Name: testing targeted therapies in cancer using structural dna alteration analysis and patient-derived xenografts
Uploaded: 2020-07-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts at JoVE.com

Vi tackar medlemmarna i Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Dr Lin Yang och Faye R. Harris, MS, för hjälp med att genomföra experiment. Detta arbete stöddes av Mr och Mrs Neil E. Eckles gåva till Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM).

Färska vävnader från samtyckande patienter med äggstockscancer samlades in vid tidpunkten för debulking kirurgi enligt ett protokoll som godkänts av Mayo Clinic Institutional Review Board (IRB). Alla djurförsök och behandlingar som används i detta protokoll godkändes av Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) och följde riktlinjerna för djurvård.
1. Parval sekvensering och analyser
OBS: Antingen färsk eller flash fryst vävnad må...

Vi beskriver den metod och protokoll som vi använde för att genomföra en "klinisk prövning" i PDX modeller som drar nytta av molekylära egenskaper hos tumör som erhålls genom genomisk profilering för att bestämma det bästa valet av läkemedel för testning. Flera sekvenseringsplattformar används för närvarande för genomisk karakterisering av primära tumörer inklusive hela genomsekvensering, RNAseq och anpassade genpaneler. För hög kvalitet serösa äggstockscancer carcinom, MPseq att identifiera struktu...

Patient-derived xenografts (PDXs), som genereras från implantation av patienten tumör bitar i immunodeficient möss, har dykt upp som en kraftfull preklinisk modell för att hjälpa personlig anti-cancer vård. PDX-modeller har framgångsrikt utvecklats för en mängd olika mänskliga maligniteter. Dessa inkluderar bröstcancer och äggstockscancer, malignt melanom, kolorektal cancer, bukspottskörteln adenokarcinom, och icke-småcellig lungcancer1,2,3,,4,5. Tumörvävnad kan implanteras ortopotopically eller heterotopically. Den förra, anses mer exakt men tekniskt svårt, innebär transplantation direkt i organ tumör ursprung. Dessa typer av modeller tros exakt efterlikna histologi av den ursprungliga tumören på grund av den "naturliga" mikromiljö för tumören6,7. Till exempel, orthotopic transplantation i bursa av musen äggstock resulterade i tumör spridning i bukhålan och produktion av ascites, typiska för äggstockscancer8. På samma sätt påverkade injektion av brösttumörer i bröstkorgen i stället för buken bröstkörteln PDX framgång och beteende9. Men orthotopic modeller kräver sofistikerade bildsystem för att övervaka tumörtillväxt. Heterotopic implantation av solid tumör utförs vanligtvis genom implantering vävnad i subkutan flanken av en mus som möjliggör enklare övervakning av tumörtillväxt och är billigare och tidskrävande7. Tumörer som odlas subkutant sällan metastaserar dock till skillnad från vad som observerats vid tandpetitisk implantation10.
Framgången för engraftment har visat sig variera och i hög grad beror på tumörtypen. Mer aggressiva tumörer och vävnadsprover som innehåller en högre procent av tumörceller rapporterades ha bättre framgångpriser 12,13. Överensstämmer med detta, tumörer som härrör från ögonbevarande platser visade sig engraft vid frekvenser på 50-80%, medan de från primära platser engraft vid frekvenser så lågt som 14%12. Däremot vävnad som innehåller nekrotiska celler och färre livskraftiga tumörceller engraft dåligt. Tumörtillväxt kan också främjas genom tillsats av källarmembranmatrisproteiner i vävnadsblandningen vid tidpunkten för injektionen i möss14 utan att kompromissa med egenskaperna hos den ursprungliga tumören. Storleken och antalet vävnadsbitar avsedda för implantation befanns också påverka framgången för engraftment. Större tumör ta-priser rapporterades för implantation i sub-renal kapseln jämfört med subkutan implantation på grund av förmågan hos sub-renal kapseln för att upprätthålla den ursprungliga tumör stroma och ge värden stromal celler samt15.
De flesta studier använder NOD/SCID immunbrist möss, som saknar naturliga mördarceller16 och har visat sig öka tumör engraftment, tillväxt och metastasering jämfört med andra stammar14. Ytterligare övervakning krävs dock eftersom de kan utveckla thymic lymfom så tidigt som 3-4 månaders ålder13. Vid äggstockstumörtransplantationer som odlas i SCID-möss hämmades utväxten av B-celler framgångsrikt av rituximab, vilket förhindrade utvecklingen av lymfom men utan att påverka instämningen av äggstockstumörer17.
På senare tid har NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) möss, bär en null mutation i genen kodning interleukin 2 receptorn gamma kedjan18, blev en ofta använd stam för generering av PDX modeller. Tumörer från etablerade PDX modeller passage till framtida generationer av möss rapporteras att behålla histologiska och molekylära egenskaper för 3 till 6 generationer19,20. Många studier har visat att behandlingsresultaten i PDX-modeller efterliknar behandlingsresultaten hos deras motsvarande patienter2,,3,,4,,21,22,23. Svarsfrekvensen på kemoterapi i PDX-modeller för icke-små lungcancer och kolorektal carcinom liknade den i kliniska prövningar för samma läkemedel24,25. Studier som utförts i PDX-modeller, utvecklade för patienter som rekryterats i kliniska prövningar, visade på svar på testade läkemedel liknande dem som observerats kliniskt hos motsvarande patienter2,,3,4.
Genomiska analyser med hög genomströmning av en patienttumör tillsammans med PDX-modeller ger ett kraftfullt verktyg för att studera korrelationer mellan specifika genomiska förändringar och ett terapeutiskt svar. Dessa har beskrivits i några publikationer26,27. Till exempel, terapeutiska svar på EGFR-hämmare cetuximab i en uppsättning kolorektal PDX modeller som bär EGFR förstärkning, parallella kliniska svar på cetuximab hos patienter28.
Det finns några utmaningar i samband med utveckling och tillämpning av PDX-modeller. Bland dessa är tumör heterogenitet29,30 som kan äventyra noggrannheten i behandling svar tolkning som en enda cell klon med högre proliferative kapacitet inom en PDX kan växa ur de andra31, vilket resulterar i en förlust av heterogenitet. Dessutom, när enda tumör tarmbiopsier används för att utveckla PDX, kan några av cellpopulationerna missas och kommer inte att vara representerade i det slutliga transplantatet. Flera prover från samma tumör rekommenderas för implantation för att lösa detta problem. Även om PDX tumörer tenderar att innehålla alla celltyper av den ursprungliga givaren tumör, dessa celler gradvis ersättas av de av murint ursprung3. Samspelet mellan murine stroma och mänskliga tumörceller i PDX-modeller är inte väl förstått. Ändå visades stromal celler att rekapitulera tumör mikromiljö33.
Trots dessa begränsningar är PDX-modeller fortfarande bland de mest värdefulla verktygen för translationell forskning samt personlig medicin för att välja patientterapier. Större tillämpningar av PDXs inkluderar biomarkör upptäckt och drogtester. PDX-modeller används också framgångsrikt för att studera läkemedelsresistens mekanismer och identifiera strategier för att övervinna läkemedelsresistens34,35. Den metod som beskrivs i det aktuella manuskriptet gör det möjligt för forskaren att identifiera potentiella terapeutiska mål i mänskliga tumörer och att bedöma effekten av motsvarande läkemedel in vivo, hos möss som hyser engrafted tumörer som ursprungligen genomiskt karakteriserades. Protokollet använder äggstockstumörer engrafted intraperitoneally men är tillämplig på alla typer av tumör tillräckligt aggressiva för att växa i möss2,3,12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>3M, Co.</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-AKT antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td>
			<td>9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH antibody(G-9)</td>
			<td>Santa Cruz Biotech. Inc.</td>
			<td>sc-365062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAPK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td>
			<td>9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-AKT antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td>
			<td>9271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mTOR antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td>
			<td>2972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Phospho-mTOR antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td>
			<td>2971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Phospho-S6 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td>
			<td>4858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rictor antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td>
			<td>2114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-S6 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td>
			<td>2217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Captisol</td>
			<td>ChemScene, Inc.</td>
			<td>cs-0731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboplatin</td>
			<td>NOVAPLUS, Inc.</td>
			<td>61703-360-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme</td>
			<td>Agilent, Inc.</td>
			<td>600404-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant</td>
			<td>Cardinal Healthcare</td>
			<td>82-280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning, Inc.</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s media</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>10-050-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MK-2206</td>
			<td>ApexBio, Inc.</td>
			<td>A3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MK-8669</td>
			<td>ARIAD Pharmaceuticals, Inc.</td>
			<td>AP23573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair Sensitive Skin</td>
			<td>Church &#38; Dwight Co.</td>
			<td>Nair Hair Remover Shower Power Sensitive</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD/SCID mice</td>
			<td>Charles River, Inc.</td>
			<td>NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>NOVAPLUS, Inc.</td>
			<td>55390-304-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG400</td>
			<td>Millipore Sigma, Inc.</td>
			<td>88440-250ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perjeta</td>
			<td>Genetech, Co.</td>
			<td>Pertuzumab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rituximab</td>
			<td>Genetech, Co.</td>
			<td>Rituxan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCID mice</td>
			<td>Harlan Laboratories, Inc.</td>
			<td>C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLAx 13-6MHz linear transducer</td>
			<td>FUJIFILM SonoSite, Inc</td>
			<td>HFL38xp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SonoSite S-series Ultrasound machine</td>
			<td>FUJIFILM SonoSite, Inc</td>
			<td>SonoSite SII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Millipore Sigma, Inc.</td>
			<td>P4780-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

testing targeted therapies in cancer using structural dna alteration analysis and patient-derived xenografts

Vi presenterar här en integrativ metod för att testa effekten av riktade terapier som kombinerar nästa generations sekvensering technolo-gies, terapeutiska mål analyser och läkemedelsrespons övervakning med hjälp av patienten härledda xenografts (PDX). Denna strategi validerades med hjälp av äggstockscancer tumörer som ett exempel. Mate-pair nästa generations sekvensering (MPseq) protokollet användes för att identifiera strukturella förändringar och följt av analys av potentiellt targetable ändringar. Mänskliga tumörer som odlas i immunkomprometterade möss behandlades med läkemedel som valts ut baserat på de genomiska analyserna. Resultaten visade ett bra samband mellan de förväntade och de observerade svaren i PDX-modellen. Den presenterade metoden kan användas för att testa effekten av kombinationsbehandlingar och stöd personlig behandling för patienter med återkommande cancer, särskilt i de fall då standardbehandling misslyckas och det finns ett behov av att använda läkemedel off label.

Vävnad från resected äggstockstumörer vid tidpunkten för debulking operationer samlades in i enlighet med IRB vägledning och används för 1) genomisk karakterisering och 2) engraftment i immunkomprometterade möss (figur 1). Mate-pair sekvensering protokoll36,37 användes för att identifiera strukturella förändringar i DNA inklusive förluster, vinster och förstärkningar. Ett representativt genomområde som illustrerar et...

Watch this Scientific Journal Video about Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts at JoVE.com

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Här presenterar vi ett protokoll för att testa effekten av riktade terapier som valts ut baserat på genomisk makeup av en tumör. Protokollet beskriver identifiering och validering av strukturella DNA-omorganiseringar, engraftment av patienternas tumörer i möss och testa svar på motsvarande läkemedel.

Testa riktade terapier i cancer med strukturell DNA-ändringsanalys och patientbaserade Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Det protokoll som beskrivs här syftar till att visa en algoritm för testning behandling effekt med hjälp av in vivo cancer modeller. Protokollet består av en kombination av flera tekniker. Hela genomet bio-sekvensering av mänskliga tumör exemplar används för att identifiera genomiska förändringar.Dessa inkluderar både gen rearrangements och genförändringar kopia nummer. Så analysen av identifierade ändringar utförs för att välja potentiellt druggable förändringar. De läkemedel som väljs ut baserat på genomisk analys används sedan för in vivo behandling av motsvarande tumörer som odlas i immunkomprometterade möss.Den utvecklade algoritmen representerar ett lovande tillvägagångssätt för att hjälpa till att fatta beslut om vård av cancerpatienter. Använd Panda-verktyget eller en analog programvara för att identifiera målbara ändringar. Vi kan lista de gener som identifierades av microsequencing resulterade som en enkel flik avgränsad fil med hjälp av standard accepterade gen symboler.Lägg till pund-tecknet i rubrikraden i listan för att säkerställa att tabellrubriken överförs till programvarans vägnivå U. Ladda upp filen genom att klicka på motsvarande navigeringsflik. Tilldela en enda ikon för att representera de underliggande uppgifterna genom att klicka på ikonen för val och klicka sedan på fliken.En gång sedan en patient filer laddas upp, förhandsgranska sidan för att identifiera en kolumn som visar antalet kommenterade gener per väg. Det här är den sista kolumnen till höger. Använd ett vägfilter i det övre vänstra hörnet av huvudfönstret för att begränsa antalet vägar som visas för de som innehåller de gener av intresse.För att identifiera vägar som har fler gener kommenterade än vad som skulle förväntas av en slump, använd en funktion som ligger under fliken anrikning. En kolumn läggs sedan till i huvudtabellen som visar motsvarande p-värde från en Fishers exakta test. Välj databasen för att visa potentiella druggable gener från förinställd anteckning genom att kontrollera en lämplig ikon till vänster i huvudfönstret.För att välja en väg för visualisering, klicka på dess namn visas i sidan väg och visning. Ikoner som representerar varje anteckningsuppsättning visas bredvid den associerade genen. Om du klickar på någon gen i vägen öppnas motsvarande genkortssida.Välj de vägar som visade kommenterade gener av intresse och träffar för potentiella läkemedel för vidare analys. Utför vävnadsarbetet i en laminär flödeshuva för att upprätthålla sterila förhållanden. Lägg tumörvävnaden i en maträtt som innehåller kalla PBS eller vävnadskultur media, såsom RPMI, DMEM, som innehåller antibiotika.Identifiera och isolera livskraftigt tumörmaterial från intilliggande normal och nekrotisk vävnad med hjälp från en patolog. Använd sterila tlyk och skalpell för att avlägsna nekrotiskt material som pekats ut av en patolog. För att utföra subkutan engraftment, skär tumörvävnaden med sterila tlyckor, skalpell eller kirurgisk sax i små fragment, ungefär 2 x 2 x 2 millimeter i storlek.Överför den fragmenterade vävnaden till en förkyld petriskål på is. Låt kall matrigel i skålen med den fragmenterade vävnaden, cirka 200 mikroliter per 10 vävnadsbitar. Blanda väl och låt vävnadsfragmenten suga i matrigelen i 10 minuter.Använd sterila kirurgiska sax och tärna för att göra en 5-10 millimeter vertikal hud snitt på båda flankerna av en mus. Sätt rakt tång försiktigt i det subkutana utrymmet för att skapa en ficka stor nog för en tumör fragment som ska placeras under fett pad. Använd sterila raka tång för att infoga tumörfragment i den tidigare förberedda fickan i var och en av fem möss.Stäng huden snitt med hjälp av vävnad lim. Efter implantation, att hämma lymfocyt spridning, injicera varje mus med 100 mikroliter av rituximab. Förbered musen för oral sondmatning genom att nypa huden på ryggen och böja den bakåt så att musens huvud och läppar immobiliseras.Sätt in sond i sond på baksidan av strupen på musen tills sonden når matstrupen. Se till att sonden inte sätts in för långt eftersom lungorna på musen kan perforera orsakar dödsfall. Den representativa arvsmassans flöte illustrerar landskapet av genomiska förändringar i en tumör.Typiska för högvärdigt serosubtype tumörer, flera vinster blå linjer och förluster röda linjer, identifierades som anger höga nivåer av genomisk instabilitet. Den översta trenden förändring för terapeutiska ingripande i OC101 tumör var en förstärkning vid kromosom 17, med ERBB2, en gen som koder för HER2 receptorn. För att validera resultaten på DNA-nivån utformades flera uppsättningar specifika primers för kanterna av den förstärkta regionen.Och PCR genomfördes. Ingen förstärkning produkt absorberades när kontroll mänskliga DNA användes. Specifika band identifierades för OC101 tumör DNA.I en annan variant tumör, T14, observerades många DNA vinster. De inkluderade AKT2 i RICTOR-gener. Validering som utförts på proteinnivå, med hjälp av immunoblotting visade höga nivåer av AKT i RICTOR.En signifikant minskning av tumörbördan observerades i kemoterapi behandlade gruppen i slutet av vecka sex. Det fanns en extra fördel över kemoterapi ensam i de grupper som fick en kombinationsbehandling. Tumörvävnad samlades in för molekylär analys av behandlingssvar i slutet av behandlingsstudien.Totala och fosforylerade nivåer av S6, AKT och mTOR fastställdes med hjälp av immunoblotting. Jämförelse av nivåerna av dessa proteiner i obehandlade, kemoterapi-behandlade, och behandlas med AKT eller mTOR hämmare visade en markant minskning för de två sistnämnda. Det presenterade tillvägagångssättet är mycket användbart för att genomföra den kliniska prövningen i PDX-modeller.Det drar fördel av molekylära egenskaper hos tumören som erhållits genom genomisk profilering för att bestämma det bästa valet av läkemedel för testning.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Cancer Research

Unit 2

Cancer

SCIENTISTS IN ACTION

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Utveckling och underhåll av en preklinisk patient Derived Tumör xenograft modell för undersökning av nya anti-cancerterapier

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Märkning av bröstcancerpatient som härrör xenografter med spår Reportrar för tumörtillväxt och metastas studier

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Inrättandet av en primär kultur av patientderiverade mjukdelssarkom

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flödescytometri för att uppskatta leukemi stamceller i primär akut myeloisk leukemi och i Patient-härrör-xenograft, vid diagnos och följa upp

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering och karakterisering av tumör-initiera celler från sarkom patient-derived xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Inrättande av patienter med Ventrikelhärledd xenograft-modell och primära cellinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Förbättrad livskraft för Ex vivo 3D Hydrogel Kulturer av patient-derived Xenografts i en Perfused mikrofluidisk plattform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Läkemedelsscreening av primär patient härledd tumör Xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

In vitro-analys med hög genomströmning med patient-härledda tumörorganoider

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Profileringskänslighet mot riktade terapier i EGFR-mutanta NSCLC patientbaserade organoider

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...