクリックすると、対応する遺伝子カードページが開きます。関心のある遺伝子と、さらなる分析のための潜在的な薬物のヒットを示した経路を選択します。滅菌状態を維持するために層流フードで組織作業を行います。抗生物質を含む冷たいPBSまたは組織培養培地(RPMI、DMEMなど)を含む皿に腫瘍組織を置く。病理学者の助けを借りて、隣接する正常および壊死組織から生存可能な腫瘍材料を同定し、単離する。生殖不能鉗子およびメスを使用して、病理学者によって指摘された壊死性物質を除去する。皮下生着を行うために、滅菌鉗子、メスまたは手術用ハサミで腫瘍組織を小さな断片(およそ2×2×2ミリメートル)に切断する。断片化した組織を氷の上の冷やされたシャーレに移します。断片化した組織、組織の10個あたり約200マイクロリットルで皿に冷たいマトリゲルを入れます。よく混ぜて、組織断片をマトリゲルに10分間浸します。無菌の外科用ハサミと鉗子を使用して、マウスの両脇腹に5〜10ミリメートルの垂直皮膚切開を行います。ストレート鉗子を皮下空間にそっと挿入して、脂肪パッドの下に腫瘍片を置くのに十分な大きさのポケットを作ります。無菌ストレート鉗子を使用して、前に準備したポケットに腫瘍断片を5匹のマウスのそれぞれに挿入します。ティッシュ接着剤を使用して皮膚切開を閉じます。移植後、リンパ球増殖を阻害し、各マウスに100マイクロリットルのリツキシマブを注入する。背中の皮膚をつまんで後ろ向きに曲げて、マウスの頭と唇が固定されるようにして、マウスを経口ギャバジに備えます。プローブが食道に到達するまで、マウスの喉の後ろにガビンプローブを挿入します。マウスの肺が死を引き起こす可能性があるため、プローブが挿入されすぎないようにしてください。代表的なゲノムフロートは、1つの腫瘍におけるゲノム変化の景観を示す。高品位の血清型腫瘍に典型的な、青い線および損失の赤い線を複数得る、ゲノム不安定性の高いレベルを示す同定された。OC101腫瘍における治療介入の最も高い傾向変化は、HER2受容体をコードする遺伝子であるERBB2を含む染色体17での増幅であった。DNAレベルで結果を検証するために、増幅された領域の縁に対していくつかの特定のプライマーセットが設計されました。PCRを行った。ヒトDNAの制御を使用した場合、増幅産物は吸収されなかった。OC101腫瘍DNAについて特異的なバンドが同定された。別の変異型腫瘍、T14では、多数のDNA利益が観察された。これらには、RICTOR遺伝子にAKT2が含まれていました。タンパク質レベルで行われた検証は、イムノブロット法を用いて、RICTORにおいて高レベルのAKTを示した。腫瘍の負担の有意な減少は、第6週末までに化学療法処置群において観察された。併用治療を受けたグループだけでも化学療法に対する余分な利点があった。腫瘍組織は、治療試験終了時に治療応答の分子分析のために収集した。S6、AKT、およびmTORの合計およびリン酸化レベルは、免疫ブロット法を用いて決定した。未治療、化学療法、およびAKTまたはmTOR阻害剤で治療したこれらのタンパク質のレベルの比較は、後者の2つについて顕著な減少を示した。提示されたアプローチはPDXモデルの臨床試験を行うために非常に有用である。ゲノムプロファイリングによって得られる腫瘍の分子特性を利用して、検査のための最良の選択薬を決定する。

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Cancer Research

Unit 2

Cancer

SCIENTISTS IN ACTION

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

前臨床患者由来の腫瘍新規抗がん療法の調査のための異種移植モデルの開発とメンテナンス

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

がん研究

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

腫瘍の増殖と転移研究のためのトレーサブル記者との乳癌患者由来の異種移植片の標識

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

患者由来の軟部肉腫の主な文化の確立

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

フローサイトメトリーを診断とフォローで主に急性骨髄性白血病、白血病幹細胞患者由来異種での見積もりに

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

肉腫患者由来異種移植片からの腫瘍始発細胞の単離と特徴付け

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

胃癌患者由来異種移植片モデルおよび原発細胞株の確立

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

浸透マイクロ流体プラットフォームにおける患者由来異種移植片のEx vivo 3Dヒドロゲル培養の生存率の向上

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

ゼブラフィッシュにおける原発性腫瘍異種移植片の薬物スクリーニング

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

患者由来腫瘍オルガノイドを用いたイン ビトロ アッセイのハイスループット

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

EGFR変異型NSCLC患者由来オルガノイドにおける標的療法に対する感受性のプロファイリング

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...