Name: assessment of acute wound healing using the dorsal subcutaneous polyvinyl alcohol sponge implantation and excisional tail skin wound models.
Uploaded: 2020-03-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models. at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare Kevin Carlson del Brown University Flow Cytometry and Sorting Facility per la consultazione e l'assistenza con esperimenti di citometria di flusso. Immagini in Figura 1B e C sono state create con BioRender. Kayla Lee e Gregory Serpa sono ringraziati per la loro assistenza fotografica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dei seguenti: Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Dean's Areas of Emerging New Science Award (Brown University), National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, National Institute of Environmental Science (NIES) T32-ES7272 (Formazione in Patologia Ambientale) e il Brown University Research Seed Award.

Tutti gli studi sugli animali qui descritti sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso istituzionale degli animali della Brown University e sono stati effettuati in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali dei National Institutes of Health.  NOTA: nel video, il drappo chirurgico è stato omesso a scopo dimostrativo.
1. Impianto sottocutaneo di spugne PVA
<ol><li>Utilizzare le forbici per tagliare fogli di spugna PVA in pezzi 8 mm x 8 mm x 4 mm. Reidratare i pezz...

<ol>
	<li>Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+use+in+wound+healing+research:+a+survey+focusing+on+in+vitro+and+in+vivo+adult+soft+tissue.">Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8 (2), 83-96 (2000).</li><li>Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modeling+Conundrum:+Murine+for+Cutaneous+Wound+Healing.">A Modeling Conundrum: Murine for Cutaneous Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).</li><li>Eming, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+influenza+A+virus+infection+leads+to+suppression+of+the+innate+immune+response+to+dermal+injury.">Pulmonary influenza A virus infection leads to suppression of the innate immune response to dermal injury.</a> PLOS Pathogens. 14 (8), 1007212 (2018).</li><li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+Techniques+Made+Simple:+Animal+Models+Healing.">Research Techniques Made Simple: Animal Models Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).</li><li>Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+skin+repair+in+humans+and+other+mammals.">Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals.</a> Journal of Cell Communication and Signaling. 10 (2), 103-120 (2016).</li><li>Falanga, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+Bone+Marrow-Derived+Cultured+Mesenchymal+Stem+Cells+Delivered+in+a+Fibrin+Spray+Accelerate+Healing+in+Murine+and+Human+Cutaneous+Wounds.">Autologous Bone Marrow-Derived Cultured Mesenchymal Stem Cells Delivered in a Fibrin Spray Accelerate Healing in Murine and Human Cutaneous Wounds.</a> Tissue Engineering. 13 (6), 1299-1312 (2007).</li><li>Lucas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Roles+of+Macrophages+in+Diverse+Phases+of+Skin+Repair.">Differential Roles of Macrophages in Diverse Phases of Skin Repair.</a> The Journal of Immunology. 184 (7), 3964-3977 (2010).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+function+and+fate+of+neutrophils+in+sterile+injury+and+repair.">Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair.</a> Science. 358 (6359), 111-116 (2017).</li><li>Mirza, R. 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J., Mustoe, T., Clark, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+wound+healing+in+aging+small+mammals:+a+systematic+review.">Cutaneous wound healing in aging small mammals: a systematic review.</a> Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 318-339 (2015).</li></ol>

Questo articolo descrive due modelli di ferite murine trattabili che consentono la valutazione della risposta di guarigione acuta della ferita. Il primo metodo prevede l'impianto chirurgico di spugne PVA nello spazio sottocutaneo dorsale. Questo approccio offre un netto vantaggio rispetto ai modelli di ferita basati sulla biopsia per studiare la risposta di guarigione cellulare della ferita a causa del gran numero di cellule e della quantità di fluidi della ferita ottenuti dalle spugne isolate. Per la riuscita esecuzion...

Ci sono molti sistemi modello murine disponibili per esaminare i processi di guarigione delle ferite, ognuno dei quali possiede vantaggi e limitazioni specifici1,2. I seguenti metodi presentano due modelli di ferite murine, ognuno dei quali affronta un particolare aspetto della risposta di guarigione della ferita e che può essere utilizzato per identificare la causa e l'effetto delle perturbazioni nella risposta alla lesione. Il processo di guarigione delle ferite avviene in fasi distinte. La prima fase è infiammatoria, caratterizzata dal rapido afflusso di piastrine, neutrofili e monociti/macrofagi, nonché dalla produzione di citochine infiammatorie e chemiochine. Dopo la risoluzione dell'infiammazione, l'ambiente passa a uno stato più riparativo con l'induzione di citochine profibrotiche e proangiogeniche e fattori di crescita. Il tessuto di granulazione si deposita e i neovessels si formano con la migrazione di miofibroblasti, fibroblasti, cellule epiteliali e cellule endoteliali. Nelle fasi finali, la matrice extracellulare provvisoria viene rimodellata e la formazione di cicatrici e la chiusura delle ferite procede2,3,4,5,6,7,8.
Nessun singolo modello murino fornisce un sistema per studiare tutte le fasi della guarigione delle ferite2. Qui vengono descritti due modelli chirurgici di ferita: uno chiarisce le risposte di guarigione della ferita cellulare e citochina acuta, e l'altro consente la valutazione della chiusura della ferita e delle analisi istologiche. Questi due metodi possono essere impiegati in modo complementare per valutare gli effetti di una perturbazione o comorbidità su diversi aspetti della risposta di guarigione della ferita. L'impianto sottocutaneo dorsale di spugne di alcool polivinile (PVA) è un sistema che è stato utilizzato nei modelli di roditori per decenni per chiarire numerosi aspetti delle risposte cellulari e granulare del tessuto9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24. Questo approccio consente il recupero di fluidi di ferita ricchi di citochine e infiltrati cellulari. In questo modello, 1 cm x 1 cm x 0,5 cm pezzi di spugna PVA vengono posti in tasche sottocutanee attraverso un'incisione di 2 cm fatta alla linea mediana posteriore. L'incisione è chiusa con clip chirurgiche e le spugne possono essere recuperate in momenti successivi per l'isolamento cellulare e fluido. L'ambiente cellulare e citochina delle spugne isolate riflette le normali fasi di guarigione acuta della ferita fino a circa 14 giorni di postimplantation. In momenti successivi il modello è più vantaggioso per lo studio della formazione del tessuto granulosa e della risposta del corpo estraneo1. Con questo sistema, è possibile isolare >106 cellule, che offre un netto vantaggio per i saggi fenotipici e funzionali e l'isolamento dell'RNA, rispetto alle cellule isolate da altri metodi basati sulla biopsia1,22,23,25,26.26
La velocità di chiusura della ferita è determinata utilizzando il modello di escissione della pelle della coda. In questo modello, come inizialmente descritto da Falanga et al. e riportato da altri27,28,29,30, una sezione di 1 cm x 0,3 cm di spessore pieno della pelle della coda viene rimosso vicino alla base della coda. L'area della ferita è facilmente visualizzabile e può essere misurata nel tempo. In alternativa, il tessuto della coda può essere isolato per l'analisi istologica. Questo approccio può essere utilizzato come alternativa o in combinazione con il metodo ben consolidato della biopsia del pugno dorsale. Le distinzioni principali tra questi due modelli sono il tasso di chiusura della ferita, la presenza o l'assenza di pelliccia, e la struttura della pelle2,31,32. Le ferite della pelle della coda offrono un lasso di tempo più lungo in cui valutare la chiusura della ferita, in quanto ci vogliono circa 21 giorni per la chiusura completa. Questo si oppone alle biopsie di pugno dorsale non sfuse, che guariscono molto più velocemente (7-10 giorni), principalmente con la contrazione dovuta all'azione del panniculus carnosus. Le biopsie di punzone dorsali sfumate guariscono più lentamente e diminuiscono gli effetti della guarigione contrattile, ma si basano sulla presenza di un corpo estraneo per limitare i meccanismi contrattili1,2,27,30,31,33.
I modelli di ferita descritti sono informativi per comprendere i normali processi di guarigione delle ferite in assenza di perturbazione. Mentre la guarigione della pelle dei roditori differisce in modo molto significativo dalla pelle umana, tra cui la struttura allentata, la dipendenza dalla guarigione contrattile e altre differenze anatomiche, il sistema murino offre alcuni vantaggi per gli studi meccanicistici e di screening. In primo luogo è la disponibilità di ceppi inbred e mutanti genetici, trattatibilità genetica, e costi inferiori. Le intuizioni meccanicistiche acquisite dagli studi murini possono essere tradotte in modelli animali complessi che imitano più da vicino la guarigione della pelle umana, come il sistema di suini2,31.
Oltre a esaminare le risposte di guarigione della ferita nello stato stabile, questi modelli possono essere combinati con condizioni comorbide per comprendere la base dei difetti di guarigione della ferita a livello cellulare, citochine e tessuto lordo. È in questa particolare impostazione che i due modelli possono essere utilizzati in concerto per valutare gli effetti di una particolare condizione comorbida, come la polmonite postoperatoria, sia sulla risposta di guarigione della ferita cellulare acuta30.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:709px;" width="709">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">10x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">BP3991</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">15 mL centrifuge tubes, Olympus</td>
			<td style="width:121px;">Genesee</td>
			<td style="width:104px;">28-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, &#8211;Phenol Red)</td>
			<td style="width:121px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">5ml Syringe</td>
			<td style="width:121px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Anti-mouse CD45.2-APC Fire750</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:104px;">109852</td>
			<td>Clone 104</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Anti-mouse F4/80-eFluor660</td>
			<td style="width:121px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">50-4801-82</td>
			<td>Clone BM8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Anti-mouse Ly6C-FITC</td>
			<td style="width:121px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:104px;">553104</td>
			<td>Clone AL-21</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710</td>
			<td style="width:121px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">46-9668-82</td>
			<td>Clone 1A8-Ly6g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Anti-mouse Siglec-F-APC-R700</td>
			<td style="width:121px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:104px;">565183</td>
			<td>Clone E50-2440</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier</td>
			<td style="width:121px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:104px;">NC9021392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm</td>
			<td style="width:121px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:104px;">NC9334081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Blender Bag, 80mL</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">14258201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Culture Tube, 16mL, 17x100</td>
			<td style="width:121px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:104px;">21-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Fetal Bovine Serum - Standard</td>
			<td style="width:121px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Fixable Viability Dye eFluor506</td>
			<td style="width:121px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">65-0866-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Hepes Solution, 1M</td>
			<td style="width:121px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:104px;">25-534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">ImageJ Software</td>
			<td style="width:121px;">NIH</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL)</td>
			<td style="width:121px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">Polyvinyl alcohol sponge - large pore size</td>
			<td style="width:121px;">Ivalon/PVA Unlimited</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>www.sponge-pva.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Povidone-iodine solution, 10%</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td>3955-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Spray barrier film, Cavilon</td>
			<td style="width:121px;">3M</td>
			<td style="width:104px;">3346E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Stomacher 80 Biomaster, 110V</td>
			<td style="width:121px;">Seward</td>
			<td style="width:104px;">0080/000/AJ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of acute wound healing using the dorsal subcutaneous polyvinyl alcohol sponge implantation and excisional tail skin wound models.

La guarigione delle ferite è un processo complesso che richiede la progressione ordinata dell'infiammazione, la formazione del tessuto granulosa, la fibrosi e la risoluzione. I modelli Murine forniscono preziose informazioni meccanicistiche su questi processi; tuttavia, nessun singolo modello affronta completamente tutti gli aspetti della risposta di guarigione della ferita. Invece, è ideale utilizzare più modelli per affrontare i diversi aspetti della guarigione della ferita. Qui vengono descritti due diversi metodi che affrontano diversi aspetti della risposta di guarigione della ferita. Nel primo modello, le spugne di alcool polivinile sono impiantate sottocutaneamente lungo il dorsum del topo. Dopo il recupero della spugna, le cellule possono essere isolate da interruzioni meccaniche e i fluidi possono essere estratti dalla centrifugazione, consentendo così una caratterizzazione dettagliata delle risposte cellulari e citochine nell'ambiente della ferita acuta. Una limitazione di questo modello è l'incapacità di valutare il tasso di chiusura della ferita. Per questo, viene utilizzato un modello di escissione della pelle della coda. In questo modello, un pezzo rettangolare di coda da 10 mm x 3 mm viene espulso lungo la superficie dorsale, vicino alla base della coda. Questo modello può essere facilmente fotografato per l'analisi planimetrica per determinare i tassi di guarigione e può essere assolto per l'analisi istologica. Entrambi i metodi descritti possono essere utilizzati in ceppi di topi geneticamente alterati, o in combinazione con modelli di condizioni comorbide, come diabete, invecchiamento o infezione secondaria, al fine di chiarire i meccanismi di guarigione della ferita.

Risposta infiammatoria sistemica dopo l'impianto di spugna PVA La chirurgia di impianto di spugna PVA ha generato una risposta infiammatoria sistemica, come dimostrato dall'induzione di IL-6 nel plasma 1 giorno dopo il ferimento (Figura 2A). Altre citochine infiammatorie, tra cui TNF-z e IL-1, così come una serie di chemiochine tra cui CCL2 e CXCL1 sono stati indotti sistemicamente nei primi 7 giorni di impianto di spugna post-PVA, e sono stati descritti altrove<sup clas...

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Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Qui vengono descritti due modelli di guarigione delle ferite murine, uno progettato per valutare le risposte di guarigione della ferita cellulare e citochina e l'altro per quantificare il tasso di chiusura della ferita. Questi metodi possono essere utilizzati con modelli di malattia complessi come il diabete per determinare i meccanismi di vari aspetti della scarsa guarigione delle ferite.

Valutazione della guarigione acuta delle ferite utilizzando l'impianto di spugna alcolica sottocutaneo dorsale e modelli di ferite cutanee della coda excisionali.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

Questi modelli possono essere implementati per valutare vari aspetti della risposta di guarigione delle ferite, tra cui cinetica cellulare e citochina e chiusura delle ferite. Il modello di spugna PVA consente il recupero di milioni di leucociti ferita per analisi fenotipiche e funzionali, mentre il modello di escissione della pelle della coda consente una facile visualizzazione delle ferite a lenta guarigione. La spugna PVA e i modelli di ferita da coda escisionali possono essere utilizzati in combinazione con condizioni di comorbilità, come diabete o polmonite, per comprendere il loro impatto sulla guarigione delle ferite.A dimostrare le procedure con Meredith Crane sarà Bill Henry, un assistente di ricerca del mio laboratorio. Prima di iniziare l'esperimento, utilizzare le forbici per tagliare fogli di spugna PVA in pezzi otto per otto per quattro millimetri. Reidratare i pezzi di spugna in PBS sterile in un bicchiere per 10 minuti prima dell'autoclave sterilizzando le spugne nel PBS.Quando le spugne si sono raffreddate, conservare le spugne immerse in PBS a quattro gradi Celsius. Il giorno della procedura, posizionare sei spugne per animale sperimentale in un piatto di coltura sterile in un cappuccio sterile a flusso laminare e confermare la mancanza di risposta al dito del dito in un topo anestetizzato, di otto-12 settimane, maschio, C57-Nero / 6. Chiedere a un assistente di utilizzare le tosatrici per rimuovere i capelli lungo il dorsum e la garza sterile per applicare due volte la soluzione di povidone-iodio all'area rasata, seguita da una singola applicazione al 70% di etanolo.L'assistente deve quindi trasferire il mouse su tende chirurgiche sterili posizionate su un tampone riscaldato. Indossando guanti sterili, utilizzare le flessione per allontanare la pelle dorsale dal tessuto sottostante e utilizzare forbici chirurgiche sterili per fare un'incisione di due centimetri lungo la linea mediana dorsale di circa due centimetri anteriore alla base della coda. Tenendo aperta l'incisione con forcep sterili, utilizzare forbici chirurgiche sterili, curve e con punta smussata per formare una tasca sottocutanea lungo il dorsum in una delle posizioni indicate nella figura.Una volta inserite le forbici, aprire e chiudere le punte due volte per formare una tasca abbastanza grande da contenere una spugna inserita. Una volta creata la tasca, utilizzare forbici chirurgiche sterili per spremere delicatamente una spugna PVA nel piatto di coltura per rimuovere il PBS in eccesso. Successivamente, sollevare la spugna di un angolo e, conducendo con l'angolo tenuto dalle forbici, posizionare la spugna nella tasca sottocutanea.Quando tutte e sei le spugne sono state posizionate come dimostrato, utilizzare forcep sterili per pizzicare la pelle dorsale incentrata insieme e chiudere l'incisione con due clip avvolte in acciaio inossidabile. Per l'isolamento del fluido della spugna PVA, da uno a 14 giorni dopo l'impianto, rimuovere le graffette chirurgiche e aprire l'incisione con pinza denta. Usa le forbici per estendere l'incisione lungo la linea mediana dorsale e usa le forcep per estrarre una spugna dalla tasca sottocutanea.Posizionare la spugna nella canna di una siringa da cinque millilitri annidata in un tubo di coltura da 16 millilitri sul ghiaccio e utilizzare le forbici per dissociare qualsiasi tessuto connettivo che rimane aderente alla superficie della spugna, se necessario. Quando tutte le spugne sono state estratte e trasferite come dimostrato, centrifugare il tubo di coltura per raccogliere il fluido della ferita. Per isolare le cellule dalle spugne PVA, dopo aver raccolto le spugne come appena dimostrato, posizionarle in un tubo conico da 15 millilitri contenente cinque millilitri di supporto di raccolta HBSS.Una volta raccolte tutte le spugne, decantare la sospensione della spugna in un sacchetto frullatore da 80 millilitri e appendere la borsa dal portello del frullatore a pale in modo che le pale colpiscino le spugne e il mezzo. Impostare il frullatore a pale in modo che sia alto per 60 secondi e premere start. Quando il frullatore si è fermato, spremere le spugne nella borsa per rilasciare completamente il mezzo e utilizzare una pipetta per trasferire il mezzo dal sacchetto del frullatore nel tubo da 15 millilitri.Regolare le impostazioni del frullatore a pale per correre per 30 secondi in alto e aggiungere cinque millilitri di mezzo alla borsa del frullatore. Ripetere il processo di stomaco altre due volte prima di centrifugare il tubo del mezzo raccolto. Un pellet rosso di cellule e globuli rossi dovrebbe essere visibile nella parte inferiore del tubo conico.Mescolare 900 microlitri di acqua distillata con le cellule per tre o cinque secondi prima di neutralizzare la llisi con 100 microlitri di 10x PBS e quattro millilitri di 1x PBS. Raccogliere le cellule per centrifugazione e rimosogliere il pellet di cellule bianche nel mezzo appropriato per l'analisi a valle. Per creare una ferita alla pelle della coda, dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi nell'anestetizzato, da otto a 12 settimane, maschio, topo C57-Black/6, utilizzare una garza sterile per applicare la soluzione di povidone-iodio due volte al sito chirurgico, seguita da un'applicazione del 70% di etanolo.Usando un marcatore permanente e un modello prefabbroto, traccia una sezione di 10 per tre millimetri sulla superficie dorsale della coda, a 10 millimetri dalla base della coda, e posiziona il mouse su tende chirurgiche sterili. Indossando guanti chirurgici sterili, utilizzare una lama di bisturi sterile per fare un'incisione a pieno spessore lungo i bordi destro, inferiore e sinistro dell'area della ferita. Usando forcep sterili, rimuovere la pelle asportata dalla coda e utilizzare forbici chirurgiche sterili per tagliare il bordo superiore dell'area della ferita.Utilizzare una garza sterile per applicare pressione sulla ferita per interrompere il sanguinamento e applicare una pellicola barriera spray sul letto della ferita. Quindi, fotografare le ferite da una distanza fissa a intervalli di tempo regolari e analizzare le fotografie mediante analisi planimetrica per determinare le misurazioni dell'area della ferita. La chirurgia implantare della spugna PVA genera una risposta infiammatoria sistemica, come dimostrato dall'induzione di IL-6 nel plasma un giorno dopo il mento.Il numero di cellule che possono essere recuperate dalle ferite di spugna del PVA aumenta nel tempo, con neutrofili, monociti e macrofagi che comprendono le popolazioni primarie di infiltrazione cellulare all'interno delle spugne. I neutrofili sono identificati come cellule ly6G-positive, Siglec-F-negative. Le cellule siglec-F-positive sono principalmente eosinofili.Gating sulle cellule Ly6G-negative, Siglec-F-negative permette l'identificazione di monociti e macrofagi F4/80-positivi. Le cellule F4/80-positive possono essere ulteriormente differenziate dalla loro espressione Ly6C per distinguere i monociti infiammatori ad alto contenuto di Ly6C e i macrofagi derivati da monociti Ly6C. Il modello di pelle della coda escisionale fornisce un'alternativa al metodo di biopsia del pugno dorsale della pelle per studiare la chiusura delle ferite in pelle soda priva di pelliccia densa.La chiusura della ferita può essere quantificata misurando l'area del letto della ferita nel tempo. La ferita della pelle della coda può anche essere osservata nella sezione trasversale mediante analisi istologiche attraverso la colorazione tricroma di H ed E e Masson. In queste immagini, i margini laterale della pelle accisa sono indicati dalle punte delle frecce sulla superficie dorsale della coda.Per comprendere la guarigione delle ferite allo stato stazionario, i composti terapeutici o gli interventi possono anche essere testati attraverso la loro iniezione direttamente nella spugna PVA o attraverso la consegna al letto della ferita della coda.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Ricerca

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