Name: induction of eryptosis in red blood cells using a calcium ionophore
Uploaded: 2020-01-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH Grant R15ES030140 og NSF Grant CBET1903568. Økonomisk støtte fra Russ College of Engineering and Technology og Department of Chemical og Biomolecular Engineering på Ohio University er også anerkendt.

Alle humane blodprøver, der anvendes i den nedenfor beskrevne protokol, blev købt som de identificerede prøver. Ingen forsøgspersoner var direkte involveret eller rekrutteret til denne undersøgelse. Retningslinjerne i Helsingfors-erklæringen bør anvendes, når forskningen involverer mennesker.
1. erythrocyt isolation fra fuldblod
<ol><li>Der tilsættes 500 μL fuldblod i syre citrat dextrose (ACD) (opbevares ved 4 °C) til et mikrocentrifuge glas. Bemærk: fuldblod blev købt i ACD...

<ol>
	<li>Bratosin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Cell+Death+in+Mature+Erythrocytes:+A+Model+for+Investigating+Death+Effector+Pathways+Operating+in+the+Absence+of+Mitochondria.">Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 8 (12), 1143-1156 (2001).</li><li>Lang, E., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Pathophysiological+Significance+of+Eryptosis,+the+Suicidal+Erythrocyte+Death.">Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).</li><li>Garnier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+Deformability+in+Diabetes+and+Erythrocyte+Membrane+Lipid+Composition.">Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition.</a> Metabolism. 39 (8), 794-798 (1990).</li><li>Verkleij, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Asymmetric+Distribution+of+Phospholipids+in+the+Human+Red+Cell+Membrane.+A+Combined+Study+Using+Phospholipases+and+Freeze-Etch+Electron+Microscopy.">The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323 (2), 178-193 (1973).</li><li>de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Macrophages+and+Red+Blood+Cells;+A+Complex+Love+Story.">Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story.</a> Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).</li><li>Fadok, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Receptor+for+Phosphatidylserine-Specific+Clearance+of+Apoptotic+Cells.">A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells.</a> Nature. 405 (6782), 85-90 (2000).</li><li>Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phosphatidylserine+Receptor:+A+Crucial+Molecular+Switch.">The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (8), 627-633 (2001).</li><li>Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Insights+into+the+Mechanism+for+Clearance+of+Apoptotic+Cells.">New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells.</a> BioEssays. 22 (10), 878-881 (2000).</li><li>Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis+in+Hereditary+Spherocytosis+and+Thalassemia:+Role+of+Glycoconjugates.">Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates.</a> Glycoconjugate Journal. 27 (9), 717-722 (2010).</li><li>Kuypers, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Altered+Membrane+Phospholipid+Asymmetry+in+Subpopulations+of+Human+Red+Blood+Cells+Using+Fluorescently+Labeled+Annexin+V.">Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V.</a> Blood. 87 (3), 1179-1197 (1996).</li><li>Lang, F., Lang, E., Fller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+Pathophysiology+of+Eryptosis.">Physiology and Pathophysiology of Eryptosis.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 308-314 (2012).</li><li>Wr&#243;bel, A., Bobrowska-H&#228;gerstrand, M., Lindqvist, C., H&#228;gerstrand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Membrane+Phospholipid+Scrambling+in+Human+Erythrocytes+and+K562+Cells+with+FM1-43+-+a+Comparison+with+Annexin+V-FITC.">Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 - a Comparison with Annexin V-FITC.</a> Cellular and Molecular Biology Letters. 19 (2), 262-276 (2014).</li><li>Mohandas, N., Gallagher, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+Cell+Membrane:+Past,+Present,+and+Future.">Red Cell Membrane: Past, Present, and Future.</a> Blood. 112 (10), 3939-3948 (2008).</li><li>Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminophospholipid+Translocase+and+Phospholipid+Scramblase+Activities+in+Sickle+Erythrocyte+Subpopulations.">Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations.</a> British Journal of Haematology. 146 (4), 447-455 (2009).</li><li>Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Review+on+Eryptosis.">A Comprehensive Review on Eryptosis.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 39 (5), 1977-2000 (2016).</li><li>Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-Dependent+Phospholipid+Scrambling+by+TMEM16F.">Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F.</a> Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).</li><li>Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Suicidal+Erythrocyte+Death+by+Volasertib.">Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (4), 1472-1486 (2017).</li><li>Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Phospholipid+Organization+in+Calcium-Loaded+Human+Erythrocytes.">Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 902 (2), 253-262 (1987).</li><li>Alzoubi, K., Calabr&#242;, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+of+Programmed+Erythrocyte+Death+by+Alantolactone.">Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone.</a> Toxins (Basel). 6 (12), 3596-3612 (2014).</li><li>Jacobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+Erythrocyte+Cell+Membrane+Scrambling+by+Mitotane.">Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 4 (33), 1516-1526 (2014).</li><li>Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractoriness+of+Eryptotic+Red+Blood+Cells+to+Plasmodium+Falciparum+Infection:+A+Putative+Host+Defense+Mechanism+Limiting+Parasitaemia.">Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia.</a> PLoS One. 6 (10), e26575 (2011).</li><li>Borst, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Adhesion+of+Eryptotic+Erythrocytes+to+Endothelial+Cells+via+CXCL16/SR-PSOX.">Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (4), C644-C651 (2011).</li><li>Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Phosphatidylserine-Specific+Peptide-Conjugated+Liposomes+Using+a+Model+System+of+Malaria-Infected+Erythrocytes.">Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38 (10), 1649-1651 (2015).</li><li>Mahmud, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suicidal+Erythrocyte+Death,+Eryptosis,+as+a+Novel+Mechanism+in+Heart+Failure-Associated+Anaemia.">Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia.</a> Cardiovascular Research. 98 (1), 37-46 (2013).</li><li>Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+Eryptosis,+the+Suicidal+Erythrocyte+Death+by+Piceatannol.">Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (6), 2300-2310 (2016).</li><li>Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrambling+of+Phospholipids+Activates+Red+Cell+Membrane+Cholesterol.">Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol.</a> Biochemistry. 46 (8), 2233-2238 (2007).</li><li>Lang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis,+a+Window+to+Systemic+Disease.">Eryptosis, a Window to Systemic Disease.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 22 (6), 373-380 (2008).</li><li>Gil-Parrado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionomycin-Activated+Calpain+Triggers+Apoptosis.+A+Probable+Role+for+Bcl-2+Family+Members.">Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27217-27226 (2002).</li><li>Liu, C. M., Hermann, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ionomycin+as+a+Calcium+Ionophore.">Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore.</a> Journal of Biological Chemistry. 253 (17), 5892-5894 (1978).</li><li>Klarl, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Mediates+Erythrocyte+"Programmed+Cell+Death"+Following+Glucose+Depletion.">Protein Kinase C Mediates Erythrocyte "Programmed Cell Death" Following Glucose Depletion.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), C244-C253 (2006).</li><li>Danilov, Y. N., Cohen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Germ+Agglutinin+but+Not+Concanavalin+A+Modulates+Protein+Kinase+C-Mediated+Phosphorylation+of+Red+Cell+Skeletal+Proteins.">Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins.</a> FEBS Letters. 257 (2), 431-434 (1989).</li><li>Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Outer+Leaflet+Is+the+Primary+Regulator+of+Membrane+Damage+Induced+by+Silica+Nanoparticles+in+Vesicles+and+Erythrocytes.">Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes.</a> Environmental Science Nano. 6 (4), 1219-1232 (2019).</li><li>Jaroszeski, M. J., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow Cytometry Protocols. , (2003).</li><li>Ghashghaeinia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Erythrocyte+Age+on+Eryptosis.">The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis.</a> British Journal of Haematology. 157 (5), 1365 (2012).</li><li>Repsold, L., Joubert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis:+An+Erythrocyte's+Suicidal+Type+of+Cell+Death.">Eryptosis: An Erythrocyte's Suicidal Type of Cell Death.</a> Biomed Research International. 2018 (5), 9405617 (2018).</li><li>Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+Binding+Properties+of+Human+Placental+Anticoagulant+Protein-I,+a+Member+of+the+Lipocortin+Family.">Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 7944-7949 (1989).</li><li>Andree, H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Vascular+Anticoagulant+&#945;+(VAC&#945;)+to+Planar+Phospholipid+Bilayers.">Binding of Vascular Anticoagulant &#945; (VAC&#945;) to Planar Phospholipid Bilayers.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (9), 4923-4928 (1990).</li><li>Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+Affinity+and+Cooperativity+of+Annexin+V-Membrane+Binding+under+Conditions+of+Low+Membrane+Occupancy.">Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy.</a> Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).</li><li>Jiang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis+as+an+Underlying+Mechanism+in+Systemic+Lupus+Erythematosus-Related+Anemia.">Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).</li><li>Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+and+Platelet+Proteomics+in+Hematological+Disorders.">Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).</li></ol>

Målet med denne procedure er at tilvejebringe optimale værdier for ionophor koncentration, behandlingstid og ekstracellulær glukose koncentration, som er vigtige faktorer for at sikre vellykket induktion af eryptose. Et kritisk skridt i protokollen er nedbrydningen af ekstracellulær glucose, som trods sin betydning ikke er blevet tilstrækkeligt understreget i litteraturen. Sukkerindholdet i normal ringe opløsning (5 mM) har en hæmmende virkning på eryptose. Glucosedepletering i det ekstracellulære miljø inducer...

Programmeret celledød i erythrocytter, også kendt som eryptose, er almindeligt i mange kliniske tilstande og hæmatologiske lidelser. Eryptose er forbundet med celle svind og tabet af phospholipid asymmetri i cellen plasma membran1,2. Tab af asymmetri resulterer i translokation af Phosphatidylserin (PS), en lipid normalt lokaliseret i den indre folder3,4, til cellen ydre folder, som signalerer til makrofager til fagocytose og fjerne defekte erythrocytter5,6,7,8. Ved afslutningen af den normale levetid af erythrocytter, fjernelse af eryptotiske celler ved makrofager sikrer balancen i erytrocytter i omløb. Men, i syge sygdomme, såsom seglcellesygdom og thalassæmi9,10,11, øget eryptose kan resultere i svær anæmi2. På grund af sin betydning for hæmatologiske sygdomme, er der betydelig interesse i at undersøge de faktorer, inducerende eller hæmme eryptose og de molekylære mekanismer underliggende denne proces.
Plasma membranen af sunde erythrocytter er asymmetrisk, med forskellige fosfolipider lokaliserer på de ydre og indre foldere. Membran asymmetri er primært reguleret af virkningen af membran enzymer. Aminophospholipid translocase letter transport af aminophospholipids, PS og phosphatidylethanolamin (PE), ved at dirigere disse lipiderne til cellens indre folder. På den anden side, floppase transporterer cholin indeholdende fosfolipider, phosphatidylcholin (PC) og sphingomyelin (SM), fra den indre til den ydre folder af cellemembranen12. Men, i modsætning til raske celler, membranen af eryptotiske erythrocytter er forvrænget. Dette skyldes virkningen af et tredje enzym, scramblase, der forstyrrer fosfolipid asymmetri ved at lette tovejs transport af aminophospholipider13,14,15,16. Scramblase aktiveres ved forhøjede intracellulære niveauer på ca2 +. Derfor er calcium ionophorer, som letter transporten af ca2 + på tværs af cellemembranen12, effektive induktorer af eryptose.
Ionomycin, en calcium ionophore, har været almindeligt anvendt til at inducere eryptose i erytrocytter12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Ionomycin har både hydrofile og hydrofobe grupper, som er nødvendige for at binde og fange ca2 + ion, og transportere det til cytosolisk rummet27,28,29. Dette fører til aktivering af scramblase og translokation af PS til den ydre folder, som let kan påvises ved hjælp af bilagin-V, et cellulært protein med en høj affinitet til PS12. Selv om det er almindeligt rapporteret, at ionomycin udløser eryptose, er der en betydelig metode uoverensstemmelse i litteraturen (tabel 1). Populationen af erythrocytter gennemgår eryptose afhænger af forskellige faktorer såsom ionophor koncentration, behandlingstid med ionophor, og sukkerindholdet i ekstracellulære miljø (glucosenedbrydning aktiverer kation kanaler og letter indtastning af ca2 + ind i cytosolisk rummet)30,31. Men, der er lidt konsistens i disse faktorer i litteraturen, gør det vanskeligt at udføre eryptosis reproducerbart in vitro.
I denne protokol præsenterer vi en trin-for-trin procedure for at inducere eryptose i humane erythrocytter. Faktorer, der påvirker vellykket eryptose, herunder ca2 + koncentration, ionophor koncentration, behandlingstid, og præ-inkubation i glukose-depleteret buffer er undersøgt og optimale værdier rapporteres. Denne procedure viser, at præ-inkubation af erytrocytter i en glucosefri buffer øger procentdelen af eryptose i forhold til glucoseholdige buffer. Denne protokol kan anvendes i laboratoriet til at producere eryptotiske erythrocytter til forskellige anvendelser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A10788</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>643177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M7157</td>
			<td>Model Eppendorf 5415C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Zeiss, LSM Tek Thornwood</td>
			<td></td>
			<td>Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses circles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable round bottom flow cytometry tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRU47729-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer (1 M)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7290</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>EMD Milipore Corp.</td>
			<td>407952-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain glass microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HFM microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole blood in ACD</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4 &#176;C and warm to 37 &#176;C prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of eryptosis in red blood cells using a calcium ionophore

Eryptose, erythrocyt programmeret celledød, forekommer i en række hæmatologiske sygdomme og under skade på erythrocytter. Et kendetegn for eryptotiske celler er tabet af kompositoriske asymmetri af cellemembranen, hvilket fører til translokation af phosphatidylserin til membranens ydre folder. Denne proces udløses af øget intracellulær koncentration af ca2 +, som aktiverer scramblase, et enzym, der letter tovejs bevægelse af phospholipider mellem membran foldere. I betragtning af eryptose betydning i forskellige sygdomstilstande, har der været bestræbelser på at inducere eryptose in vitro. Sådanne bestræbelser har generelt påberåbt sig calcium ionophore, ionomycin, at øge intracellulær ca2 + koncentration og inducere eryptose. Men, mange uoverensstemmelser er blevet rapporteret i litteraturen om proceduren for inducerende eryptosis ved hjælp af ionomycin. Heri rapporterer vi en trin-for-trin-protokol for ionomycin-induceret eryptose i humane erythrocytter. Vi fokuserer på vigtige trin i proceduren, herunder ionophor koncentration, inkubationstid, og glukose udtømning, og give repræsentative resultat. Denne protokol kan anvendes til reproducerbart at inducere eryptose i laboratoriet.

Optimering af ionomycin-koncentrationen
Mens ionomycin er nødvendig for at inducere eryptose, kan forhøjede ionomycin koncentrationer føre til hæmolyse (dvs. lyse af erythrocytter og frigivelse af hæmoglobin), som skal undgås. Behandling af erytrocytter med 1 μM ionomycin i ringer løsning for 2 h er nok til at inducere eryptose, som det fremgår af vellykket mærkning med annexin-V Alexa mel 488 konjugat...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore at JoVE.com

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

En protokol til induktion af eryptose, programmeret celledød i erythrocytter, ved hjælp af calcium ionophore, ionomycin, er tilvejebragt. Vellykket eryptose evalueres ved at monitorere lokaliseringen phosphatidylserin i membranen ydre folder. Faktorer, der påvirker protokollens succes, er blevet undersøgt, og de optimale betingelser er opfyldt.

Induktion af Eryptose i røde blodlegemer ved hjælp af en calcium Ionophore

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...

Der har været mange bestræbelser på at fremkalde eryptose ved hjælp af ionomycin. Den nøjagtige procedure for denne proces er imidlertid ikke klart beskrevet i litteraturen. Vi tilbyder en trin-for-trin procedure til at fremkalde eryptose ved hjælp af ionomycin.Den største fordel ved denne procedure er at fremkalde eryptose i menneskelige erythrocytter på en pålidelig og reproducerbar måde. Til at begynde, tilsæt 500 mikroliter koldt fuldblod i syre citrat dextrose til en mikrocentrifuge rør. Centrifuge hele blodet ved 700 gange g i fem minutter ved stuetemperatur og fjerne den klare plasma og den tynde buffy pels ved hjælp af en pipette til at forlade den røde erythrocyt lag.Forbering en liter Ringer-opløsning indeholdende 125 millimolar natriumchlorid, fem millimolar kaliumchlorid, en millimolar magnesiumsulfat, 32 millimolar HEPES, fem millimolarglukose og en millimolar calciumchlorid. PH-chlor. 7,4 justeres ved at tilsætte to mikroliterdråber af en kindtandnatriumhydroxid. For at forberede glukosefri Ringer-opløsning skal du følge den samme protokol, men den omfatter ikke glukose i opløsningen.Erythrocytterne vaskes to gange i Ringe-opløsning ved at suspendere cellepellet i 1,5 milliliter Ringer-opløsning, centrifugeres ved 700 gange g i fem minutter ved stuetemperatur og fjernes supernatanten. Derefter lave en 0,4% hæmatokrit ved at opretholde 40 mikroliter af erythrocyt pellet i 9, 960 mikroliter af glukose-fri Ringer opløsning for at nå et endeligt volumen på 10 milliliter. Inkuber cellesuspensionen ved 37 grader Celsius i syv dage.Præ-inkubation af erythrocytter i en glukose-fri buffer betydeligt udløser eryptose. Høj eryptose blev opnået efter syv dages præ-inkubation i den sukkerfri buffer. Opløs et milligram ionomycin calciumsalt i 630 mikroliter af DMSO for at nå en endelig koncentration på to millimolar.Aliquot i 20 milliliter og opbevares på minus 20 grader Celsius. Tag en milliliter af den forberedte 0,4% hæmatokrit og tilsæt 0,5 mikroliter af to millimolar ionomycin at nå en endelig koncentration af en mikromolar. Inkubere i to timer ved 37 grader Celsius.Brug en milliliter af hæmatokrit uden ionomycin behandling som en negativ kontrol. Centrifuge den ionomycinbehandlede og ubehandlede hæmatokriter ved 700 gange g i fem minutter ved stuetemperatur og fjern deres supernatanter for at efterlade cellepillerne i bunden af rørene. Cellerne vaskes tre gange med Ringer-opløsningen ved at suspendere cellepillerne i 1,5 milliliter Ringer-opløsning, centrifugering ved 700 gange g i fem minutter ved stuetemperatur og kassere supernatanterne.For at måle hæmolyse, tilsæt en milliliter af den ubehandlede 0,4% hæmatokrit til en mikrocentrifuge rør og inkubere i to timer ved 37 grader Celsius som den negative kontrol af 0% hæmolyse. For at forberede den positive kontrol af 100% hæmolyse, tilsæt en milliliter af den ubehandlede 0,4% hæmatokrit til en mikrocentrifuge rør og centrifuge ved 700 gange g i fem minutter ved stuetemperatur. Fjern supernatant og tilsæt en milliliter destilleret vand til cellen pellet til at resuspendere og inkubere i to timer ved 37 grader Celsius.Dernæst tilsættes en milliliter af ionomycin behandlet 0,4% hæmatokrit til en mikrocentrifuge rør. Centrifuge de ubehandlede celler, behandlede celler, og cellerne i destilleret vand ved 700 gange g i fem minutter ved stuetemperatur. Overfør 200 mikroliter af supernatanterne i hver brønd af en 96-brønd plade.Absorbansen måles ved 541 nanometer ved hjælp af en mikropladelæser. Hemolyse ved hjælp af ligningen, hvor A0, A100 og AT er absorbansen af erythrocytter i Ringer-opløsningen i vand og absorbansen af behandlede erthyrocytter med ionomycin. To milliliter bindingsbufferen 5X Annexin-V fortyndes i otte milliliter PBS for at opnå en 1X bindingsbuffer.Opsaltning af ionomycinbehandlede og ubehandlede cellepiller i en milliliter af 1X-bindingsbufferen. Tag 235 mikroliter af cellesuspensionerne i bindingsbufferen, og tilsæt 15 mikroliter af annexin-V Alexa Fluor 488 konjugat i et mikrocentrifugerør. Inkuber cellerne ved stuetemperatur i 20 minutter på et mørkt sted.Centrifuge ved 700 gange g i fem minutter ved stuetemperatur. Fjern supernatanten. Cellerne vaskes to gange med 1X bindingsbuffer ved at suspendere cellepellet i 1,5 milliliter af bindingsbufferen og centrifugering ved 700 gange g i fem minutter ved stuetemperatur.Fjern supernatanten, og opslæmp cellepillerne i 250 mikroliter af 1X bindingsbuffer til måling af flowcytometri. Overfør nu 200 mikroliter af de farvesede erythrocytter i Annexin-V til en milliliter rund polystyrenrør, der er kompatible med flowcytometri. Log ind på flow cytometri software og klik på den nye eksperiment knap.Klik på den nye rørknap. Vælg det globale ark, og vælg den anvende analyse, der skal måles fluorescensintensiteten med en excitation bølgelængde på 488 nanometer og en emissionsbølgelængde på 530 nanometer. Angiv antallet af celler til 20.000, der skal indsamles til fluorescensaktiv cellesorteringsanalyse.Vælg det ønskede rør og klik på belastningsknappen. Klik på post-knappen for fremadgående scatter og side scatter måling. Gentag for alle prøver.Højreklik på prøveknappen, og klik på anvend batchanalyse for at generere resultatfilen. Højreklik på prøven knappen og klik på generere FSC filer. I denne protokol var behandling af erythrocytter med en mikromolarionomycin- og ringeopløsning i to timer nok til at fremkalde eryptose, som det fremgår af en vellykket mærkning med annexin-V fluor 488 konjugat og kvantificering ved FACS-analyse.Højere koncentrationer af ionomycin ved fem og 10 mikromolar resulterede i en lille stigning i eryptose. Men sådanne koncentrationer også øget hæmolyse. Inkubation af erythrocytter i ionomycin og Ringer opløsning for så lidt som 30 minutter var nok til at fremkalde erytose.Øget inkubationstid øgede niveauet af eryptose i op til to timer. Yderligere inkubationstid resulterede imidlertid i et mindre fald i eryposisniveauet. Den højere værdi af hæmolyse efter 180 minutter forklarer reduktionen i eryptose efter den samme mængde inkubation som mindre levedygtige celler eksisterede efter 180 minutters behandling med ionomycin.Erythrocytter med behandling af ionomycin viste et lyst fluorescenssignal til bindingen af annexin-V til phosphatidyy serin i den ydre indlægsseddel. I modsætning hertil viste celler uden behandling et meget svagt fluorescenssignal, der indikerer meget lav eryptose. Præ-inkubation i en glukose-fri buffer er en vigtig udløser for induktion af eryptose.Da eryptose er observeret i en bred vifte af sygdomme, eksperimenter efter denne protokol er feltspecifikke. I vores laboratorium er vi interesseret i at undersøge virkningerne af eryptosis på membranbiofysiske egenskaber og membraninteraktioner med nanomaterialer. Eryptose er forbundet med et stort antal sygdomme, herunder diabetes, seglcelle anæmi, og thalassæmi.At have en reproducerbar protokol for overtalelse af eryptose kan hjælpe forskere på et hvilket som helst af disse områder med at undersøge yderligere videnskabelige spørgsmål, der er specifikke for hvert område.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyser af mitokondrie Calcium tilstrømning i isolerede mitochondrier og kulturperler celler

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In vivo calcium Imaging i C. elegans krop væg muskler

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Oversættelse af Ribosome affinitets rensning (TRAP) for RNA-isolation fra endotelceller in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende enheder (SUBEs) som værktøjer til berigelse, isolation, identifikation og karakterisering af SUMO Proteome i leverkræft

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ultra-High-Speed Western Blot ved hjælp af immunoreaktionsfremmende teknologi

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Hurtig bestemmelse af antistof-antigen affinitet ved massefotometri

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Indre mitokondriemembranfølsomhed over for Na+ afslører delvist segmenterede funktionelle CoQ-puljer

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

En semi-automatiseret og reproducerbar biologisk baseret metode til kvantificering af calciumaflejring in vitro

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Et "dual-addition" calciumfluorescensassay til high-throughput screening af rekombinante G-proteinkoblede receptorer

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...