Name: efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells
Uploaded: 2020-03-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells a

Фрэнсис Миньо был поддержан стипендией, предоставленной Квебекской сетью респираторного здоровья и Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (CIHR), студентом из ФСКН и студентом из факультета по вопросам медицины и науки и Постдокторсал, Монреальский университет. Эта работа была поддержана председателем Госселин-Ламарре в области клинических исследований и Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (YBMOP-79544).

Все процедуры для животных были проведены в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными Исследовательского центра Hospitalier de l'Universit e Montr'al (CRCHUM).
1. Дизайн и генерация плазми...

<ol>
	<li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay.">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li><li>Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+stress+response.">The transcription stress response.</a> Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).</li><li>Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+in+mammalian+cells.">mRNA stability in mammalian cells.</a> Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li><li>Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serum+response+element+can+mediate+induction+of+c-fos+by+growth+hormone.">The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).</li><li>Harkin, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+GADD45+and+JNK/SAPK-dependent+apoptosis+following+inducible+expression+of+BRCA1.">Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1.</a> Cell. 97 (5), 575-586 (1999).</li><li>Formisano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+isoforms+of+the+Na+/Ca2++exchanger,+NCX1+and+NCX3,+constitute+novel+additional+targets+for+the+prosurvival+action+of+Akt/protein+kinase+B+pathway.">The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway.</a> Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).</li><li>Yin, D. X., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+expression+delays+drug-induced+apoptosis+but+does+not+increase+clonogenic+survival+after+drug+treatment+in+HeLa+cells.">BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells.</a> Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).</li><li>Johnstone, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+leukemia+protein+ELL:+evidence+for+a+role+in+the+regulation+of+cell+growth+and+survival.">Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).</li><li>Olotu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae+inhibits+purinergic+signaling+and+promotes+purinergic+receptor+P2Y2+internalization+in+alveolar+epithelial+cells.">Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).</li><li>Goldmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+alveolar+epithelial+cells+type+II+are+capable+of+TGFbeta-dependent+epithelial-mesenchymal-transition+and+collagen-synthesis.">Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ghrelin+ameliorates+the+human+alveolar+epithelial+A549+cell+apoptosis+induced+by+lipopolysaccharide.">Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emodin+suppresses+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+alveolar+epithelial+cells+through+Notch+signaling+pathway.">Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).</li><li>Cooper, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Term+Culture+of+the+A549+Cancer+Cell+Line+Promotes+Multilamellar+Body+Formation+and+Differentiation+towards+an+Alveolar+Type+II+Pneumocyte+Phenotype.">Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype.</a> PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).</li><li>Hirakata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+culture+systems+with+respiratory+epithelial+cells+for+evaluation+of+bacterial+invasiveness.">Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).</li><li>Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+functions+of+3'UTRs.">Regulatory functions of 3'UTRs.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).</li><li>Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lengthening+of+3'UTR+increases+with+morphological+complexity+in+animal+evolution.">Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution.</a> Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).</li><li>Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+epithelial+sodium+channels+to+alveolar+function+in+health+and+disease.">The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease.</a> Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).</li><li>Boncoeur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+epithelial+sodium+channel+activity+by+lipopolysaccharide+in+alveolar+type+II+cells:+involvement+of+purinergic+signaling.">Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).</li><li>Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+alveolar+epithelial+Type+I+and+Type+II+cells+from+rat+lungs.">Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells.">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).</li><li>Ke, S. H., Madison, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-directed+mutagenesis+by+single-tube+'megaprimer'+PCR+method.">Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).</li><li>Gossen, M., Bujard, H., Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. , (2001).</li><li>Migneault, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Transcriptional+Modulation+of+aENaC+mRNA+in+Alveolar+Epithelial+Cells:+Involvement+of+its+3'+Untranslated+Region.">Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).</li><li>Migneault, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modulation de la stabilit&#233; de l'ARNm alphaENaC dans les cellules &#233;pith&#233;liales alv&#233;olaires: d&#233;termination du r&#244;le des s&#233;quences 3' non traduites. , (2015).</li><li>Grzesik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+to+primary+alveolar+epithelial+cells+by+nucleofection.">Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).</li><li>Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+doxycycline-induced+cytotoxicity+on+human+bronchial+epithelial+cells.">Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells.</a> Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).</li><li>Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline+impairs+neutrophil+migration+to+the+airspaces+of+the+lung+in+mice+exposed+to+intratracheal+lipopolysaccharide.">Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide.</a> Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).</li><li>Hovel, H., Frieling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+doxycycline,+mezlocillin+and+clotrimazole+in+cell+culture+media+as+contamination+prophylaxis.">The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis.</a> Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+pathways+of+RNA+degradation.">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals.">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li></ol>

Низкий уровень трансфекции альвеолярных эпителиальных клеток в первичной культуре был серьезным ограничением для использования системы Tet-Off для оценки стабильности мРНК в этих клетках. Тем не менее, это ограничение было преодолено электропорации пипетки, что позволило 25-30% эффективн?...

Для определения периодов полураспада мРНК было разработано несколько методов. Метод распада пульса-погони, который использует помеченные мРНК, позволяет одновременно оценить большой пул мРНК с минимальными клеточными нарушениями. Тем не менее, этот подход не позволяет прямой оценки период полураспада одного гена стенограммы и не может быть реализован для изучения посттранскриптовой модуляции мРНК после стимуляции с факторами роста, ROS, alarmins, или воспаление1.
Использование ингибиторов транскрипции, таких как актиномицин D и аманитин, является относительно простым методом измерения кинетики деградации мРНК с течением времени. Одним из основных преимуществ этого подхода по сравнению с предыдущими методами (т.е. пульс-погони) опирается на способность непосредственно оценить период полураспада данной стенограммы и сравнить, как различные методы лечения могут повлиять на его деградации кинетики. Однако значительное пагубное воздействие ингибиторов транскрипции на физиологию клеток представляет собой основной недостаток подхода2. Действительно, ингибирование всей транскриптома клеток этими препаратами имеет негативный побочный эффект возмущения синтеза ключевых элементов, участвующих в стабильности мРНК, таких как микроРНК (миРНК), а также экспрессии и синтеза РНК-связывающих белков, которые важны для деградации и стабильности мРНК. Тяжелые возмущения транскрипции генов этими препаратами может поэтому artefactually изменить деградации кривые транскриптов.
Система индукции промоутера представляет собой третий подход к измерению период ы полураспада конкретной мРНК. Этот метод измеряет деградацию конкретной мРНК так же, как методы, которые используют ингибиторы транскрипции. Часто используются два типа индукционных систем: сывороточный сывороточный сик-фос-промоутер3 и индуцируемая система Tet-Off4. С системой c-fos, использование ингибиторов транскрипции, которые могут быть токсичными для клетки не требуется. Однако этот метод требует синхронизации клеточного цикла, что препятствует оценке фактической стабильности транскрипта во время межфазы5. В отличие от этого, система Tet-Off позволяет сильное выражение гена интереса (GOI) под контролем синтетического тетрациклина регулируется промоутер. Эта система требует присутствия двух элементов, которые должны быть cotransfected в клетку, чтобы быть функциональным. Первый плазмид (pTet-Off) выражает регулятивный белок tTA-Adv, гибридный синтетический транскрипционный фактор, состоящий из прокариотического репрессора TetR (от Escherichia coli), слитого с тремя транскрипционными трансформаторными доменами из вирусного белка HSV VP16. GOI клонируется в pTRE-Tight плазмид под контролем синтетического промоутера (PTight),включающего минимальную последовательность цитомегаловируса (CMV) промоутер сливается с семью повторами тетро оператора последовательности. Транскрипция гена вниз по течению PTight зависит от взаимодействия TetR с тетро. При наличии тетрациклина или его производного, доксициклина, репрессор TetR теряет свою близость к оператору тетро, что приводит к прекращению транскрипции4. Характеристики системы Tet-Off делают ее идеальной моделью для изучения специфического выражения мРНК в эукариотических клетках, избегая при этом потенциальных плейотропных эффектов, которые являются вторичными по отношению к отсутствию прокариотических регуляторных последовательностей в эукариотических клетках6. Как правило, вдвойне стабильные линии клеток Tet-Off (HEK 293, HeLa и PC12) используются с этой системой для интеграции копий регулятора и плазмидов реагирования для удобного доступа к управляемому экспрессии генов7,8,9.
Несколько моделей альвеолярных эпителиальных клеток в культуре были использованы для изучения клеточной и молекулярной биологии альвеолярного эпителия. В течение многих лет, исследователи широко использовали человека или грызунов первичных клеток10,11, а также увековеченные клеточные линии, такие как человека A549 или крысы RLE-6TN клетки12,13. Хотя они, как правило, менее пролиферативной и более трудной для культуры и трансфекта, альвеолярные эпителиальные клетки в первичной культуре остаются золотым стандартом для изучения функции и дисфункции альвеолярного эпителия в физиологических и патологических условиях. Действительно, увековеченные клеточные линии, такие как клетки A549, не обладают сложными характеристиками и фенотипами первичных клеток, в то время как альвеолярные эпителиальные клетки в первичной культуре переизгладируют основные свойства альвеолярного эпителия, в частности способность формировать поляризованный и плотный барьер14,15. К сожалению, эти клетки очень устойчивы к обычным методам трансфекции, таким как те, которые используют липосомы, что делает использование системы, индуцированной промоутером, такой как Tet-Off, очень трудно.
Посттранскриптовая модуляция мРНК является одним из наиболее эффективных методов быстрого модулирования экспрессии гена стенограммы16. Важную роль в этом механизме играет непереведенный регион mRNA 3'(3' UTR). Было показано, что, в отличие от 5' UTR, существует экспоненциальная корреляция между длиной 3' UTR и клеточной и морфологической сложности организма. Эта корреляция предполагает, что 3' UTR, как и мРНК кодирования регионов, был подвергнут естественному отбору, чтобы все более сложным посттранскриптонных модуляции на протяжении всей эволюции17. 3' UTR содержит несколько связывающих сайтов для белков и miRNAs, которые влияют на стабильность и перевод стенограммы.
В настоящей работе мы разработали инструмент для изучения роли высоко сохраненных доменов в 3' UTR GOI для контроля стабильности транскрипта. Мы сосредоточились на эпителиальном канале натрия, альфа-субъединице (ЗенаК), который играет ключевую роль в альвеолярной эпителиальной физиологии18. Альвеолярные эпителиальные клетки в первичной культуре были успешно преходяще трансинфицированы двумя компонентами системы Tet-Off, что позволяет изучать роль 3' UTR в стабильности мРНК с системой, которая минимально влияет на физиологию и метаболизм клеток по сравнению с использованием ингибиторов транскрипции с другими протоколами. Была разработана стратегия клонирования, чтобы дифференцировать экспрессию ГОИ от эндогенного гена с использованием неэндогенно выраженного эпитопа (V5). Реакция и регулятивные плазмиды затем были перенесены в альвеолярные эпителиальные клетки с использованием техники электропорации пипетки. Впоследствии экспрессия транскрипта измерялась путем инкубации клеток доксициклином с разными интервалами времени. Период полураспада стенограммы был оценен RT-qPCR с помощью модифицированного метода Cq с использованием трансинфицированного продукта tTA-Ad mRNA для нормализации. В рамках нашего протокола мы предлагаем удобный способ изучения посттранскрипционной модуляции стенограммы в различных условиях и более подробного определения участия непереведенных регионов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actinomycin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-LineHemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0197S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, Amplification Grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excella E25 ConsoleIncubatorShaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>1220G76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES pH 7.3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51026420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61100103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4360954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51025413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-exU electrophoresis system</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>AD140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System Starter Pack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C854003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3 vector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V790-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTet-Off Advanced vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTRE-Tight vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified alveolar epithelial cells</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4485697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat TNF-alpha Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>510-RT-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Septra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0371S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18090010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tet System Approved FBS</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Molecular biology Grade</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>809-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells

Изучение посттранскриптона регулирования имеет основополагающее значение для понимания модуляции данной РНК-мессенджера (мРНК) и ее влияния на гомеостаз клеток и обмен веществ. Действительно, колебания в выражении стенограммы могут изменить эффективность перевода и, в конечном счете, клеточную активность стенограммы. Несколько экспериментальных подходов были разработаны для изучения период полураспада мРНК, хотя некоторые из этих методов имеют ограничения, которые препятствуют надлежащему изучению посттранскриптонной модуляции. Система индукции промотора может выразить ген интереса под управлением синтетического тетрациклина-регулируемого промоутера. Этот метод позволяет полураспада оценки данного мРНК при любом экспериментальном состоянии без нарушения гомеостаза клеток. Одним из основных недостатков этого метода является необходимость трансфектных клеток, что ограничивает использование этого метода в изолированных первичных клетках, которые очень устойчивы к обычным методам трансфекции. Альвеолярные эпителиальные клетки в первичной культуре широко используются для изучения клеточной и молекулярной биологии альвеолярного эпителия. Уникальные характеристики и фенотип первичных альвеолярных клеток делают необходимым изучение посттранскриптовых модуляций генов, представляющих интерес в этих клетках. Таким образом, наша цель состояла в разработке нового инструмента для изучения посттранскриптовых модуляций мРНК, представляющих интерес для альвеолярных эпителиальных клеток в первичной культуре. Мы разработали быстрый и эффективный переходный протокол претворения для вставки транскрипционно контролируемой системы выражения плазмида в первичные альвеолярные эпителиальные клетки. Эта стратегия клонирования, используя вирусный эпитоп, чтобы пометить конструкцию, позволяет легко дискриминации построить выражение от эндогенных мРНК. Используя модифицированный метод количественного цикла (Cq), выражение стенограммы может быть количественно с разной временной интервалами для измерения его полураспада. Наши данные демонстрируют эффективность этого нового подхода при изучении посттранскриптонной регуляции в различных патофизиологических условиях в первичных альвеолярных эпителиальных клетках.

Этот протокол был успешно использован для создания системы транскрипционно-управляемого плазмидного выражения Tet-Off для оценки важности различных частей UTR зЭНАК 3' в модуляции стабильности транскрипта в первичных альвеолярных эпителиальных клетках.
<p class="jove_content" fo...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells a

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Здесь мы представляем инструмент, который может быть использован для изучения посттранскрипционной модуляции стенограммы в первичных альвеолярных эпителиальных клетках с помощью индуцируемой системы выражения в сочетании с техникой электропорации пипетты.

Эффективная транскрипционно контролируемая система выражения плазмида для исследования стабильности транскриптов мРНК в первичных альвеолярных эпителиальных клетках

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

Таким образом, наша модель позволяет изучать пост-транскрипционные модуляции конкретной стенограммы в альвеолярных эпителиальных клеток в первичной культуре и их физиологических и патофизиологических условиях. Таким образом, преходящая трансфекция первичных альвеолярных эпителиальных клеток имеет минимальное влияние на физиологию клеток и обмен веществ, что представляет собой явное преимущество перед классическими протоколами с использованием ингибиторов транскрипции. Для генерации плазмидной реакции, выражаюной интерес к гену, необходимо проанализировать последовательность гена и многочисленные места клонирования неопределимого вектора, чтобы определить последовательности распознавания в нескольких местах клонирования, которые внутренне не присутствуют в гене.Используя полимеразу высокой точности taq и стандартные методы перекрытия ПЦР, фланговый ген интереса с двумя выбранными местами распознавания ферментов ограничения с использованием конструктора грунтовки. Необходимо включить последовательность в кодировании эпитопа V5 вверх по течению от гена, представляющий интерес, чтобы отличить экспрессию трансфицированного гена от эндогенной экспрессии. Мутанты могут быть порождены последовательным удалением для изучения влияния различных трех основных непереведенных областей на стабильность мРНК гена с помощью обратных грунтовок, кодирующих полиаденилирующий сайт, который постепенно удаляет три основных конца непереведенной области.В конечном счете, вставка гена интереса может быть подтверждена анализом ограничений. Ориентация гена и отсутствие мутаций, потенциально введенных во время rtPCR, могут быть подтверждены секвенированием. Для трансфекции первичных крыс легких типа два альвеолярных эпителиальных клеток, семена клеток в один раз от 10 до шестого клеток на квадратный сантиметр в 100 миллиметров Петри блюда в присутствии полного минимального необходимого среды.Культура в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия при 5%углеродном диоксиде с влажностью. На следующий день добавьте 500 микролитров полной среды без антибиотиков к каждому колодец новой 12 хорошо пластины и предварительно разогреть пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут. Во время этой инкубации добавьте один микрограмм плазмиды реакции и один микрограмм регулятивного вектора к одной 1,5 миллилитровой трубке на колодец.Вымойте альвеолярные эпителиальные клетки с 10 миллилитров на колодец 37 градусов по Цельсию PBS без кальция или магния и лечить клетки с пятью миллилитров на колодец 37 градусов по Цельсию 0,05%трипсина в течение двух-четырех минут в инкубаторе клеточной культуры. Когда клетки отсоединились, нейтрализовать трипсина с 10 миллилитров на колодец полной среды без антибиотиков и собирать клетки в новую 50 миллилитровую трубку. Вымойте блюдо с четырьмя миллилитров свежей среды, чтобы собрать все оставшиеся клетки и осадок клеток центрифугации.Повторное распределение гранул в один миллилитр PBS для подсчета и центрифуги клеток снова. Переусердуйте гранулы при плотности в четыре раза от 10 до седьмого ячейки на миллилитр буфера повторного незаменимия и добавьте четыре раза по 10 к пятым клеткам к каждой трубке плазмиды и вектора с нежным смешиванием. Поместите одну трубку в электропорацию устройства и заполнить трубку с 3,5 миллилитров электролитического буфера.Полностью угнетайте поршень, чтобы вставить позолоченный наконечник электрода в пипетку и аккуратно смешать содержимое трубки. Тщательно аспирировать клетки с пипеткой и вставить пипетку в электропорации станции, пока щелчок звук не будет услышан. Выберите соответствующий протокол электропорации для альвеолярных эпителиальных клеток и нажмите Start на сенсорном экране.Сразу же после трансфекции снимите пипетку и перенесите клетки в один колодец предварительно разогретой 12 хорошо пластины. Когда все клетки были электропотери и поцаречены, поместите пластину в инкубатор клеточной культуры, заменив супернатант в каждом хорошо с полным среды с антибиотиками через два дня. Успех трансфекции может быть подтвержден экспрессией EGFP, наблюдаемой флуоресцентной микроскопией или цитометрией потока с использованием вектора контроля.Чтобы ингибировать транскрипцию гена интереса, 72 часа после трансфекции заменяют супернатант одним миллилитром на колодец полной среды, дополненной одним микрограммом на миллилитр свежеприготовленного адоксициклина. Для оценки полуготовности мРНК гена интереса, вернуть пластину в инкубатор клеточной культуры от 15 минут до шести часов. Мытье один хорошо с одним миллилитров ледяной PBS перед лизированием клеток с 500 микролитров лиза буфера из коммерчески доступных фенол хлороформ РНК извлечения комплекта и нежный встряхивания в каждой экспериментальной точки времени.Затем изолируйте РНК в соответствии с инструкциями комплекта и определить урожайность и чистоту РНК по спектрофотометрии на 230, 260 и 280 нанометров. Чтобы определить стабильность изолированной РНК, сначала обработать один микрограмм общей РНК из каждого образца с RNase бесплатно DNase один, чтобы удалить любые следы плазмидной ДНК. Используйте коммерчески доступный комплект синтеза cDNA со смесью олиго dT и случайных гексомер праймеров для улучшения эффективности обратной транскрипции, чтобы обратить вспять транскрибировать ДНК обедненной общей РНК в cDNA в соответствии с инструкциями производителя.Добавьте 180 микролитров воды класса молекулярной биологии в 20 микролитров реакционной смеси, чтобы разбавить реакцию cDNA на пять нанограмм на концентрацию микролитера и немедленно разбавить смесь cDNA свежей молекулярной биологией класса воды для достижения 1,25 нанограмма на микролитер концентрации. Объедините пять микролитров киберзеленого красителя мастер смеси с 0,1 микролитера молекулярной биологии класса воды, 0,45 микролитров 7,5 микромолярной вперед грунтовки, 0,45 микролитров 7,5 микромолярной обратной грунтовки, и четыре микролитров 1,25 нанограмма на микролитр CDNA для получения общего объема реакции 10 микролитров. Поместите образцы в qPCR термоциклер и усилить V5 тег гена интереса и тетроциклин трансактиватора заранее amplicons с использованием условий qPCR, как указано, и генерировать высокое разрешение плавления кривой для оценки конкретных температур плавления желаемых ампликонов и обеспечить отсутствие пиков шума ампликона.Этот метод электропорации пипетки облегчает скорость 25-30%трансфекции, как это наблюдается в соотношении клеток EGFP, обнаруженных с помощью флуоресцентной микроскопии и цитометрии потока. Лечение альвеолярных эпителиальных клеток с одним микрограммом на миллилитр доксициклина не оказывает существенного влияния на экспрессию эндогенной альфа-мРНК в любой момент времени в течение периода лечения. Используя транскрипционно контролируемую плазминированную систему выражения, как попродемонстрировано, сигнал V5 alpha ENaC может быть нормализован в соответствии с расширенным сигналом трансактиватора тетрациклина для определения эффективности трансфекции с помощью метода двойного цикла количественной оценки дельты.Период полурасохраны альфа ENaC mRNA в семь раз короче при наличии тетрациклина вне системы, чем при наличии актиномицина D, подтверждая, что актиномицин D приводит к артефактной стабилизации альфа ENaC mRNA. Кроме того, циклохексамид и фактор некроза опухоли альфа-обработка значительно снизили стабильность транскрипта, в то время как липополисахариды этого не делают. Значительные изменения в модуляции V5 альфа ENaC мРНК стабильность может быть вызвана в зависимости от удаленных и включены регионы трех основных непереведенных области.Кроме того, чрезмерное выражение специфических связывающих РНК белков снижает стабильность 5-альфа-мРНК ENaC по сравнению с трансфекции с пустой плазмидой PCDNA три. Этот инструмент будет полезен для запроса новых идей в пост-транскрипционные регуляции ключевых генов, участвующих в функции альвеолярного эпителия и их физиологических или патологических состояний.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

Additional Roles of RNA

SCIENTISTS IN ACTION

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Интерференция РНК на основе Исследование функции белка теплового шока 27 во время роговичного эпителиального заживление ран

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Параллельное измерение циркадных часов экспрессии генов и гормональную секрецией человека первичных клеточных культур

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Индуцируемая T7-РНК-полимераза-опосредованная мультигенная экспрессия, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Управляемая Expression ионного канала через Индуцибельные временная трансфекция

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

В пробирке Assay биолюминесценции характеризовать Циркадный ритм в эпителиальных клеток молочной железы

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Переходных выражение иностранных генов в клетках насекомых (sf9) для функциональных Assay протеина

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Эффективное производство и генерируемые идентификации ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена нокауты в модели системы данио рерио

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Высокоэффективные гена срыв мышиных и человека гемопоэтических предшественников клеток ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

ТРИФОСФАТЫ опосредованной реорганизация структуры хроматина цикла

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Очистка низким обильные клеток в зрительной системе дрозофилы

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...