Name: efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells
Uploaded: 2020-03-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells a

Francis Migneault fue apoyado por una beca proporcionada por la Red de Salud Respiratoria de Quebec y el programa de formación pulmonar de los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR), una beca de FRSQ y una beca de la Faculté des études Supérieures et Postdoctorados, Universidad de Montreal. Este trabajo fue apoyado por la Cátedra Gosselin-Lamarre en investigación clínica y los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria [YBMOP-79544].

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales del Centro de Investigación del Centro Hospitalario de la Universidad de Montreal (CRCHUM).
1. Diseño y generación del plásmido de respuesta expresando el gen de interés (GOI)
<ol><li>Utilice un vector de desconexión de tetraciclina inducible, como pTRE-Tight.</li>
	<li>Analice la sec...

<ol>
	<li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay.">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li><li>Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+stress+response.">The transcription stress response.</a> Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).</li><li>Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+in+mammalian+cells.">mRNA stability in mammalian cells.</a> Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li><li>Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serum+response+element+can+mediate+induction+of+c-fos+by+growth+hormone.">The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).</li><li>Harkin, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+GADD45+and+JNK/SAPK-dependent+apoptosis+following+inducible+expression+of+BRCA1.">Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1.</a> Cell. 97 (5), 575-586 (1999).</li><li>Formisano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+isoforms+of+the+Na+/Ca2++exchanger,+NCX1+and+NCX3,+constitute+novel+additional+targets+for+the+prosurvival+action+of+Akt/protein+kinase+B+pathway.">The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway.</a> Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).</li><li>Yin, D. X., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+expression+delays+drug-induced+apoptosis+but+does+not+increase+clonogenic+survival+after+drug+treatment+in+HeLa+cells.">BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells.</a> Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).</li><li>Johnstone, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+leukemia+protein+ELL:+evidence+for+a+role+in+the+regulation+of+cell+growth+and+survival.">Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).</li><li>Olotu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae+inhibits+purinergic+signaling+and+promotes+purinergic+receptor+P2Y2+internalization+in+alveolar+epithelial+cells.">Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).</li><li>Goldmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+alveolar+epithelial+cells+type+II+are+capable+of+TGFbeta-dependent+epithelial-mesenchymal-transition+and+collagen-synthesis.">Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ghrelin+ameliorates+the+human+alveolar+epithelial+A549+cell+apoptosis+induced+by+lipopolysaccharide.">Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emodin+suppresses+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+alveolar+epithelial+cells+through+Notch+signaling+pathway.">Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).</li><li>Cooper, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Term+Culture+of+the+A549+Cancer+Cell+Line+Promotes+Multilamellar+Body+Formation+and+Differentiation+towards+an+Alveolar+Type+II+Pneumocyte+Phenotype.">Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype.</a> PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).</li><li>Hirakata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+culture+systems+with+respiratory+epithelial+cells+for+evaluation+of+bacterial+invasiveness.">Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).</li><li>Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+functions+of+3'UTRs.">Regulatory functions of 3'UTRs.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).</li><li>Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lengthening+of+3'UTR+increases+with+morphological+complexity+in+animal+evolution.">Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution.</a> Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).</li><li>Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+epithelial+sodium+channels+to+alveolar+function+in+health+and+disease.">The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease.</a> Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).</li><li>Boncoeur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+epithelial+sodium+channel+activity+by+lipopolysaccharide+in+alveolar+type+II+cells:+involvement+of+purinergic+signaling.">Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).</li><li>Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+alveolar+epithelial+Type+I+and+Type+II+cells+from+rat+lungs.">Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells.">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).</li><li>Ke, S. H., Madison, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-directed+mutagenesis+by+single-tube+'megaprimer'+PCR+method.">Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).</li><li>Gossen, M., Bujard, H., Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. , (2001).</li><li>Migneault, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Transcriptional+Modulation+of+aENaC+mRNA+in+Alveolar+Epithelial+Cells:+Involvement+of+its+3'+Untranslated+Region.">Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).</li><li>Migneault, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modulation de la stabilit&#233; de l'ARNm alphaENaC dans les cellules &#233;pith&#233;liales alv&#233;olaires: d&#233;termination du r&#244;le des s&#233;quences 3' non traduites. , (2015).</li><li>Grzesik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+to+primary+alveolar+epithelial+cells+by+nucleofection.">Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).</li><li>Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+doxycycline-induced+cytotoxicity+on+human+bronchial+epithelial+cells.">Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells.</a> Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).</li><li>Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline+impairs+neutrophil+migration+to+the+airspaces+of+the+lung+in+mice+exposed+to+intratracheal+lipopolysaccharide.">Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide.</a> Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).</li><li>Hovel, H., Frieling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+doxycycline,+mezlocillin+and+clotrimazole+in+cell+culture+media+as+contamination+prophylaxis.">The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis.</a> Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+pathways+of+RNA+degradation.">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals.">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li></ol>

La baja tasa de transfección de las células epiteliales alveolares en el cultivo primario ha sido una grave limitación para el uso del sistema Tet-Off para evaluar la estabilidad del ARNm en estas células. Sin embargo, esta limitación fue superada por la electroporación de pipetas, permitiendo una eficiencia de transfección del 25-30%(Figura 1 y Figura 3)26.
La medición de la estabilidad de la transcrip...

Se han desarrollado varias técnicas para determinar la vida media de los ARNm. La técnica de descomposición de la persecución por pulsos, que utiliza ARNm etiquetados, permite la evaluación simultánea de una gran piscina de ARNm con mínima perturbación celular. Sin embargo, este enfoque no permite una estimación directa de la vida media de una sola transcripción genética y no se puede implementar para estudiar la modulación posttranscripcional de un ARNm después de la estimulación con factores de crecimiento, ROS, alarminas o inflamación1.
El uso de inhibidores de la transcripción, como la actinomicina D y la amanitina, es un método relativamente simple para medir la cinética de degradación del ARNm a lo largo del tiempo. Una ventaja principal de este enfoque sobre el de las técnicas anteriores , (es decir, la persecución por pulsos) se basa en la capacidad de estimar directamente la vida media de una transcripción determinada y comparar cómo diferentes tratamientos podrían afectar su cinética de degradación. Sin embargo, el impacto nocivo significativo de los inhibidores de la transcripción en la fisiología celular representa un inconveniente importante del enfoque2. De hecho, la inhibición de todo el transcriptoma celular con estos fármacos tiene el efecto secundario negativo de perturbar la síntesis de elementos clave involucrados en la estabilidad del ARNm, como los microARN (miRNAs), así como la expresión y síntesis de proteínas de unión al ARN, que son importantes para la degradación y estabilidad del ARNm. Por lo tanto, la perturbación severa de la transcripción génica por estos fármacos podría modificar artefrealmente las curvas de degradación de las transcripciones.
El sistema de inducción del promotor representa un tercer enfoque para medir la vida media de un ARNm específico. Este método mide la degradación de un ARNm específico de una manera similar a los métodos que utilizan inhibidores de la transcripción. Con frecuencia se utilizan dos tipos de sistemas de inducción: el promotor c-fos inducido por suero3 y el sistema inducible Tet-Off4. Con el sistema c-fos, no es necesario el uso de inhibidores de transcripción que pueden ser tóxicos para la célula. Sin embargo, este método requiere la sincronización del ciclo celular, que impide la evaluación de la estabilidad real de una transcripción durante la interfase5. Por el contrario, el sistema Tet-Off permite la fuerte expresión del gen de interés (GOI) bajo el control de un promotor sintético regulado por tetraciclina. Este sistema requiere que la presencia de dos elementos que deben ser cotransinfectados en la célula sean funcionales. El primer plásmido (pTet-Off) expresa la proteína reguladora tTA-Adv, un factor de transcripción sintética híbrida compuesto por el represor prokariotate TetR (de Escherichia coli) fusionado a tres dominios de transactivación de transcripción de la proteína viral HSV VP16. El GOI se clona en el plásmido pTRE-Tight bajo el control de un promotor sintético (PTight),que comprende la secuencia mínima del promotor del citomegalovirus (CMV) fusionado a siete repeticiones de la secuencia del operador tetO. La transcripción del gen aguas abajo de PTight depende de la interacción de TetR con tetO. En presencia de tetraciclina o su derivado, doxiciclina, el represor TetR pierde su afinidad por el operador tetO, lo que lleva a un cese de la transcripción4. Las características del sistema Tet-Off lo convierten en un modelo ideal para el estudio de la expresión de ARNm específica en células eucariotas evitando al mismo tiempo posibles efectos pleiotrópicos que son secundarios a la ausencia de secuencias reguladoras procariotas en la célula eucariota6. Por lo general, las líneas celulares Tet-Off doblemente estables (HEK 293, HeLa y PC12) se utilizan con este sistema para integrar copias del regulador y plásmidos de respuesta para un acceso conveniente a la expresión génica controlable7,8,9.
Varios modelos de células epiteliales alveolares en cultivo se han utilizado para estudiar la biología celular y molecular del epitelio alveolar. Durante años, los investigadores han utilizado ampliamente células primarias humanas o roedores10,11, así como líneas celulares inmortalizadas como células Humanas A549 o ratas RLE-6TN12,13. Aunque generalmente son menos proliferativas y más difíciles de cultivar y transfectar, las células epiteliales alveolares en el cultivo primario siguen siendo el estándar de oro para el estudio de la función y disfunción del epitelio alveolar en condiciones fisiológicas y patológicas. De hecho, las líneas celulares inmortalizadas como las células A549 no presentan las características complejas y fenotipos de las células primarias, mientras que las células epiteliales alveolares en el cultivo primario recapitulan las principales propiedades del epitelio alveolar, en particular la capacidad de formar una barrera polarizada y estrecha14,15. Desafortunadamente, estas células son muy resistentes a las técnicas de transfección convencionales, como las que utilizan liposomas, haciendo muy difícil el uso de un sistema inducido por el promotor como Tet-Off.
La modulación posttranscripcional de los ARNM es uno de los métodos más eficaces para modular rápidamente la expresión génica de una transcripción16. La región no traducida del ARNM 3 (3' UTR) desempeña un papel importante en este mecanismo. Se ha demostrado que, a diferencia del UTR de 5', existe una correlación exponencial entre la longitud del UTR de 3' y las complejidades celulares y morfológicas de un organismo. Esta correlación sugiere que el UTR de 3', al igual que las regiones de codificación mRNA, ha sido sometido a una selección natural para permitir una modulación posttranscripcional cada vez más compleja a lo largo de la evolución17. El UTR de 3' contiene varios sitios de unión para proteínas y miRNAs que afectan a la estabilidad y traducción de la transcripción.
En el presente trabajo, desarrollamos una herramienta para investigar el papel de los dominios altamente conservados en el UTR de 3' de un GOI para el control de la estabilidad de la transcripción. Nos centramos en el canal epitelial de sodio, subunidad alfa ( ENaC), que desempeña un papel clave en la fisiología epitelial alveolar18. Las células epiteliales alveolares en el cultivo primario se transtrusaron transitoriamente con éxito con los dos componentes del sistema Tet-Off, lo que permite el estudio del papel de la UTR de 3' en la estabilidad del ARNm con un sistema que afecta mínimamente a la fisiología celular y al metabolismo en comparación con el uso de inhibidores de transcripción con otros protocolos. Se desarrolló una estrategia de clonación para diferenciar la expresión del GOI de la del gen endógeno utilizando un epítopo no endógeno (V5). La respuesta y los plásmidos reguladores se transfirieron a las células epiteliales alveolares mediante una técnica de electroporación de pipetas. Posteriormente, la expresión de la transcripción se midió incubando las células con doxiciclina en diferentes intervalos de tiempo. La vida media de la transcripción fue evaluada por RT-qPCR con un método Cq modificado utilizando el producto mRNA tTA-Ad transinfectado para su normalización. A través de nuestro protocolo, ofrecemos una manera conveniente de estudiar la modulación posttranscripcional de una transcripción en diferentes condiciones y definir la participación de las regiones no traducidas con más detalle.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actinomycin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-LineHemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0197S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, Amplification Grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excella E25 ConsoleIncubatorShaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>1220G76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES pH 7.3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51026420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61100103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4360954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51025413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-exU electrophoresis system</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>AD140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System Starter Pack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C854003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3 vector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V790-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTet-Off Advanced vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTRE-Tight vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified alveolar epithelial cells</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4485697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat TNF-alpha Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>510-RT-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Septra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0371S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18090010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tet System Approved FBS</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Molecular biology Grade</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>809-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells

El estudio de la regulación posttranscripcional es fundamental para entender la modulación de un ARN mensajero (ARNm) dado y su impacto en la homeostasis celular y el metabolismo. De hecho, las fluctuaciones en la expresión de transcripción podrían modificar la eficiencia de la traducción y, en última instancia, la actividad celular de una transcripción. Se han desarrollado varios enfoques experimentales para investigar la vida media del ARNm, aunque algunos de estos métodos tienen limitaciones que impiden el estudio adecuado de la modulación posttranscripcional. Un sistema de inducción promotor puede expresar un gen de interés bajo el control de un promotor sintético regulado por tetraciclina. Este método permite la estimación de la vida media de un ARNm dado bajo cualquier condición experimental sin perturbar la homeostasis celular. Un inconveniente importante de este método es la necesidad de transfectar las células, lo que limita el uso de esta técnica en células primarias aisladas que son altamente resistentes a las técnicas de transfección convencionales. Células epiteliales alveolares en el cultivo primario se han utilizado ampliamente para estudiar la biología celular y molecular del epitelio alveolar. Las características únicas y el fenotipo de las células alveolares primarias hacen que sea esencial estudiar las modulaciones posttranscripcionales de genes de interés en estas células. Por lo tanto, nuestro objetivo era desarrollar una herramienta novedosa para investigar las modulaciones posttranscripcionales de los ARNm de interés en las células epiteliales alveolares en el cultivo primario. Diseñamos un protocolo de transfección transitoria rápido y eficiente para insertar un sistema de expresión de plásmido controlado por transcripción en células epiteliales alveolares primarias. Esta estrategia de clonación, utilizando un epítopo viral para etiquetar la construcción, permite la fácil discriminación de la expresión de la construcción a partir de la de los ARNm endógenos. Mediante el uso de un método de ciclo de cuantificación (Cq) modificado, la expresión de la transcripción se puede cuantificar en diferentes intervalos de tiempo para medir su vida media. Nuestros datos demuestran la eficiencia de este enfoque novedoso en el estudio de la regulación posttranscripcional en diversas condiciones fisiopatológicas en células epiteliales alveolares primarias.

Este protocolo se utilizó con éxito para generar un sistema de expresión de plásmido controlado transcripciónteamente Tet-Off para evaluar la importancia de diferentes porciones de la UTR de 3' en la modulación de la estabilidad de la transcripción en células epiteliales alveolares primarias.
El primer paso en la implementación de este sistema fue establecer una técnica de transfección rápida, fácil y eficiente para...

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Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Aquí, presentamos una herramienta que se puede utilizar para estudiar la modulación posttranscripcional de una transcripción en células epiteliales alveolares primarias mediante el uso de un sistema de expresión inducible acoplado a una técnica de electroporación de pipeta.

Sistema eficiente de expresión de plásmido controlado por transcripción para la investigación de la estabilidad de las transcripciones de ARNm en células epiteliales alveolares primarias

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

Así que nuestro modelo permite el estudio de la modulación post-transcripción de una transcripción específica en células epiteliales alveolares en el cultivo primario y sus condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. Por lo tanto, la transfección transitoria de las células epiteliales alveolares primarias tiene un efecto mínimo en la fisiología celular y los metabolismos, lo que supone una clara ventaja sobre los protocolos clásicos que utilizan inhibidores de la transcripción. Para la generación de un plásmido de respuesta que exprese un gen de interés, la secuencia del gen y los múltiples sitios de clonación del vector inducible deben ser analizados para identificar las secuencias de reconocimiento en los múltiples sitios de clonación que no están presentes internamente en el gen.Utilizando técnicas de alta fidelidad de taq polimerasa y PCR de superposición estándar, flanquee el gen de interés con dos sitios seleccionados de reconocimiento de enzimas de restricción utilizando imprimaciones de diseño. Debe incluirse una secuencia en la codificación del epítopo V5 aguas arriba del gen de interés para distinguir la expresión del gen trans infectado de la expresión endógena. Los mutantes se pueden generar mediante la eliminación secuencial para estudiar los efectos de diferentes regiones no traducidas en la estabilidad del ARNm del gen utilizando imprimaciones inversas que codifican un sitio de poliadenilación que elimina gradualmente los tres extremos principales de la región no traducida.En última instancia, la inserción del gen de interés puede confirmarse mediante un análisis de restricciones. La orientación del gen y la ausencia de mutaciones potencialmente introducidas durante la rtPCR pueden confirmarse mediante secuenciación. Para la transfección de pulmón de rata primaria tipo dos células epiteliales alveolares, sembrar las células en un uno por 10 a las sextas células por centímetro cuadrado en platos Petri de 100 milímetros en presencia de medio esencial mínimo completo.Cultivo durante 24 horas a 37 grados centígrados en 5% dióxido de carbono con humedad. Al día siguiente, añadir 500 microlitros de medio completo sin antibióticos a cada pozo de una nueva placa de 12 pozos y precaliente la placa a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Durante esta incubación, añadir un microgramo del plásmido de respuesta y un microgramo de vector regulador a un tubo de 1,5 mililitros por pozo.Lavar las células epiteliales alveolares con 10 mililitros por pozo de 37 grados Celsius PBS sin calcio o magnesio y tratar las células con cinco mililitros por pozo de 37 grados Celsius 0.05%trypsin durante dos a cuatro minutos en la incubadora de cultivo celular. Cuando las células se hayan desprendido, neutralice la trippsina con 10 mililitros por pozo de medio completo sin antibióticos y recoja las células en un nuevo tubo de 50 mililitros. Lavar el plato con cuatro mililitros de medio fresco para recoger las células restantes y sedimentar las células por centrifugación.Resuspender el pellet en un mililitro de PBS para contar y centrifugar las células de nuevo. Resuspender el pellet a una densidad de cuatro veces 10 a las séptimas células por mililitro de tampón de resuspensión y añadir cuatro veces 10 a las quintas células a cada tubo de plásmido y vector con mezcla suave. Coloque un tubo en el dispositivo de electroporación y llene el tubo con 3,5 mililitros de tampón electrolítico.Presione completamente el pistón para insertar una punta de electrodo chapado en oro en una pipeta y mezcle suavemente el contenido del tubo. Aspire cuidadosamente las células con una pipeta e inserte la pipeta en la estación de electroporación hasta que se oirí un sonido de clic. Seleccione el protocolo de electroporación adecuado para las células epiteliales alveolares y pulse Iniciar en la pantalla táctil.Inmediatamente después de la transfección, retire la pipeta y transfiera las células a un pocero de la placa de 12 pozos precale calentada. Cuando todas las células hayan sido electroporated y plateadas, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular, reemplazando el sobrenadante en cada pozo con un medio completo con antibióticos después de dos días. El éxito de la transfección puede ser confirmado por la expresión de EGFP como se observa mediante microscopía de fluorescencia o citometría de flujo utilizando un vector de control.Para inhibir la transcripción del gen de interés, 72 horas después de la transfección reemplazar el sobrenadante con un mililitro por pozo de medio completo complementado con un microgramo por mililitro de adoxiclina recién preparada. Para evaluar la vida media del GEN de ARNm, devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular de 15 minutos a seis horas. Lavar un pozo con un mililitro de PBS helado antes de la lesión de las células con 500 microlitros de tampón de lelisis de un kit de extracción de ARN de cloroformo fenol disponible comercialmente y un suave temblor en cada punto de tiempo experimental.A continuación, aísle el ARN de acuerdo con las instrucciones del kit y determine el rendimiento y la pureza del ARN por espectrofotometría a 230, 260 y 280 nanómetros. Para determinar la estabilidad del ARN aislado, primero tratar un microgramo del ARN total de cada muestra con RNase libre de ADN para eliminar cualquier rastro de ADN plásmido. Utilice un kit de síntesis de ADNc disponible comercialmente con una mezcla de oligo dT y imprimaciones de hexómero aleatorio para mejorar la eficiencia de transcripción inversa para revertir la transcripción del ARN total agotado del ADN en el ADNnr de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Añadir 180 microlitros de agua de grado de biología molecular a los 20 microlitros de la mezcla de reacción para diluir la reacción de ADNc a una concentración de cinco nanogratros por microlitro y diluir inmediatamente la mezcla de ADNc con agua de grado de biología molecular fresca para alcanzar una concentración de 1,25 nanogramos por microlitro. Combine cinco microlitros de la mezcla maestra de colorante verde cibernético con 0,1 microlitros de agua de grado de biología molecular, 0,45 microlitros de imprimación delantera de 7,5 micromolares, 0,45 microlitros de imprimación inversa de 7,5 micromolares y cuatro microlitros de 1,25 microgramos por microlitro de cDNA para obtener un volumen de reacción total de 10 microlitros. Coloque las muestras en un termociclador qPCR y amplifique el gen de la etiqueta V5 de interés y los amplicons de avance del transactivador de tetrociclina utilizando las condiciones qPCR indicadas y genere una curva de fusión de alta resolución para evaluar las temperaturas de fusión específicas de los amplicons deseados y para garantizar la ausencia de picos de amplicon de ruido.Esta técnica de electroporación de pipeta facilita una tasa de eficiencia de transfección de 25 a 30% observada por las proporciones de células EGFP detectadas por microscopía de fluorescencia y citometría de flujo. El tratamiento de las células epiteliales alveolares con un microgramo por mililitro de doxiciclina no tiene un impacto significativo en la expresión de ARNm alfa endógeno ENaC en cualquier momento durante el período de tratamiento. Utilizando un sistema de expresión de plásmido controlado transcripcional como se ha demostrado, la señal ENaC alfa V5 podría normalizarse de acuerdo con la señal avanzada del transactivador de tetraciclina para determinar la eficiencia de la transfección utilizando el método de ciclo de cuantificación de doble delta.La vida media del ARNm alfa ENaC es hasta siete veces más corta en presencia del sistema de tetraciclina fuera que en presencia de actinomicina D, lo que confirma que la actinomicina D conduce a una estabilización de ARNm alfa ENaC artefacto. Además, el tratamiento alfa con factor de ciclohexamida y necrosis tumoral disminuyó significativamente la estabilidad de la transcripción, mientras que los lipopolisacáridos no. Se pueden inducir cambios significativos en la modulación de la estabilidad del ARNm alfa ENaC V5 dependiendo de las regiones eliminadas e incluidas de las tres regiones principales no traducidas.Además, la expresión excesiva de proteínas específicas de unión al ARN disminuye la estabilidad del ARNm 5-alfa ENaC en comparación con la transfección con un pcDNA vacío de tres plásmidos. Esta herramienta será útil para consultar nuevos conocimientos sobre la regulación post-transcripción de genes clave implicados en la función del epitelio alveolar y sus condiciones fisiológicas o patológicas.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

Additional Roles of RNA

SCIENTISTS IN ACTION

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

basado en la interferencia de ARN Investigación de la Función de la proteína de choque térmico 27 ​​durante la curación de la herida corneal epitelial

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Investigación

Genética

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

La medición paralela de la expresión de genes circadianos del reloj y Hormona en cultivos celulares primarios humanos

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducible T7 RNA polimerasa mediada Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Ensayo de bioluminiscencia para la caracterización del ritmo circadiano en células epiteliales mamarias

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Expresión transitoria de Genes foráneos en células de insecto (sf9) para el análisis funcional de proteínas

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Producción eficiente y genera identificación de CRISPR/Cas9 Gene Knockouts en el sistema modelo Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Mediada por CRISPR reorganización de la estructura de bucles de cromatina

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Purificación de células poco abundantes en el sistema Visual de Drosophila

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...