Name: induction of eryptosis in red blood cells using a calcium ionophore
Uploaded: 2020-01-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענק R15ES030140 ו NSF מענק CBET1903568. תמיכה פיננסית מהמכללה ראס להנדסה וטכנולוגיה והמחלקה להנדסה כימית וביוקולקולארית באוניברסיטת אוהיו מוכרת גם כן.

כל דגימות הדם האנושיות המשמשות בפרוטוקול המתואר להלן נרכשו כדגימות דה מזוהה. שום אדם לא היה מעורב במישרין. או גויס למחקר הזה יש להשתמש בהנחיות של הצהרת הלסינקי כאשר המחקר כולל נושאים אנושיים.
1. בידוד אריתרופוציט מדם שלם
<ol><li>הוסף 500 μL של דם שלם ב חומצה ציטראט דקסטרוז (ACD) (מאו...

<ol>
	<li>Bratosin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Cell+Death+in+Mature+Erythrocytes:+A+Model+for+Investigating+Death+Effector+Pathways+Operating+in+the+Absence+of+Mitochondria.">Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 8 (12), 1143-1156 (2001).</li><li>Lang, E., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Pathophysiological+Significance+of+Eryptosis,+the+Suicidal+Erythrocyte+Death.">Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).</li><li>Garnier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+Deformability+in+Diabetes+and+Erythrocyte+Membrane+Lipid+Composition.">Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition.</a> Metabolism. 39 (8), 794-798 (1990).</li><li>Verkleij, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Asymmetric+Distribution+of+Phospholipids+in+the+Human+Red+Cell+Membrane.+A+Combined+Study+Using+Phospholipases+and+Freeze-Etch+Electron+Microscopy.">The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323 (2), 178-193 (1973).</li><li>de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Macrophages+and+Red+Blood+Cells;+A+Complex+Love+Story.">Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story.</a> Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).</li><li>Fadok, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Receptor+for+Phosphatidylserine-Specific+Clearance+of+Apoptotic+Cells.">A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells.</a> Nature. 405 (6782), 85-90 (2000).</li><li>Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phosphatidylserine+Receptor:+A+Crucial+Molecular+Switch.">The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (8), 627-633 (2001).</li><li>Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Insights+into+the+Mechanism+for+Clearance+of+Apoptotic+Cells.">New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells.</a> BioEssays. 22 (10), 878-881 (2000).</li><li>Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis+in+Hereditary+Spherocytosis+and+Thalassemia:+Role+of+Glycoconjugates.">Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates.</a> Glycoconjugate Journal. 27 (9), 717-722 (2010).</li><li>Kuypers, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Altered+Membrane+Phospholipid+Asymmetry+in+Subpopulations+of+Human+Red+Blood+Cells+Using+Fluorescently+Labeled+Annexin+V.">Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V.</a> Blood. 87 (3), 1179-1197 (1996).</li><li>Lang, F., Lang, E., Fller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+Pathophysiology+of+Eryptosis.">Physiology and Pathophysiology of Eryptosis.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 308-314 (2012).</li><li>Wr&#243;bel, A., Bobrowska-H&#228;gerstrand, M., Lindqvist, C., H&#228;gerstrand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Membrane+Phospholipid+Scrambling+in+Human+Erythrocytes+and+K562+Cells+with+FM1-43+-+a+Comparison+with+Annexin+V-FITC.">Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 - a Comparison with Annexin V-FITC.</a> Cellular and Molecular Biology Letters. 19 (2), 262-276 (2014).</li><li>Mohandas, N., Gallagher, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+Cell+Membrane:+Past,+Present,+and+Future.">Red Cell Membrane: Past, Present, and Future.</a> Blood. 112 (10), 3939-3948 (2008).</li><li>Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminophospholipid+Translocase+and+Phospholipid+Scramblase+Activities+in+Sickle+Erythrocyte+Subpopulations.">Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations.</a> British Journal of Haematology. 146 (4), 447-455 (2009).</li><li>Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Review+on+Eryptosis.">A Comprehensive Review on Eryptosis.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 39 (5), 1977-2000 (2016).</li><li>Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-Dependent+Phospholipid+Scrambling+by+TMEM16F.">Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F.</a> Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).</li><li>Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Suicidal+Erythrocyte+Death+by+Volasertib.">Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (4), 1472-1486 (2017).</li><li>Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Phospholipid+Organization+in+Calcium-Loaded+Human+Erythrocytes.">Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 902 (2), 253-262 (1987).</li><li>Alzoubi, K., Calabr&#242;, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+of+Programmed+Erythrocyte+Death+by+Alantolactone.">Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone.</a> Toxins (Basel). 6 (12), 3596-3612 (2014).</li><li>Jacobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+Erythrocyte+Cell+Membrane+Scrambling+by+Mitotane.">Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 4 (33), 1516-1526 (2014).</li><li>Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractoriness+of+Eryptotic+Red+Blood+Cells+to+Plasmodium+Falciparum+Infection:+A+Putative+Host+Defense+Mechanism+Limiting+Parasitaemia.">Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia.</a> PLoS One. 6 (10), e26575 (2011).</li><li>Borst, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Adhesion+of+Eryptotic+Erythrocytes+to+Endothelial+Cells+via+CXCL16/SR-PSOX.">Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (4), C644-C651 (2011).</li><li>Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Phosphatidylserine-Specific+Peptide-Conjugated+Liposomes+Using+a+Model+System+of+Malaria-Infected+Erythrocytes.">Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38 (10), 1649-1651 (2015).</li><li>Mahmud, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suicidal+Erythrocyte+Death,+Eryptosis,+as+a+Novel+Mechanism+in+Heart+Failure-Associated+Anaemia.">Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia.</a> Cardiovascular Research. 98 (1), 37-46 (2013).</li><li>Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+Eryptosis,+the+Suicidal+Erythrocyte+Death+by+Piceatannol.">Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (6), 2300-2310 (2016).</li><li>Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrambling+of+Phospholipids+Activates+Red+Cell+Membrane+Cholesterol.">Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol.</a> Biochemistry. 46 (8), 2233-2238 (2007).</li><li>Lang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis,+a+Window+to+Systemic+Disease.">Eryptosis, a Window to Systemic Disease.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 22 (6), 373-380 (2008).</li><li>Gil-Parrado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionomycin-Activated+Calpain+Triggers+Apoptosis.+A+Probable+Role+for+Bcl-2+Family+Members.">Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27217-27226 (2002).</li><li>Liu, C. M., Hermann, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ionomycin+as+a+Calcium+Ionophore.">Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore.</a> Journal of Biological Chemistry. 253 (17), 5892-5894 (1978).</li><li>Klarl, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Mediates+Erythrocyte+"Programmed+Cell+Death"+Following+Glucose+Depletion.">Protein Kinase C Mediates Erythrocyte "Programmed Cell Death" Following Glucose Depletion.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), C244-C253 (2006).</li><li>Danilov, Y. N., Cohen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Germ+Agglutinin+but+Not+Concanavalin+A+Modulates+Protein+Kinase+C-Mediated+Phosphorylation+of+Red+Cell+Skeletal+Proteins.">Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins.</a> FEBS Letters. 257 (2), 431-434 (1989).</li><li>Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Outer+Leaflet+Is+the+Primary+Regulator+of+Membrane+Damage+Induced+by+Silica+Nanoparticles+in+Vesicles+and+Erythrocytes.">Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes.</a> Environmental Science Nano. 6 (4), 1219-1232 (2019).</li><li>Jaroszeski, M. J., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow Cytometry Protocols. , (2003).</li><li>Ghashghaeinia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Erythrocyte+Age+on+Eryptosis.">The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis.</a> British Journal of Haematology. 157 (5), 1365 (2012).</li><li>Repsold, L., Joubert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis:+An+Erythrocyte's+Suicidal+Type+of+Cell+Death.">Eryptosis: An Erythrocyte's Suicidal Type of Cell Death.</a> Biomed Research International. 2018 (5), 9405617 (2018).</li><li>Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+Binding+Properties+of+Human+Placental+Anticoagulant+Protein-I,+a+Member+of+the+Lipocortin+Family.">Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 7944-7949 (1989).</li><li>Andree, H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Vascular+Anticoagulant+&#945;+(VAC&#945;)+to+Planar+Phospholipid+Bilayers.">Binding of Vascular Anticoagulant &#945; (VAC&#945;) to Planar Phospholipid Bilayers.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (9), 4923-4928 (1990).</li><li>Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+Affinity+and+Cooperativity+of+Annexin+V-Membrane+Binding+under+Conditions+of+Low+Membrane+Occupancy.">Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy.</a> Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).</li><li>Jiang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis+as+an+Underlying+Mechanism+in+Systemic+Lupus+Erythematosus-Related+Anemia.">Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).</li><li>Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+and+Platelet+Proteomics+in+Hematological+Disorders.">Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).</li></ol>

המטרה של הליך זה היא לספק ערכים אופטימליים עבור ריכוז ביופור, זמן הטיפול, וריכוז גלוקוז החילוץ, שהם גורמים חשובים בהבטחת אינדוקציה מוצלחת של האריטוסיס. צעד קריטי בפרוטוקול הוא דלדול הגלוקוז של החילוץ, אשר, למרות חשיבותו, לא הודגש מספיק בספרות. תכולת הסוכר בפתרון הצלצול הרגיל (5 מ"מ) היא בעלת ...

מוות תאים מתוכנת ב אריתרופוציטים, הידוע גם בשם eryptosis, הוא נפוץ בתנאים קליניים רבים הפרעות המטולוגית. Eryptosis קשורה להתכווצות התאים ואובדן פוספוליפיד-סימטריה בקרום פלזמה התא1,2. אובדן של א. א. א. תוצאות ב רוברטסוניים של זרחן (PS), שומנים בדרך כלל מקומי בעלון הפנימי3,4, אל העלון החיצוני התא, אשר אותות מקרופאגים כדי phagocytose ולהסיר אריתרופוציטים פגום5,6,7,8. בסוף תוחלת החיים הנורמלית של אריתרופוציטים, הסרת התאים eryptotic על ידי מקרופאגים מבטיח את האיזון של אריתרופוציטים במחזור הדם. עם זאת, בתנאים חולים, כגון מחלת תאים מגל ו תלסמיה9,10,11, eryptosis משופרת עלולה לגרום לאנמיה חמורה2. בשל חשיבותו במחלות המטולוגית, יש עניין משמעותי בבדיקת הגורמים העלולים להיות מעכבים או לעכב את המנגנונים המולקולריים ואת המנגנון המולקולרי שבבסיס תהליך זה.
קרום הפלזמה של אריתרופוציטים בריאים הוא אסימטרי, עם שונים פוספוליפידים לוקליזציה על העלונים החיצוניים והפנימיים. א-סימטריה ממברנה מוסדר בעיקר על ידי פעולה של אנזימים ממברנה. Aminophospholipid טרנסלוקייס מקלה על ההובלה של aminophospholipids, PS ו פוספולידילטהולאמין (PE), על ידי הנחיית שומנים אלה אל העלון הפנימי של התא. מצד שני, floppase מסיע את כולין המכיל פוספוליפידים, זרחן (PC) ו ספינגומיילין (SM), מן הפנימי אל העלעל החיצוני של קרום התא12. עם זאת, בניגוד לתאים בריאים, קרום של האריתרופוציטים eryptotic מעורבל. הדבר נובע מהפעולה של אנזים שלישי, השבלקלז, אשר משבש פוספוליפיד על אי-סימטריה על ידי הקלה על ההובלה הדו-כיוונית של aminophospholipids13,14,15,16. הסמבלאז מופעל על ידי רמות תאיים גבוהות של Ca2 +. לכן, סידן ionophores, אשר להקל על ההובלה של Ca2 + על פני קרום התא12, הם השראות יעיל של אריפיסיס.
איקונמיצין, סידן מיואופלפור, נעשה שימוש נרחב כדי לגרום לאריטוסיס ב אריתרופוציטים12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. איקונמיצין יש גם קבוצות ידרופילי ו הידרופובי, אשר נחוצים כדי לאגד וללכוד Ca2 + יון, ולהעביר אותו לחלל ציטוסולג27,28,29. הדבר מוביל להפעלת הסמבלאז והטרנסלוקציה של PS לעלעל החיצוני, שניתן לאתרם בקלות באמצעות השימוש ב-אנסי-V, חלבון תאי בעל זיקה גבוהה ל-PS12. למרות שמפעיל את האירוטוזה על ידי איקונמיצין מדווחים בדרך כלל, יש אי-התאמה ניכרת בשיטה בספרות (שולחן 1). האוכלוסייה של אריתרופוציטים שעברו אריטוציטוזה תלוי בגורמים שונים כגון ריכוז ביוופפור, זמן טיפול עם היופופור, ואת תכולת הסוכר של הסביבה המרחפת (גלוקוז המחסור מפעיל ערוצי הקטיון ומקל את הכניסה של Ca2 + לתוך שטח cytosolic)30,31. עם זאת, יש מעט עקביות בגורמים אלה בספרות, מה שמקשה על ביצוע של האריטוסיס בלתי מתורבת.
בפרוטוקול זה, אנו מציגים הליך צעד אחר צעד כדי לזרז את התהליך של אריתרופוציטים אנושיים. הגורמים המשפיעים על האריטוסיס המצליח כולל Ca2 + ריכוז, ריכוז ביופור, זמן טיפול, וטרום דגירה במאגר מרוקן גלוקוז נבדקים ערכים אופטימליים מדווחים. הליך זה מדגים כי טרום דגירה של אריתרופוציטים במאגר נטול גלוקוז מגדיל באופן משמעותי את אחוז האריטוזה לעומת מאגר המכיל גלוקוז. פרוטוקול זה יכול לשמש במעבדה כדי לייצר האריציטים eryptotic עבור יישומים שונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A10788</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>643177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M7157</td>
			<td>Model Eppendorf 5415C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Zeiss, LSM Tek Thornwood</td>
			<td></td>
			<td>Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses circles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable round bottom flow cytometry tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRU47729-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer (1 M)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7290</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>EMD Milipore Corp.</td>
			<td>407952-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain glass microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HFM microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole blood in ACD</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4 &#176;C and warm to 37 &#176;C prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of eryptosis in red blood cells using a calcium ionophore

האריציטוזה, מוות מתוכנת באמצעות אריתרופוציטים, מתרחש במספר מחלות המטאולוגיות ובמהלך הפגיעה באריתרופותאי. הסימן ההיכר של התאים eryptotic הוא אובדן של הקובית סימטריה של קרום התא, המוביל הטרנסלוקציה של פוספארידילסרין אל העלון החיצוני קרום. תהליך זה מופעל על ידי ריכוז תאיים מוגבר של Ca2 +, אשר מפעיל את הסמבלאז, אנזים המקל על התנועה הדו של פוספוליפידים בין עלונים ממברנה. בהתחשב בחשיבות הארגטוזה בתנאים נגועים שונים, היו מאמצים לגרום לארגטוזה בתוך מבחנה. מאמצים כאלה בדרך כלל להסתמך על הסידן היואופלפור, איקונמיצין, כדי לשפר את Ca תאיים2 + ריכוז ולגרום אריפיסיס. עם זאת, אי-התאמות רבים דווחו בספרות לגבי ההליך לגרימת שימוש באיקונמיצין. להלן, אנו מדווחים על פרוטוקול צעד אחר צעד לאיקונמיצין-המושרה באמצעות אריתרופוציטים אנושיים. אנו מתמקדים בצעדים חשובים בהליך, כולל ריכוז ביופור, זמן דגירה, ומחסור בגלוקוז, ולספק תוצאה מייצגת. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לאפשר באופן מידי לגרום הארגיוסיס במעבדה.

אופטימיזציה של הריכוז האיקונמיצין
בעוד איקונמיצין נדרש כדי לזרז את האריטוסיס, ריכוזי ionomycin מוגברת יכולים להוביל למוליזיס (כלומר, הליזה של אריתרופוציטים ושחרור של המוגלובין), אשר צריך להימנע. הטיפול של אריתרופוציטים עם 1 μM ionomycin ?...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore at JoVE.com

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

פרוטוקול עבור אינדוקציה של אריטוזה, מוות תאים מתוכנת ב אריתרופוציטים, באמצעות סידן היואופלפור, איקונמיצין, מסופק. הערכה מוצלחת מוערכת על-ידי ניטור פוספוליזה של הלוקליזציה בעלון החיצוני של הממברנה. הגורמים המשפיעים על הצלחת הפרוטוקול נבדקו ותנאים אופטימליים שסופקו.

אינדוקציה של אירוטוזה בתאי דם אדומים באמצעות היואופלפור סידן

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...

היו מאמצים רבים כדי לגרום אריפטוזיס באמצעות ionomycin. עם זאת, ההליך המדויק לתהליך זה אינו מתואר בבירור בספרות. אנו מספקים הליך צעד אחר צעד כדי לגרום אריפטוזיס באמצעות ionomycin.היתרון העיקרי של הליך זה הוא לגרום אריפטוזיס אריתרוציטים אנושיים בצורה אמינה לשחזור. כדי להתחיל, להוסיף 500 microliters של דם שלם קר חומצה ציטראט דקסטרוז לצינור מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה את כל הדם ב 700 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את הפלזמה ברורה ואת מעיל באפי דק באמצעות פיפטה לעזוב את שכבת אריתרוקיט אדום.הכן ליטר אחד של תותב רינגר המכיל 125 מילימולר נתרן כלורי, חמישה מילימולר אשלגן כלורי, מגנזיום גופרתי מילימולארי אחד, 32 מילימולרים HEPES, חמישה מילימולר גלוקוז, ואחד מילימולר סידן כלורי. כוונן את ה- pH ל- 7.4 על-ידי הוספת שתי טיפות מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד טוחן אחד. כדי להכין פתרון צלצול ללא גלוקוז, בצע את אותו פרוטוקול אך אינם כוללים גלוקוז בתסרון.לשטוף את אריתרוציטים פעמיים בתתבת רינגר על ידי השעיית גלולת התא ב 1.5 מיליליטר של פתרון רינגר, צנטריפוגה ב 700 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והסרת supernatant. לאחר מכן לעשות 0.4% hematocrit על ידי שימוש חוזר 40 microliters של גלולת אריתרוסיטים ב 9, 960 microliters של פתרון צלצול ללא גלוקוז כדי להגיע לנפח הסופי של 10 מיליליטר. דגירה ההשעיה התא ב 37 מעלות צלזיוס במשך שבעה ימים.הדגירה מראש של אריתוציטים במאגר ללא גלוקוז מפעילה באופן משמעותי אריפטוזיס. אריפטוזיס גבוה הושג לאחר שבעה ימים של טרום דגירה במאגר ללא סוכר. ממיסים מיליגרם אחד של מלח סידן יונימיצין ב 630 microliters של DMSO כדי להגיע לריכוז סופי של שני מילימולרים.Aliquot ב 20 מיליליטר ולאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס. קח מיליליטר אחד של 0.4% המטוקריט מוכן ולהוסיף 0.5 microliters של שני ionomycin מילימולרית כדי להגיע לריכוז סופי של micromolar אחד. דגירה במשך שעתיים ב37 מעלות צלזיוס.השתמש מיליליטר אחד של המטוקריט ללא טיפול ionomycin כשליטה שלילית. צנטריפוגה ionomycin מטופלים המטוקריט מטופלים ב 700 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatants שלהם להשאיר את כדורי התא בתחתית הצינורות. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם פתרון צלצול על ידי השעיית כדורי התא ב 1.5 מיליליטר של פתרון רינגר, צנטריפוגה ב 700 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והשליכת supernatants.כדי למדוד המוליזה, מוסיפים מיליליטר אחד של ההמטוקריט הלא מטופל 0.4% לצינור מיקרוצנטריפוגה ודגירה במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס כשליטה שלילית של 0%hemolysis. כדי להכין את השליטה החיובית של 100%hemolysis, להוסיף מיליליטר אחד של hematocrit מטופל 0.4% לצינור microcentrifuge וצנטריפוגה ב 700 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מוציאים את העל-טבעי ומוסיפים מיליליטר אחד של מים מזוקקים לכדור התא כדי לעשות שימוש חוזר ותודגר במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של היונומיצין שטופלו 0.4% המטוקריט לצינור מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה התאים שאינם מטופלים, תאים מטופלים, ואת התאים במים מזוקקים ב 700 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים 200 מיקרוליטרים של העל-טבעיים לכל באר של צלחת של 96 בארות.למדוד את הספיגה ב 541 ננומטר באמצעות קורא לוחות מיקרו. חשב את ההמוליזה באמצעות המשוואה שבה A0, A100 ו- AT הם ספיגת אריתרוציטים בתמיסת רינגר במים וספיגת אריתירוציטים מטופלים על ידי ionomycin. לדלל שני מיליליטר של מאגר איגוד 5X Annexin-V בשמונה מיליליטר של PBS כדי להשיג מאגר איגוד 1X.לחץ מחדש על כדורי התאים שטופלו ביונימיצין ולא מטופלים במיליליטר אחד של מאגר הכריכה 1X. קח 235 microliters של מתלי התא במאגר מחייב ולהוסיף 15 microliters של Annexin-V אלקסה פלואור 488 חידה בצינור מיקרוצנטריפוגה. דגירה התאים בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות במקום חשוך.צנטריפוגה ב 700 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הסר את העל-טבעי. לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ מחייב 1X על ידי השעיית גלולת התא ב 1.5 מיליליטר של המאגר מחייב צנטריפוגה ב 700 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.הסר את supernatant ו resuspend כדורי התא ב 250 microliters של מאגר כריכה 1X למדידת ציטומטריה זרימה. עכשיו להעביר 200 microliters של אריתרוסיטים מוכתמים Annexin-V לצינורות פוליסטירן תחתונים עגולים מיליליטר תואם ציטומטריית זרימה. היכנס לתוכנה cytometry זרימה ולחץ על כפתור הניסוי החדש.לחץ על כפתור הצינור החדש. בחר את הגיליון הכללי ובחר את ניתוח החל כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות עם אורך גל של 488 ננומטר ואורך גל פליטה של 530 ננומטר. הגדר את מספר התאים ל- 20,000 שיש לאסוף לניתוח מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות.בחר את הצינור הרצוי ולחץ על כפתור העומס. לחץ על כפתור הקלטה עבור פיזור קדימה ומדידת פיזור בצד. חזור על הפעולה עבור כל הדגימות.לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על לחצן הדגימה ולחץ על החל ניתוח אצווה כדי ליצור את קובץ התוצאה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על לחצן דגימה ולחץ על ליצור קבצי FSC. בפרוטוקול זה, טיפול אריתרוסיטים עם פתרון אחד ionomycin מיקרומולרי ו רינגר במשך שעתיים היה מספיק כדי לגרום אריפטוזיס כפי שמעיד על ידי תיוג מוצלח עם נספח-V פלואור 488 חידה כימות על ידי ניתוח FACS.ריכוזים גבוהים יותר של ionomycin ב 5 ו 10 micromolar הביא לעלייה קלה אריפטוזיס. עם זאת, ריכוזים כאלה גם שיפרו את ההמוליזה. דגירה של אריתרוציטים בתמיסת ionomycin ו- Ringer במשך 30 דקות בלבד הספיקה כדי לגרום לאריפטוזיס.זמן הדגירה המוגבר העלה את רמת אריפטוזיס עד שעתיים. עם זאת, זמן דגירה נוסף הביא לירידה קלה ברמת אריפטוזיס. הערך הגבוה יותר של המוליזה לאחר 180 דקות מסביר את הירידה ב אריפטוזיס לאחר אותה כמות של דגירה כמו תאים פחות קיימא היה קיים על 180 דקות של טיפול עם ionomycin.אריתרוציטים עם טיפול ionomycin הראו אות פלואורסצנטי בהיר מחייב של Annexin-V כדי phosphatidyl סרין בעלון החיצוני. לעומת זאת, תאים ללא טיפול הראו אות פלואורסצנטי חלש מאוד המציין אריפטוזיס נמוך מאוד. טרום הדגירה במאגר ללא גלוקוז הוא גורם חשוב עבור אינדוקציה של אריפטוזיס.מאז אריפטוזיס נצפתה במגוון רחב של מחלות, הניסויים הבאים פרוטוקול זה הם ספציפיים לשדה. במעבדה שלנו, אנו מעוניינים לבחון את ההשפעות של אריפטוזיס על תכונות ביופיזיות קרום אינטראקציות קרום עם ננו. אריפטוזיס קשורה למספר רב של מחלות כולל סוכרת, אנמיה חרמשית ותלמיה.לאחר פרוטוקול לשחזור ל גרימת אריפטוזיס יכול לעזור לחוקרים בכל אחד מהתחומים האלה כדי לחקור שאלות מדעיות נוספות ספציפיות לכל תחום.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

ניתוחים של סידן מיטוכונדריאלי זרם המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

מחייב סומו ישויות (SUBEs) ככלים עבור העשרה, בידוד, זיהוי, ואפיון של פרוטאום סומו בסרטן הכבד

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

כתם מערבי במהירות גבוהה במיוחד באמצעות טכנולוגיית שיפור Immunoreaction

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

נחישות מהירה של זיקה נוגדנים אנטיגן על ידי פוטומטריה המונית

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

רגישות הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית ל-Na+ חושפת בריכות CoQ פונקציונליות מפולחות חלקית

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

שיטה חצי אוטומטית וניתנת לשחזור ביולוגית לכימות תצהיר סידן במבחנה

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...