Name: induction of eryptosis in red blood cells using a calcium ionophore
Uploaded: 2020-01-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منحه R15ES030140 و NSF منحه CBET1903568. ومن المسلم به أيضا الدعم المالي من كليه روس للهندسة والتكنولوجيا وقسم الهندسة الكيميائية والجزيئية الحيوية في جامعه أوهايو.

وقد تم شراء جميع عينات الدم البشرية المستخدمة في البروتوكول الموصوف أدناه كعينات تم التعرف عليها. ولم يشارك في هذه الدراسة اي أشخاص من البشر أو جندوا بصوره مباشره. وينبغي استخدام المبادئ التوجيهية لإعلان هلسنكي عندما تشمل البحوث المواضيع البشرية.
1-العزلة الكرياته عن الدم ا?...

<ol>
	<li>Bratosin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Cell+Death+in+Mature+Erythrocytes:+A+Model+for+Investigating+Death+Effector+Pathways+Operating+in+the+Absence+of+Mitochondria.">Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 8 (12), 1143-1156 (2001).</li><li>Lang, E., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Pathophysiological+Significance+of+Eryptosis,+the+Suicidal+Erythrocyte+Death.">Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).</li><li>Garnier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+Deformability+in+Diabetes+and+Erythrocyte+Membrane+Lipid+Composition.">Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition.</a> Metabolism. 39 (8), 794-798 (1990).</li><li>Verkleij, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Asymmetric+Distribution+of+Phospholipids+in+the+Human+Red+Cell+Membrane.+A+Combined+Study+Using+Phospholipases+and+Freeze-Etch+Electron+Microscopy.">The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323 (2), 178-193 (1973).</li><li>de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Macrophages+and+Red+Blood+Cells;+A+Complex+Love+Story.">Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story.</a> Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).</li><li>Fadok, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Receptor+for+Phosphatidylserine-Specific+Clearance+of+Apoptotic+Cells.">A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells.</a> Nature. 405 (6782), 85-90 (2000).</li><li>Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phosphatidylserine+Receptor:+A+Crucial+Molecular+Switch.">The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (8), 627-633 (2001).</li><li>Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Insights+into+the+Mechanism+for+Clearance+of+Apoptotic+Cells.">New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells.</a> BioEssays. 22 (10), 878-881 (2000).</li><li>Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis+in+Hereditary+Spherocytosis+and+Thalassemia:+Role+of+Glycoconjugates.">Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates.</a> Glycoconjugate Journal. 27 (9), 717-722 (2010).</li><li>Kuypers, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Altered+Membrane+Phospholipid+Asymmetry+in+Subpopulations+of+Human+Red+Blood+Cells+Using+Fluorescently+Labeled+Annexin+V.">Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V.</a> Blood. 87 (3), 1179-1197 (1996).</li><li>Lang, F., Lang, E., Fller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+Pathophysiology+of+Eryptosis.">Physiology and Pathophysiology of Eryptosis.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 308-314 (2012).</li><li>Wr&#243;bel, A., Bobrowska-H&#228;gerstrand, M., Lindqvist, C., H&#228;gerstrand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Membrane+Phospholipid+Scrambling+in+Human+Erythrocytes+and+K562+Cells+with+FM1-43+-+a+Comparison+with+Annexin+V-FITC.">Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 - a Comparison with Annexin V-FITC.</a> Cellular and Molecular Biology Letters. 19 (2), 262-276 (2014).</li><li>Mohandas, N., Gallagher, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+Cell+Membrane:+Past,+Present,+and+Future.">Red Cell Membrane: Past, Present, and Future.</a> Blood. 112 (10), 3939-3948 (2008).</li><li>Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminophospholipid+Translocase+and+Phospholipid+Scramblase+Activities+in+Sickle+Erythrocyte+Subpopulations.">Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations.</a> British Journal of Haematology. 146 (4), 447-455 (2009).</li><li>Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Review+on+Eryptosis.">A Comprehensive Review on Eryptosis.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 39 (5), 1977-2000 (2016).</li><li>Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-Dependent+Phospholipid+Scrambling+by+TMEM16F.">Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F.</a> Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).</li><li>Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Suicidal+Erythrocyte+Death+by+Volasertib.">Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (4), 1472-1486 (2017).</li><li>Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Phospholipid+Organization+in+Calcium-Loaded+Human+Erythrocytes.">Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 902 (2), 253-262 (1987).</li><li>Alzoubi, K., Calabr&#242;, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+of+Programmed+Erythrocyte+Death+by+Alantolactone.">Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone.</a> Toxins (Basel). 6 (12), 3596-3612 (2014).</li><li>Jacobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+Erythrocyte+Cell+Membrane+Scrambling+by+Mitotane.">Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 4 (33), 1516-1526 (2014).</li><li>Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractoriness+of+Eryptotic+Red+Blood+Cells+to+Plasmodium+Falciparum+Infection:+A+Putative+Host+Defense+Mechanism+Limiting+Parasitaemia.">Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia.</a> PLoS One. 6 (10), e26575 (2011).</li><li>Borst, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Adhesion+of+Eryptotic+Erythrocytes+to+Endothelial+Cells+via+CXCL16/SR-PSOX.">Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (4), C644-C651 (2011).</li><li>Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Phosphatidylserine-Specific+Peptide-Conjugated+Liposomes+Using+a+Model+System+of+Malaria-Infected+Erythrocytes.">Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38 (10), 1649-1651 (2015).</li><li>Mahmud, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suicidal+Erythrocyte+Death,+Eryptosis,+as+a+Novel+Mechanism+in+Heart+Failure-Associated+Anaemia.">Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia.</a> Cardiovascular Research. 98 (1), 37-46 (2013).</li><li>Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+Eryptosis,+the+Suicidal+Erythrocyte+Death+by+Piceatannol.">Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (6), 2300-2310 (2016).</li><li>Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrambling+of+Phospholipids+Activates+Red+Cell+Membrane+Cholesterol.">Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol.</a> Biochemistry. 46 (8), 2233-2238 (2007).</li><li>Lang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis,+a+Window+to+Systemic+Disease.">Eryptosis, a Window to Systemic Disease.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 22 (6), 373-380 (2008).</li><li>Gil-Parrado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionomycin-Activated+Calpain+Triggers+Apoptosis.+A+Probable+Role+for+Bcl-2+Family+Members.">Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27217-27226 (2002).</li><li>Liu, C. M., Hermann, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ionomycin+as+a+Calcium+Ionophore.">Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore.</a> Journal of Biological Chemistry. 253 (17), 5892-5894 (1978).</li><li>Klarl, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Mediates+Erythrocyte+"Programmed+Cell+Death"+Following+Glucose+Depletion.">Protein Kinase C Mediates Erythrocyte "Programmed Cell Death" Following Glucose Depletion.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), C244-C253 (2006).</li><li>Danilov, Y. N., Cohen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Germ+Agglutinin+but+Not+Concanavalin+A+Modulates+Protein+Kinase+C-Mediated+Phosphorylation+of+Red+Cell+Skeletal+Proteins.">Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins.</a> FEBS Letters. 257 (2), 431-434 (1989).</li><li>Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Outer+Leaflet+Is+the+Primary+Regulator+of+Membrane+Damage+Induced+by+Silica+Nanoparticles+in+Vesicles+and+Erythrocytes.">Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes.</a> Environmental Science Nano. 6 (4), 1219-1232 (2019).</li><li>Jaroszeski, M. J., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow Cytometry Protocols. , (2003).</li><li>Ghashghaeinia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Erythrocyte+Age+on+Eryptosis.">The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis.</a> British Journal of Haematology. 157 (5), 1365 (2012).</li><li>Repsold, L., Joubert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis:+An+Erythrocyte's+Suicidal+Type+of+Cell+Death.">Eryptosis: An Erythrocyte's Suicidal Type of Cell Death.</a> Biomed Research International. 2018 (5), 9405617 (2018).</li><li>Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+Binding+Properties+of+Human+Placental+Anticoagulant+Protein-I,+a+Member+of+the+Lipocortin+Family.">Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 7944-7949 (1989).</li><li>Andree, H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Vascular+Anticoagulant+&#945;+(VAC&#945;)+to+Planar+Phospholipid+Bilayers.">Binding of Vascular Anticoagulant &#945; (VAC&#945;) to Planar Phospholipid Bilayers.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (9), 4923-4928 (1990).</li><li>Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+Affinity+and+Cooperativity+of+Annexin+V-Membrane+Binding+under+Conditions+of+Low+Membrane+Occupancy.">Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy.</a> Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).</li><li>Jiang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis+as+an+Underlying+Mechanism+in+Systemic+Lupus+Erythematosus-Related+Anemia.">Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).</li><li>Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+and+Platelet+Proteomics+in+Hematological+Disorders.">Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).</li></ol>

والهدف من هذا الاجراء هو توفير القيم المثلي لتركيز ايوكوفيري ، والوقت العلاج ، وتركيز الجلوكوز خارج الخلية ، والتي هي عوامل هامه في ضمان الحث الناجح للارطح. ومن الخطوات الحاسمة في البروتوكول استنفاد الجلوكوز خارج الخلية ، والتي ، علي الرغم من أهميتها ، لم يتم التاكيد بما فيه الكفاية في ال?...

موت الخلايا المبرمجة في كريات الدم الحمراء ، والمعروف أيضا باسم الخلية ، هو شائع في العديد من الحالات السريرية والاضطرابات الدموية. ويرتبط اريبتوسيس مع انكماش الخلية وفقدان التماثل فوسفورية في غشاء البلازما الخلية1,2. فقدان عدم التماثل النتائج في نقل فوسفاتيديلسيسيرين (PS), الدهون المترجمة عاده في النشرة الداخلية3,4, إلى النشرة الخارجية الخلية, الذي يشير إلى الضامة لفاجوسيتوسي وأزاله الكريات الحمراء المعيبة5,6,7,8. في نهاية فتره الحياة الطبيعية من كريات الدم الحمراء ، وأزاله الخلايا الدموية من قبل الضامة يضمن التوازن من كريات الدم الحمراء في التداول. ومع ذلك ، في الظروف المرضية ، مثل مرض الخلية المنجلية و الثلاسيميا9،10،11، قد يؤدي تحسين الخلايا الخلوية إلى فقر الدم الشديد2. نظرا لأهميته في امراض الدم ، هناك اهتمام كبير في دراسة العوامل التي تحفز أو تمنع الخلايا الخلوية واليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العملية.
غشاء البلازما من كريات الدم الحمراء الصحية غير متناظرة ، مع الفوسفورية المختلفة التعريب في المنشورات الخارجية والداخلية. يتم تنظيم التماثل غشاء في المقام الأول من قبل عمل الانزيمات الغشاء. Aminophospholipid translocase يسهل نقل أمينوفوسفوليبيدس ، PS و فوسفهاتيديليثانولامين (PE) ، من خلال توجيه هذه الدهون إلى النشرة الداخلية الخلية. من ناحية أخرى, floppase ينقل الكولين التي تحتوي علي الدهون الفوسفاتية, فوسفاتيديلكولين (PC) و سفينغوميلين (SM), من الداخل إلى النشرة الخارجية لغشاء الخلية12. ومع ذلك ، علي عكس الخلايا السليمة ، يتم خلط غشاء الكريات الحمراء الخلوية. ويرجع ذلك إلى عمل الانزيم الثالث ، الذي يعطل التباين فوسفورية عن طريق تسهيل النقل ثنائي الاتجاه من أمينوفوسفوليبيدس13،14،15،16. يتم تنشيط تشويش بلاسي من خلال مستويات مرتفعه من الخلايا من Ca2 +. ولذلك ، ionophores الكالسيوم ، والتي تسهل نقل Ca2 + عبر غشاء الخلية12، هي محفزات فعاله من الخلايا البينية.
Ionomycin ، ايونومور الكالسيوم ، وقد استخدمت علي نطاق واسع للحث علي الخلايا الحمراء في كريات الصدر12،17،18،19،20،21،22،23،24،25،26. Ionomycin لديه كل من المجموعات هيدروفيلييك ومسعور ، والتي هي ضرورية لربط والتقاط Ca2 + أيون ، ونقله إلى الفضاء عصاري خلوي27،28،29. وهذا يؤدي إلى تفعيل التشويش ونقل الموقع من PS إلى النشرة الخارجية ، والتي يمكن الكشف عنها بسهوله باستخدام الملحقات-V ، وهو بروتين خلوي مع تقارب عاليه إلى PS12. وعلي الرغم من انه يتم الإبلاغ عن الآثار التي يسببها ionomycin عاده ، وهناك تباين طريقه كبيره في الأدب (الجدول 1). يعتمد السكان من كريات الحمراء التي تمر بالخلايا الخلوية علي عوامل مختلفه مثل تركيز ايوكوفيري ، ووقت العلاج مع ايوفونور ، ومحتوي السكر في البيئة خارج الخلية (استنزاف الجلوكوز ينشط قنوات الموجبة ويسهل دخول Ca2 + في الفضاء عصاري خلوي)30،31. ومع ذلك ، هناك القليل من الاتساق في هذه العوامل في الأدبيات ، مما يجعل من الصعب القيام التكرار في المختبر.
في هذا البروتوكول ، نقدم اجراء خطوه بخطوه للحث علي الارطح في كريات الحمراء البشرية. يتم فحص العوامل التي تؤثر علي الخلايا البينية الناجحة بما في ذلك Ca2 + تركيز ، تركيز ايوكوفيري ، وقت العلاج ، وما قبل الحضانة في المخزن المؤقت المنضب الجلوكوز ويتم الإبلاغ عن القيم المثلي. يوضح هذا الاجراء ان ما قبل الحضانة من كريات الحمراء في المخزن المؤقت الخالي من الجلوكوز يزيد بشكل كبير من نسبه الخلايا البينية مقارنه بالمخزن المؤقت المحتوي علي الجلوكوز. يمكن استخدام هذا البروتوكول في المختبر لإنتاج كريات الحمراء الخارجية للتطبيقات المختلفة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A10788</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>643177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M7157</td>
			<td>Model Eppendorf 5415C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Zeiss, LSM Tek Thornwood</td>
			<td></td>
			<td>Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses circles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable round bottom flow cytometry tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRU47729-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer (1 M)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7290</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>EMD Milipore Corp.</td>
			<td>407952-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain glass microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HFM microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole blood in ACD</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4 &#176;C and warm to 37 &#176;C prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of eryptosis in red blood cells using a calcium ionophore

كريات الخلايا المبرمجة الموت ، يحدث في عدد من الامراض الدموية واثناء أصابه الكريات الحمراء. السمة المميزة للخلايا eryptotic هو فقدان التماثل الموضعي لغشاء الخلية ، مما يؤدي إلى نقل فوسفاتيديلسيسيرين إلى النشرة الخارجية غشاء. يتم تشغيل هذه العملية عن طريق زيادة تركيز داخل الخلايا من Ca2 +، والذي ينشط تشويش blase ، وهو الانزيم الذي يسهل حركه ثنائيه الاتجاه من الدهون الفوسفاتية بين المنشورات غشاء. ونظرا لاهميه الخلايا البينية في الظروف المرضية المختلفة, وكانت هناك جهود للحث علي الارطح في المختبر. وقد اعتمدت هذه الجهود عموما علي ionophore الكالسيوم, ionomycin, لتعزيز Ca داخل الخلايا2 + تركيز والحث علي الارطح. ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن العديد من التناقضات في الأدبيات المتعلقة بالاجراء الخاص بحمل الخلايا البينية باستخدام ionomycin. هنا ، ونحن الإبلاغ عن بروتوكول خطوه بخطوه ل ionomycin المستحثة في كريات الحمراء البشرية. ونحن نركز علي الخطوات الهامه في الاجراء بما في ذلك تركيز ايوكوفيري ، ووقت الحضانة ، واستنزاف الجلوكوز ، وتوفير نتيجة تمثيليه. ويمكن استخدام هذا البروتوكول للتكرار حث الخلايا البينية في المختبر.

تحسين تركيز ايونوميمايسين
في حين ان ionomycin مطلوب للحث علي الخلايا الدموية ، يمكن ان تؤدي زيادة تركيزات ionomycin إلى انحلال الدم (اي تحلل كريات الدم الحمراء وإفراز الهيموجلوبين) ، والذي يحتاج إلى تجنب. علاج الكريات الحمراء مع ionomycin 1 μM ...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore at JoVE.com

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

يتم توفير بروتوكول لتحريض الخلايا الخلوية ، والمبرمجة موت الخلية في كريات الحمراء ، وذلك باستخدام ionophore الكالسيوم ، ionomycin ،. يتم تقييم المبرمج الناجح من خلال مراقبه التعريب فوسفاتيديلسيرين في النشرة الخارجية غشاء. وقد تم فحص العوامل التي تؤثر علي نجاح البروتوكول وتوفير الظروف المثلي.

تحريض الخلايا الحمراء للدم باستخدام الكالسيوم الأيوني

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...

كانت هناك العديد من الجهود للحث على الترسب باستخدام الأيونيومايسين. ومع ذلك، فإن الإجراء الدقيق لهذه العملية غير محدد بوضوح في المؤلفات. نحن نقدم إجراء خطوة بخطوة للحث على الترسب باستخدام الأيونيومايسين.الميزة الرئيسية لهذا الإجراء هو حث الكريات الحمراء في الكريات الحمراء البشرية بطريقة موثوقة وقابلة للتكرار. للبدء، إضافة 500 ميكرولترات من الدم الكامل البارد في dextrose سيترات الحمضية إلى أنبوب microcentrifuge. أجهزة الطرد المركزي الدم كله في 700 مرة ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة البلازما واضحة ومعطف رقيقة بافي باستخدام ماصة لمغادرة طبقة الحمراء الحمراء الحمراء.إعداد لتر واحد من الحل رينجر تحتوي على 125 ميليمولار كلوريد الصوديوم، وخمسة كلوريد البوتاسيوم ميليمولار، واحد ميليمولار سلفات المغنيسيوم، 32 ملليمتر HEPES، خمسة الجلوكوز ميليمولار، وكلوريد الكالسيوم ميليمولار واحد. ضبط درجة اله pH إلى 7.4 عن طريق إضافة اثنين من قطرات microliter من هيدروكسيد الصوديوم الضرس واحد. لإعداد محلول Ringer الخالي من الجلوكوز، اتبع نفس البروتوكول ولكن لا تقم بتضمين الجلوكوز في المحلل.غسل الكريات الحمراء مرتين في حل رينجر عن طريق تعليق بيليه الخلية في 1.5 ملليلتر من حل رينجر, الطرد المركزي في 700 مرات ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة عظمى. ثم جعل 0.4٪ الدماتوكريت عن طريق إعادة بناء 40 ميكرولترات من بيليه كريات الدم في 9، 960 ميكرولترات من محلول رينجر خالية من الجلوكوز للوصول إلى حجم النهائي من 10 ملليلتر. احتضان تعليق الخلية في 37 درجة مئوية لمدة سبعة أيام.الحضانة المسبقة للكريات الحمراء في مخزن خال من الجلوكوز يؤدي بشكل كبير إلى حدوث تخدير الدم. تم الحصول على ارتفاع eryptosis بعد سبعة أيام من الحضانة المسبقة في عازلة خالية من السكر. قم بذوبان مليغرام واحد من ملح الكالسيوم الأيوني في 630 ميكرولتر من DMSO للوصول إلى تركيز نهائي من ميليمولار اثنين.Aliquot في 20 ملليلتر وتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية. تأخذ ملليلتر واحد من 0.4٪ المعدة الدم و إضافة 0.5 ميكرولترات من اثنين من المليمولار الأيونيميسين للوصول إلى تركيز نهائي من ميكرومولار واحد. احتضان لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية.استخدام ملليلتر واحد من الدم الماتوسيت مع عدم وجود أي علاج الأيونيميسين كتحكم سلبي. جهاز طرد مركزي المعالجة الايونوميسين وغير المعالجة الدماتوكريتات في 700 مرات ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة المواد الفوقية الخاصة بهم لترك كريات الخلية في الجزء السفلي من الأنابيب. غسل الخلايا ثلاث مرات مع الحل رينجر عن طريق تعليق الكريات الخلية في 1.5 ملليلتر من حل رينجر، الطرد المركزي في 700 مرة ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة والتخلص من االنبات.لقياس الانحلال، إضافة ملليلتر واحد من الدم غير المعالجة 0.4٪ إلى أنبوب microcentrifuge واحتضان لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية كتحكم سلبي من 0٪ انحلال الدم. لإعداد السيطرة الإيجابية على 100٪ من انحلال الدم، إضافة ملليلتر واحد من الدم غير المعالجة 0.4٪ إلى أنبوب ميكروسنتريفوج والطرد المركزي في 700 مرة ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة افرنح وإضافة ملليلتر واحد من الماء المقطر إلى بيليه الخلية إلى resuspend واحتضان لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية.بعد ذلك، أضف ملليلتر واحد من الأيونيوميسين المعالجة 0.4٪ الدم إلى أنبوب microcentrifuge. أجهزة الطرد المركزي الخلايا غير المعالجة، والخلايا المعالجة، والخلايا في الماء المقطر في 700 مرة ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. نقل 200 ميكرولترات من superants في كل بئر من 96 بئر لوحة.قياس امتصاص في 541 نانومتر باستخدام قارئ لوحة صغيرة. حساب الانحلال باستخدام المعادلة حيث A0، A100، و AT هي امتصاص كريات الدم الحمراء في حل رينجر في الماء وامتصاص المجعدات المعالجة بواسطة الأيونيميسين. تمييع مليلترين من العازلة ملزم 5X Annexin-V في ثمانية ملليلتر من برنامج تلفزيوني للحصول على 1X العازلة ملزمة.ريسوسيبند كريات الخلايا المعالجة وغير المعالجة التي تمت معالجتها من الأينومايسين في ملليلتر واحد من العازلة 1X ملزمة. اتخاذ 235 microliters من تعليق الخلية في العازلة ملزمة وإضافة 15 microliters من الملحق الخامس اليكسا فلور 488 متقارن في أنبوب microcentrifuge. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في مكان مظلم.أجهزة الطرد المركزي في 700 مرة ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة المناط. اغسل الخلايا مرتين بمخزن ملزم 1X عن طريق تعليق بيليه الخلية في 1.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للربط و 700 مرة ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.إزالة فائقة و resuspend الكريات الخلية في 250 ميكرولترات من 1X العازلة ملزمة لقياس تدفق الخلايا. الآن نقل 200 ميكرولترات من الملحقين الخامس الكريات الحمراء الملون إلى ملليمتر واحد جولة أسفل أنابيب البوليسترين متوافقة مع تدفق الخلايا. تسجيل الدخول إلى تدفق برنامج القياسات الكيسية وانقر على زر التجربة الجديدة.انقر على زر أنبوب جديد. حدد الورقة العالمية واختر تحليل التطبيق لقياس شدة الفلوريسنس مع الطول الموجي للإثارة من 488 نانومتر و طول موجة من الانبعاثات من 530 نانومتر. تعيين عدد الخلايا إلى 20,000 ليتم جمعها لتحليل فرز الخلايا المُنشّط المُنشطة.حدد الأنبوب المطلوب وانقر على زر التحميل. انقر على زر السجل للأمام مبعثر الجانب وتشتت القياس. كرر لكافة العينات.انقر بزر الماوس الأيمن على زر العينة وانقر على تطبيق تحليل الدفعة لتوليد ملف النتيجة. انقر بزر الماوس الأيمن على زر العينة وانقر على توليد ملفات FSC. في هذا البروتوكول، كان علاج كريات الدم الحمراء بمحلول واحد من محلول الأيونيومايسين والرينغر الصغير لمدة ساعتين كافياً للحث على الضمور كما يتضح من وضع العلامات الناجحة مع Annexin-V Fluor 488 مع بعضها البعض وتحديد كميتها بواسطة تحليل FACS.نتج عن تركيزات أعلى من الأيونيومايسين في خمسة و 10 ميكرومولار زيادة طفيفة في eryptosis. ومع ذلك، فإن هذه التركيزات أيضاً تعزز انحلال الدم. وكان حضانة الكريات الحمراء في محلول الأيونيوميسين ورينغر لمدة أقل من 30 دقيقة كافياً للحث على التخثر.زيادة وقت الحضانة زيادة مستوى eryptosis لمدة تصل إلى ساعتين. ومع ذلك، أدى مزيد من فترة الحضانة في انخفاض طفيف في مستوى eryptosis. أعلى قيمة الانحلال بعد 180 دقيقة يفسر انخفاض في اعماب الدم بعد نفس القدر من الحضانة والخلايا أقل قابلية للحياة موجودة على 180 دقيقة من العلاج مع الأيونيوميسين.وأظهرت كريات الدم الحمراء مع علاج الأيونيميسين إشارة الفلوريس مشرق لربط الملحقين الخامس إلى phosphatidyl سيرين في النشرة الخارجية. في المقابل، أظهرت الخلايا التي ليس لديها علاج إشارة الفلورس ضعيفة للغاية تشير إلى انخفاض شديد في الإرتب. مرحلة ما قبل الحضانة في عازلة خالية من الجلوكوز هو الزناد المهم لاستقراء اعماب الدم.منذ لوحظ eryptosis في مجموعة واسعة من الأمراض، والتجارب التالية لهذا البروتوكول هي حقل محدد. في مختبرنا ، ونحن مهتمون في دراسة آثار الإبرى على الخصائص الحيوية الغشاء والتفاعلات الغشاء مع المواد النانوية. ويرتبط eryptosis مع عدد كبير من الأمراض بما في ذلك مرض السكري, فقر الدم المنجلي, وثالاسييميا.وجود بروتوكول استنساخها لحفز eryptosis يمكن أن تساعد الباحثين في أي من هذه المجالات للتحقيق في مزيد من الأسئلة العلمية المحددة لكل مجال.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

تحليلات لتدفق الكالسيوم المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المستزرعة

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

في فيفو الكالسيوم التصوير في c. الهيئة عضلات الجدار الجسم

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) لعزل الحمض النووي الريبي عن الخلايا البطانية في الجسم الحي

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

كيانات السومو الملزمة (SUBEs) كاداات لإثراء وعزل وتحديد وتوصيف بروتين السومو في سرطان الكبد

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

فائق السرعة الغربية لطخة باستخدام تقنية تحسين رد المناعة

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

التحديد السريع لتقارب الأجسام المضادة- المستضدات بواسطة القياس الضوئي الشامل

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

تكشف حساسية غشاء الميتوكوندريا الداخلي ل Na+ عن برك CoQ وظيفية مجزأة جزئيا

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

طريقة بيولوجية شبه آلية وقابلة للتكرار لتحديد ترسب الكالسيوم في المختبر

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

مقايسة مضان الكالسيوم "مزدوجة الإضافة" للفحص عالي الإنتاجية لمستقبلات البروتين G المؤتلف

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...