Name: induction of eryptosis in red blood cells using a calcium ionophore
Uploaded: 2020-01-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la subvention des NIH R15ES030140 et la subvention DE nSF CBET1903568. Le soutien financier du Russ College of Engineering and Technology et du Département de génie chimique et biomoléculaire de l'Université de l'Ohio est également reconnu.

Tous les échantillons de sang humain utilisés dans le protocole décrit ci-dessous ont été achetés comme échantillons dé-identifiés. Aucun sujet humain n'a été directement impliqué ou recruté pour cette étude. Les lignes directrices de la Déclaration d'Helsinki devraient être utilisées lorsque la recherche porte sur des sujets humains.
1. Isolement d'érythrocyte du sang entier
<ol><li>Ajouter 500 ll de sang entier dans du dextrose de citrate acide (ACD) (stocké à 4 oC) dan...

<ol>
	<li>Bratosin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Cell+Death+in+Mature+Erythrocytes:+A+Model+for+Investigating+Death+Effector+Pathways+Operating+in+the+Absence+of+Mitochondria.">Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 8 (12), 1143-1156 (2001).</li><li>Lang, E., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Pathophysiological+Significance+of+Eryptosis,+the+Suicidal+Erythrocyte+Death.">Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).</li><li>Garnier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+Deformability+in+Diabetes+and+Erythrocyte+Membrane+Lipid+Composition.">Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition.</a> Metabolism. 39 (8), 794-798 (1990).</li><li>Verkleij, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Asymmetric+Distribution+of+Phospholipids+in+the+Human+Red+Cell+Membrane.+A+Combined+Study+Using+Phospholipases+and+Freeze-Etch+Electron+Microscopy.">The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323 (2), 178-193 (1973).</li><li>de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Macrophages+and+Red+Blood+Cells;+A+Complex+Love+Story.">Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story.</a> Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).</li><li>Fadok, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Receptor+for+Phosphatidylserine-Specific+Clearance+of+Apoptotic+Cells.">A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells.</a> Nature. 405 (6782), 85-90 (2000).</li><li>Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phosphatidylserine+Receptor:+A+Crucial+Molecular+Switch.">The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (8), 627-633 (2001).</li><li>Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Insights+into+the+Mechanism+for+Clearance+of+Apoptotic+Cells.">New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells.</a> BioEssays. 22 (10), 878-881 (2000).</li><li>Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis+in+Hereditary+Spherocytosis+and+Thalassemia:+Role+of+Glycoconjugates.">Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates.</a> Glycoconjugate Journal. 27 (9), 717-722 (2010).</li><li>Kuypers, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Altered+Membrane+Phospholipid+Asymmetry+in+Subpopulations+of+Human+Red+Blood+Cells+Using+Fluorescently+Labeled+Annexin+V.">Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V.</a> Blood. 87 (3), 1179-1197 (1996).</li><li>Lang, F., Lang, E., Fller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+Pathophysiology+of+Eryptosis.">Physiology and Pathophysiology of Eryptosis.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 308-314 (2012).</li><li>Wr&#243;bel, A., Bobrowska-H&#228;gerstrand, M., Lindqvist, C., H&#228;gerstrand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Membrane+Phospholipid+Scrambling+in+Human+Erythrocytes+and+K562+Cells+with+FM1-43+-+a+Comparison+with+Annexin+V-FITC.">Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 - a Comparison with Annexin V-FITC.</a> Cellular and Molecular Biology Letters. 19 (2), 262-276 (2014).</li><li>Mohandas, N., Gallagher, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+Cell+Membrane:+Past,+Present,+and+Future.">Red Cell Membrane: Past, Present, and Future.</a> Blood. 112 (10), 3939-3948 (2008).</li><li>Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminophospholipid+Translocase+and+Phospholipid+Scramblase+Activities+in+Sickle+Erythrocyte+Subpopulations.">Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations.</a> British Journal of Haematology. 146 (4), 447-455 (2009).</li><li>Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Review+on+Eryptosis.">A Comprehensive Review on Eryptosis.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 39 (5), 1977-2000 (2016).</li><li>Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-Dependent+Phospholipid+Scrambling+by+TMEM16F.">Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F.</a> Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).</li><li>Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Suicidal+Erythrocyte+Death+by+Volasertib.">Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (4), 1472-1486 (2017).</li><li>Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Phospholipid+Organization+in+Calcium-Loaded+Human+Erythrocytes.">Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 902 (2), 253-262 (1987).</li><li>Alzoubi, K., Calabr&#242;, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+of+Programmed+Erythrocyte+Death+by+Alantolactone.">Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone.</a> Toxins (Basel). 6 (12), 3596-3612 (2014).</li><li>Jacobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+Erythrocyte+Cell+Membrane+Scrambling+by+Mitotane.">Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 4 (33), 1516-1526 (2014).</li><li>Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractoriness+of+Eryptotic+Red+Blood+Cells+to+Plasmodium+Falciparum+Infection:+A+Putative+Host+Defense+Mechanism+Limiting+Parasitaemia.">Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia.</a> PLoS One. 6 (10), e26575 (2011).</li><li>Borst, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Adhesion+of+Eryptotic+Erythrocytes+to+Endothelial+Cells+via+CXCL16/SR-PSOX.">Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (4), C644-C651 (2011).</li><li>Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Phosphatidylserine-Specific+Peptide-Conjugated+Liposomes+Using+a+Model+System+of+Malaria-Infected+Erythrocytes.">Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38 (10), 1649-1651 (2015).</li><li>Mahmud, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suicidal+Erythrocyte+Death,+Eryptosis,+as+a+Novel+Mechanism+in+Heart+Failure-Associated+Anaemia.">Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia.</a> Cardiovascular Research. 98 (1), 37-46 (2013).</li><li>Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+Eryptosis,+the+Suicidal+Erythrocyte+Death+by+Piceatannol.">Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (6), 2300-2310 (2016).</li><li>Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrambling+of+Phospholipids+Activates+Red+Cell+Membrane+Cholesterol.">Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol.</a> Biochemistry. 46 (8), 2233-2238 (2007).</li><li>Lang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis,+a+Window+to+Systemic+Disease.">Eryptosis, a Window to Systemic Disease.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 22 (6), 373-380 (2008).</li><li>Gil-Parrado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionomycin-Activated+Calpain+Triggers+Apoptosis.+A+Probable+Role+for+Bcl-2+Family+Members.">Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27217-27226 (2002).</li><li>Liu, C. M., Hermann, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ionomycin+as+a+Calcium+Ionophore.">Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore.</a> Journal of Biological Chemistry. 253 (17), 5892-5894 (1978).</li><li>Klarl, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Mediates+Erythrocyte+"Programmed+Cell+Death"+Following+Glucose+Depletion.">Protein Kinase C Mediates Erythrocyte "Programmed Cell Death" Following Glucose Depletion.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), C244-C253 (2006).</li><li>Danilov, Y. N., Cohen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Germ+Agglutinin+but+Not+Concanavalin+A+Modulates+Protein+Kinase+C-Mediated+Phosphorylation+of+Red+Cell+Skeletal+Proteins.">Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins.</a> FEBS Letters. 257 (2), 431-434 (1989).</li><li>Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Outer+Leaflet+Is+the+Primary+Regulator+of+Membrane+Damage+Induced+by+Silica+Nanoparticles+in+Vesicles+and+Erythrocytes.">Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes.</a> Environmental Science Nano. 6 (4), 1219-1232 (2019).</li><li>Jaroszeski, M. J., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow Cytometry Protocols. , (2003).</li><li>Ghashghaeinia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Erythrocyte+Age+on+Eryptosis.">The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis.</a> British Journal of Haematology. 157 (5), 1365 (2012).</li><li>Repsold, L., Joubert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis:+An+Erythrocyte's+Suicidal+Type+of+Cell+Death.">Eryptosis: An Erythrocyte's Suicidal Type of Cell Death.</a> Biomed Research International. 2018 (5), 9405617 (2018).</li><li>Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+Binding+Properties+of+Human+Placental+Anticoagulant+Protein-I,+a+Member+of+the+Lipocortin+Family.">Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 7944-7949 (1989).</li><li>Andree, H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Vascular+Anticoagulant+&#945;+(VAC&#945;)+to+Planar+Phospholipid+Bilayers.">Binding of Vascular Anticoagulant &#945; (VAC&#945;) to Planar Phospholipid Bilayers.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (9), 4923-4928 (1990).</li><li>Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+Affinity+and+Cooperativity+of+Annexin+V-Membrane+Binding+under+Conditions+of+Low+Membrane+Occupancy.">Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy.</a> Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).</li><li>Jiang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis+as+an+Underlying+Mechanism+in+Systemic+Lupus+Erythematosus-Related+Anemia.">Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).</li><li>Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+and+Platelet+Proteomics+in+Hematological+Disorders.">Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).</li></ol>

Le but de cette procédure est de fournir des valeurs optimales pour la concentration d'ionophore, le temps de traitement, et la concentration extracellulaire de glucose, qui sont des facteurs importants en assurant l'induction réussie de l'éryptosis. Une étape critique dans le protocole est l'épuisement du glucose extracellulaire, qui, en dépit de son importance, n'a pas été suffisamment souligné dans la littérature. La teneur en sucre dans la solution Ringer normale (5 mM) a un effet inhibiteur sur l'éryptose...

La mort cellulaire programmée dans les érythrocytes, également connu sous le nom d'éryptosis, est commune dans beaucoup d'conditions cliniques et de désordres hématologiques. L'éryptose est associée au rétrécissement cellulaire et à la perte d'asymétrie phospholipide dans la membrane plasmatique cellulaire1,2. La perte d'asymétrie entraîne la translocation de la phosphatidylserine (PS), un lipide normalement localisé dans le dépliant intérieur3,4, à la foliole externe de la cellule, qui signale aux macrophages de phagocytose et d'enlever les érythrocytes défectueux5,6,7,8. À la fin de la durée de vie normale des érythrocytes, l'ablation des cellules éryptotiques par macrophages assure l'équilibre des érythrocytes en circulation. Cependant, dans les conditions malades, telles que la drépanocytose et la thalassémie9,10,11, éryptose améliorée peut entraîner une anémie sévère2. En raison de son importance dans les maladies hématologiques, il y a un intérêt significatif dans l'examen des facteurs induisant ou inhibant l'éryptosis et les mécanismes moléculaires sous-jacents à ce processus.
La membrane plasmatique des érythrocytes sains est asymétrique, avec différents phospholipides localisés aux folioles extérieures et intérieures. L'asymétrie membranaire est principalement régulée par l'action des enzymes membranaires. La translocase aminophospholipide facilite le transport des aminophospholipides, ps et phosphatidylethanolamine (PE), en dirigeant ces lipides vers le foliole interne de la cellule. D'autre part, le floppase transporte la choline contenant des phospholipides, de la phosphatidylcholine (PC) et de la sphingomyéline (SM), de l'intérieur à la foliole externe de la membrane cellulaire12. Cependant, contrairement aux cellules saines, la membrane des érythrocytes éryptotiques est brouillée. Cela est dû à l'action d'une troisième enzyme, scramblase, qui perturbe l'asymétrie phospholipide en facilitant le transport bidirectionnel des aminophospholipides13,14,15,16. Scramblase est activé par des niveaux intracellulaires élevés de Ca2. Par conséquent, les ionophores de calcium, qui facilitent le transport de Ca2 à travers la membrane cellulaire12,sont des inducteurs efficaces de l'éryptose.
Ionomycin, un ionophore de calcium, a été largement utilisé pour induire l'éryptose dans les érythrocytes12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Ionomycin a à la fois des groupes hydrophiles et hydrophobes, qui sont nécessaires pour lier et capturer Ca2 ion, et le transporter à l'espace cytosolique27,28,29. Cela conduit à l'activation de la broussase et la translocation de PS à la foliole externe, qui peut être facilement détectée à l'aide de l'annexine-V, une protéine cellulaire avec une forte affinité à PS12. Bien que l'éryptose de déclenchement par ionomycine soit généralement rapportée, il y a l'écart considérable de méthode dans la littérature (tableau 1). La population d'érythrocytes subissant l'éryptosis dépend de différents facteurs tels que la concentration d'ionophore, le temps de traitement avec l'ionophore, et la teneur en sucre de l'environnement extracellulaire (l'épuisement de glucose active des canaux de cation et facilite l'entrée de Ca2 dans l'espace cytosolique)30,31. Cependant, il y a peu de cohérence dans ces facteurs dans la littérature, ce qui rend difficile d'effectuer l'éryptose reproductiblement in vitro.
Dans ce protocole, nous présentons une procédure étape par étape pour induire l'éryptosis dans les érythrocytes humains. Les facteurs affectant l'éryptose réussie, y compris la concentration de Ca2, la concentration d'ionophore, le temps de traitement, et la pré-incubation dans le tampon glucose-appauvri sont examinés et des valeurs optimales sont rapportées. Cette procédure démontre que la pré-incubation des érythrocytes dans un tampon sans glucose augmente considérablement le pourcentage d'éryptosis par rapport au tampon contenant du glucose. Ce protocole peut être utilisé en laboratoire pour produire des érythrocytes éryptotiques pour diverses applications.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A10788</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>643177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M7157</td>
			<td>Model Eppendorf 5415C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Zeiss, LSM Tek Thornwood</td>
			<td></td>
			<td>Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses circles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable round bottom flow cytometry tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRU47729-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer (1 M)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7290</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>EMD Milipore Corp.</td>
			<td>407952-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain glass microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HFM microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole blood in ACD</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4 &#176;C and warm to 37 &#176;C prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of eryptosis in red blood cells using a calcium ionophore

L'éryptose, érythrocyte programmé la mort cellulaire, se produit dans un certain nombre de maladies hématologiques et pendant les dommages aux érythrocytes. Une caractéristique des cellules éryptotiques est la perte de l'asymétrie compositionnelle de la membrane cellulaire, conduisant à la translocation de la phosphatidylserine à la foliole externe de membrane. Ce processus est déclenché par une concentration intracellulaire accrue de Ca2,qui active la scramblase, une enzyme qui facilite le mouvement bidirectionnel des phospholipides entre les folioles membranaires. Compte tenu de l'importance de l'éryptose dans diverses conditions malades, il ya eu des efforts pour induire l'éryptose in vitro. Ces efforts ont généralement compté sur l'ionophore de calcium, l'ionomycine, pour augmenter la concentration intracellulaire de Ca2 et induire l'éryptosis. Cependant, beaucoup d'écarts ont été rapportés dans la littérature concernant la procédure pour induire l'éryptosis utilisant l'ionomycine. Ici, nous rapportons un protocole étape par étape pour l'éryptosis induit par l'ionomycine dans les érythrocytes humains. Nous nous concentrons sur les étapes importantes dans la procédure, y compris la concentration d'ionophore, le temps d'incubation, et l'épuisement de glucose, et fournissons le résultat représentatif. Ce protocole peut être utilisé pour induire une éryptose reproductible en laboratoire.

Optimisation de la concentration d'ionomycine
Tandis que l'ionomycine est exigée pour induire l'éryptosis, les concentrations accrues d'ionomycine peuvent mener à l'hémolyse (c.-à-d. lysis des érythrocytes et à la libération de l'hémoglobine), qui doit être évitée. Le traitement des érythrocytes avec 1 ionomycine m dans la solution Ringer pendant 2 h suffit à induire l'éryptose, comme en témoigne...

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Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

Un protocole pour l'induction de l'éryptose, la mort cellulaire programmée dans les érythrocytes, utilisant l'ionophore de calcium, l'ionomycine, est fourni. L'éryptose réussie est évaluée en surveillant la phosphatidylserine de localisation dans le foliole externe de membrane. Les facteurs qui influent sur le succès du protocole ont été examinés et des conditions optimales ont été fournies.

Induction de l'éryptose dans les globules rouges à l'aide d'un ionophore de calcium

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...

Il y a eu beaucoup d’efforts pour induire l’éryptose utilisant l’ionomycine. Toutefois, la procédure exacte de ce processus n’est pas clairement décrite dans la littérature. Nous fournissons une procédure étape par étape pour induire l’éryptose utilisant l’ionomycine.Le principal avantage de cette procédure est d’induire l’éryptose chez les érythrocytes humains d’une manière fiable et reproductible. Pour commencer, ajouter 500 microlitres de sang entier froid dans le dextrose de citrate acide à un tube de microcentrifugeuse. Centrifuger le sang entier à 700 fois g pendant cinq minutes à température ambiante et enlever le plasma clair et la fine couche buffy à l’aide d’une pipette pour laisser la couche d’érythrocyte rouge.Préparez un litre de solution Ringer contenant du chlorure de sodium de 125 millimlaires, du chlorure de potassium millimolaire, un sulfate de magnésium millimolaire, 32 millimolaires hepes, cinq millimolaires de glucose et un chlorure de calcium millimolaire. Réglez le pH à 7,4 en ajoutant deux gouttes de microlitre d’un hydroxyde de sodium molaire. Pour préparer la solution Ringer sans glucose, suivez le même protocole mais n’incluez pas le glucose dans la solution.Lavez les érythrocytes deux fois dans la solution Ringer en suspendant la pastille cellulaire dans 1,5 millilitres de solution Ringer, en centrifugant à 700 fois g pendant cinq minutes à température ambiante et en enlevant le supernatant. Ensuite, faire un hematocrit de 0,4% en résustant 40 microlitres de la pastille érythrocyte en 9,960 microlitres de solution Ringer sans glucose pour atteindre un volume final de 10 millilitres. Incuber la suspension cellulaire à 37 degrés Celsius pendant sept jours.La pré-incubation des érythrocytes dans un tampon sans glucose déclenche considérablement l’éryptose. L’éryptose élevée a été obtenue après sept jours de pré-incubation dans le tampon sans sucre. Dissoudre un milligramme de sel de calcium ionomycine dans 630 microlitres de DMSO pour atteindre une concentration finale de deux millimolaires.Aliquot en 20 millilitres et stocker à moins 20 degrés Celsius. Prenez un millilitre de l’hématocrit préparé de 0,4% et ajoutez 0,5 microlitres de deux ionomycine millimolaire pour atteindre une concentration finale d’un micromolaire. Incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius.Utilisez un millilitre de l’hématocrit sans traitement à l’ionomycine comme un contrôle négatif. Centrifugeuse l’ionomycine traitée et non traitée hématocrits à 700 fois g pendant cinq minutes à température ambiante et enlever leurs supernatants pour laisser les granulés cellulaires au fond des tubes. Lavez les cellules trois fois avec la solution Ringer en suspendant les granulés cellulaires dans 1,5 millilitres de solution Ringer, en centrifugant à 700 fois g pendant cinq minutes à température ambiante et en jetant les supernatants.Pour mesurer l’hémolyse, ajouter un millilitre de l’hématocrit non traité de 0,4 % à un tube de microcentrifugeuse et incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius comme le contrôle négatif de l’hémolyse de 0 %. Pour préparer le contrôle positif de l’hémolyse à 100 %, ajoutez un millilitre de l’hématocrit non traité de 0,4 % à un tube de microcentrifugeuse et à une centrifugeuse à 700 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Retirer le supernatant et ajouter un millilitre d’eau distillée à la pastille cellulaire pour la résuspendre et l’incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius.Ensuite, ajouter un millilitre de l’ionomycine traitée 0,4% hématocrit à un tube de microcentrifugeuse. Centrifugez les cellules non traitées, les cellules traitées et les cellules dans l’eau distillée à 700 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Transférer 200 microlitres des supernatants dans chaque puits d’une plaque de 96 puits.Mesurez l’absorption à 541 nanomètres à l’aide d’un lecteur de micro plaque. Calculer l’hémolyse à l’aide de l’équation où A0, A100 et AT sont l’absorption des érythrocytes dans la solution Ringer dans l’eau et l’absorption des erthyrocytes traités par l’ionomycine. Diluer deux millilitres du tampon de liaison 5X Annexin-V en huit millilitres de PBS pour obtenir un tampon de liaison 1X.Resuspendez les granulés cellulaires traités à l’ionomycine et non traités en un millilitre du tampon de liaison 1X. Prendre 235 microlitres des suspensions cellulaires dans le tampon de liaison et ajouter 15 microlitres d’Annexin-V Alexa Fluor 488 conjuguer dans un tube de microcentrifugeuse. Incuber les cellules à température ambiante pendant 20 minutes dans un endroit sombre.Centrifugeuse à 700 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Retirer le surnatant. Lavez les cellules deux fois avec un tampon liant 1X en suspendant la pastille cellulaire dans 1,5 millilitres du tampon liant et en centrifugant à 700 fois g pendant cinq minutes à température ambiante.Enlevez le supernatant et resuspendez les granulés cellulaires dans 250 microlitres de tampon de liaison 1X pour la mesure de cytométrie d’écoulement. Transférez maintenant 200 microlitres des érythrocytes tachés Annexin-V à des tubes de polystyrène ronds d’un millilitre compatibles avec la cytométrie du débit. Connectez-vous au logiciel de cytométrie de flux et cliquez sur le nouveau bouton d’expérience.Cliquez sur le nouveau bouton tube. Sélectionnez la feuille globale et choisissez l’analyse d’application pour mesurer l’intensité de fluorescence avec une longueur d’onde d’excitation de 488 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 530 nanomètres. Réglez le nombre de cellules à 20 000 à recueillir pour l’analyse du tri cellulaire activé par fluorescence.Sélectionnez le tube désiré et cliquez sur le bouton de charge. Cliquez sur le bouton enregistrer pour la diffusion vers l’avant et la mesure de dispersion latérale. Répéter pour tous les échantillons.Cliquez à droite sur le bouton spécimen et cliquez sur appliquer l’analyse des lots pour générer le fichier de résultats. Cliquez à droite sur le bouton spécimen et cliquez sur générer des fichiers FSC. Dans ce protocole, le traitement des érythrocytes avec une solution micromolar d’ionomycine et de ringer pendant deux heures était suffisant pour induire l’éryptose comme démontré par l’étiquetage réussi avec annexin-V Fluor 488 conjugué et quantification par analyse d’FACS.Des concentrations plus élevées d’ionomycine à cinq et 10 micromolaires ont entraîné une légère augmentation de l’éryptose. Cependant, de telles concentrations ont également augmenté l’hémolyse. L’incubation des érythrocytes dans la solution d’ionomycine et de Ringer pendant aussi peu que 30 minutes était suffisante pour induire l’éryptose.L’augmentation du temps d’incubation a augmenté le niveau d’éryptose jusqu’à deux heures. Cependant, le temps d’incubation supplémentaire a eu comme conséquence une légère diminution du niveau d’éryptose. La valeur plus élevée de l’hémolyse après 180 minutes explique la réduction de l’éryptose après la même quantité d’incubation que les cellules moins viables existaient sur 180 minutes de traitement par ionomycine.Les érythrocytes avec le traitement d’ionomycine ont montré un signal lumineux de fluorescence à la liaison d’Annexin-V à la sérine de phosphatidyl dans le foliole externe. En revanche, les cellules sans traitement ont montré un signal de fluorescence très faible indiquant l’éryptose très basse. La pré-incubation dans un tampon sans glucose est un déclencheur important de l’induction de l’éryptose.Puisque l’éryptose est observée dans un large éventail de maladies, les expériences suivant ce protocole sont spécifiques au domaine. Dans notre laboratoire, nous sommes intéressés à examiner les effets de l’éryptose sur les propriétés biophysiques membranaires et les interactions membranaires avec les nanomatériaux. L’éryptose est associée à un grand nombre de maladies, y compris le diabète, l’anémie falciforme et la thalassémie.Avoir un protocole reproductible pour induire l’éryptose peut aider les chercheurs dans l’un de ces domaines à étudier d’autres questions scientifiques spécifiques à chaque domaine.

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Biochemistry

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