Name: induction of eryptosis in red blood cells using a calcium ionophore
Uploaded: 2020-01-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH R15ES030140 e dalla concessione NSF CBET1903568. È stato riconosciuto anche il sostegno finanziario del Russ College of Engineering and Technology e del Department of Chemical and Biomolecular Engineering dell'Università dell'Ohio.

Tutti i campioni di sangue umano utilizzati nel protocollo descritto di seguito sono stati acquistati come campioni de-identificati. Nessun soggetto umano è stato direttamente coinvolto o reclutato per questo studio. Le linee guida della Dichiarazione di Helsinki dovrebbero essere utilizzate quando la ricerca coinvolge soggetti umani.
1. Isolamento degli eritrociti dal sangue intero
<ol><li>Aggiungere 500 l di sangue intero nel citrato acido dextrose (ACD) (conservato a 4 gradi centigradi) ...

<ol>
	<li>Bratosin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Cell+Death+in+Mature+Erythrocytes:+A+Model+for+Investigating+Death+Effector+Pathways+Operating+in+the+Absence+of+Mitochondria.">Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 8 (12), 1143-1156 (2001).</li><li>Lang, E., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Pathophysiological+Significance+of+Eryptosis,+the+Suicidal+Erythrocyte+Death.">Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).</li><li>Garnier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+Deformability+in+Diabetes+and+Erythrocyte+Membrane+Lipid+Composition.">Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition.</a> Metabolism. 39 (8), 794-798 (1990).</li><li>Verkleij, A. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrambling+of+Phospholipids+Activates+Red+Cell+Membrane+Cholesterol.">Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol.</a> Biochemistry. 46 (8), 2233-2238 (2007).</li><li>Lang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis,+a+Window+to+Systemic+Disease.">Eryptosis, a Window to Systemic Disease.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 22 (6), 373-380 (2008).</li><li>Gil-Parrado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionomycin-Activated+Calpain+Triggers+Apoptosis.+A+Probable+Role+for+Bcl-2+Family+Members.">Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27217-27226 (2002).</li><li>Liu, C. M., Hermann, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ionomycin+as+a+Calcium+Ionophore.">Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore.</a> Journal of Biological Chemistry. 253 (17), 5892-5894 (1978).</li><li>Klarl, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Mediates+Erythrocyte+"Programmed+Cell+Death"+Following+Glucose+Depletion.">Protein Kinase C Mediates Erythrocyte "Programmed Cell Death" Following Glucose Depletion.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), C244-C253 (2006).</li><li>Danilov, Y. N., Cohen, C. 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F., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+Affinity+and+Cooperativity+of+Annexin+V-Membrane+Binding+under+Conditions+of+Low+Membrane+Occupancy.">Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy.</a> Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).</li><li>Jiang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis+as+an+Underlying+Mechanism+in+Systemic+Lupus+Erythematosus-Related+Anemia.">Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).</li><li>Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+and+Platelet+Proteomics+in+Hematological+Disorders.">Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).</li></ol>

L'obiettivo di questa procedura è quello di fornire valori ottimali per la concentrazione di ionoforo, il tempo di trattamento e la concentrazione di glucosio extracellulare, che sono fattori importanti per garantire una corretta induzione di eriptosi. Un passo critico nel protocollo è l'esaurimento del glucosio extracellulare, che, nonostante la sua importanza, non è stato sufficientemente sottolineato nella letteratura. Il contenuto di zucchero nella normale soluzione Ringer (5 mM) ha un effetto inibitorio sull'eryp...

La morte cellulare programmata negli eritrociti, nota anche come eriptosi, è comune in molte condizioni cliniche e disturbi ematologici. L'eryptosi è associata al restringimento cellulare e alla perdita di asimmetria fosfolipidide nella membrana plasmatica cellulare1,2. La perdita di asimmetria provoca la traslocazione della fosfatidiladila (PS), un lipido normalmente localizzato nell'opuscolo interno3,4, nel volantino esterno della cellula, che segnala ai macrofagi di fagocitosi e rimuove gli eritrociti difettosi5,6,7,8. Alla fine della normale durata della vita degli eritrociti, la rimozione delle cellule eriftotiche dai macrofagi garantisce l'equilibrio degli eritrociti in circolazione. Tuttavia, in condizioni di malattia, come la malattia delle cellule falciformi e talassemia9,10,11, una maggiore eryptosi può provocare anemia grave2. A causa della sua importanza nelle malattie ematologiche, c'è un interesse significativo nell'esaminare i fattori che inducono o inibiscono l'eryptosi e i meccanismi molecolari alla base di questo processo.
La membrana plasmatica di eritrociti sani è asimmetrica, con diversi fosfolipidi che si localizzano nei volantini esterni e interni. L'asimmetria della membrana è regolata principalmente dall'azione degli enzimi della membrana. La translocasi aminofosofilidi consente il trasporto di aminoofosbantidi, PS e fosfatidylethanolamina (PE), indirizzando questi lipidi al foglietto interno della cellula. D'altra parte, il floppase trasporta la colina contenente fosfolipidi, fosfatidilcolina (PC) e sphingomyelin (SM), dal volantino interno a quello esterno della membrana cellulare12. Tuttavia, a differenza delle cellule sane, la membrana degli eritrociti erittoticiti è strapazzata. Ciò è dovuto all'azione di un terzo enzima, la scramblase, che interrompe l'asimmetria fosfolipidi facilitando il trasporto bidirezionale degli aminoofolipidi13,14,15,16. La Scramblase viene attivata da livelli intracellulari elevati di Ca2. Pertanto, gli ionofori di calcio, che facilitano il trasporto di Ca2 o attraverso la membrana cellulare12, sono efficienti induttori di eriptosi.
Ionomycin, un ionoforo di calcio, è stato ampiamente utilizzato per indurre eryptosi in eritrocites12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. L'ionomicina ha sia gruppi idrofili che idrofobici, che sono necessari per legare e catturare gli ioni Ca2 e trasportarlo nello spazio citosolico27,28,29. Questo porta all'attivazione della scramblase e alla traslocazione di PS al volantino esterno, che può essere facilmente rilevato utilizzando l'allegato-V, una proteina cellulare ad alta affinità con PS12. Sebbene sia comunemente riportata l'eriptosi mediante ionomycina, vi è una notevole discrepanza di metodi nella letteratura (Tabella 1). La popolazione di eritrociti sottoposti a eriptosi dipende da diversi fattori come la concentrazione di ionoforo, il tempo di trattamento con l'ionoforo e il contenuto di zucchero dell'ambiente extracellulare (l'esaurimento del glucosio attiva i canali di cation e facilita l'ingresso di Ca2, nello spazio citoco)30,31. Tuttavia, c'è poca coerenza in questi fattori nella letteratura, rendendo difficile eseguire l'eryptosi riproducibilmente in vitro.
In questo protocollo, presentiamo una procedura passo-passo per indurre l'eriptosi negli eritrociti umani. Vengono esaminati i fattori che influiscono sul successo dell'eryptosi, tra cui la concentrazione di Ca2o, la concentrazione di ionoforo, il tempo di trattamento e la pre-incubazione nel buffer impoverito di glucosio e vengono riportati valori ottimali. Questa procedura dimostra che la pre-incubazione degli eritrociti in un buffer privo di glucosio aumenta significativamente la percentuale di eryptosi rispetto al buffer contenente glucosio. Questo protocollo può essere utilizzato in laboratorio per produrre eritrociti eritotici per varie applicazioni.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A10788</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>643177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M7157</td>
			<td>Model Eppendorf 5415C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Zeiss, LSM Tek Thornwood</td>
			<td></td>
			<td>Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses circles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable round bottom flow cytometry tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRU47729-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer (1 M)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7290</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>EMD Milipore Corp.</td>
			<td>407952-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain glass microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HFM microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole blood in ACD</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4 &#176;C and warm to 37 &#176;C prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of eryptosis in red blood cells using a calcium ionophore

L'eriptosi, l'eritrocito morto cellulare programmato, si verifica in una serie di malattie ematologiche e durante la lesione agli eritrociti. Un segno distintivo delle cellule eriptotiche è la perdita di asimmetria compositiva della membrana cellulare, che porta alla traslocazione della fosfatidilanella nel volantino esterno della membrana. Questo processo è innescato da una maggiore concentrazione intracellulare di Ca2 ,che attiva la scramblase, un enzima che facilita il movimento bidirezionale dei fosfolipidi tra volantini a membrana. Data l'importanza dell'eriptosi in varie condizioni malate, ci sono stati sforzi per indurre l'eriptosi in vitro. Tali sforzi si sono generalmente affidati all'ionoforo di calcio, la ionomycina, per migliorare la concentrazione intracellulare di Ca2 e indurre l'eriptosi. Tuttavia, molte discrepanze sono state segnalate nella letteratura per quanto riguarda la procedura per indurre l'eryptosi utilizzando ionomycina. Qui, riportiamo un protocollo passo-passo per l'eriptosi indotta da ionomicina negli eritrociti umani. Ci concentriamo su importanti passi nella procedura, tra cui la concentrazione di ionoforo, il tempo di incubazione e l'esaurimento del glucosio e forniamo risultati rappresentativi. Questo protocollo può essere utilizzato per indurre riproducibilmente l'eryptosi in laboratorio.

Ottimizzazione della concentrazione di ionomycina
Mentre l'iononomicina è necessaria per indurre l'eriptosi, l'aumento delle concentrazioni di ionomycina può portare all'emolisi (cioè la lisi degli eritrociti e il rilascio di emoglobina), che deve essere evitata. Il trattamento degli erittrociti con 1 .M ionomycin soluzione per 2 h è sufficiente per indurre l'eryptosi, come dimostra l'etichettatura di succes...

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Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

Viene fornito un protocollo per l'induzione dell'eriptosi, la morte cellulare programmata negli eritrociti, utilizzando l'ionoforo di calcio, la ionomycina. L'eryptosi di successo viene valutata monitorando la fosfatidilaserina di localizzazione nel foglietto illustrativo esterno della membrana. Sono stati esaminati i fattori che influiscono sul successo del protocollo e sono state fornite condizioni ottimali.

Induzione dell'eriptosi nei globuli rossi utilizzando un ionoforo di calcio

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...

Ci sono stati molti sforzi per indurre l'erioptosi usando la ionomicina. Tuttavia, la procedura esatta per questo processo non è chiaramente delineata nella letteratura. Forniamo una procedura passo-passo per indurre l'erioptosi usando l'ionomicina.Il principale vantaggio di questa procedura è quello di indurre l'erioptosi negli eriociti umani in modo affidabile e riproducibile. Per iniziare, aggiungere 500 microlitri di sangue intero freddo in destrosio citrato acido a un tubo di microcentrifugo. Centrifugare il sangue intero a 700 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere il plasma chiaro e il sottile mantello di buffy usando una pipetta per lasciare lo strato di eriocite rosso.Preparare un litro di soluzione ringer contenente 125 cloruro di sodio millimolare, cinque cloruri millimolare di potassio, un solfato di magnesio millimolare, 32 HEPES millimolare, cinque millimolare di glucosio e un cloruro di calcio millimolare. Regolare il pH a 7,4 aggiungendo due gocce di microlitero di un idrossido di sodio molare. Per preparare la soluzione Ringer senza glucosio, seguire lo stesso protocollo ma non includere il glucosio nella soluzione.Lavare gli erytrociti due volte in soluzione Ringer sospendendo il pellet cellulare in 1,5 millilitri di soluzione Ringer, centrifugando a 700 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovendo il supernatante. Quindi fare uno 0,4% di ematocrito rimescolando 40 microlitri del pellet di eritemo in 9.960 microlitri di soluzione Ringer senza glucosio per raggiungere un volume finale di 10 millilitri. Incubare la sospensione cellulare a 37 gradi Celsius per sette giorni.La pre-incubazione di eriociti in un tampone privo di glucosio innesca significativamente l'erettidosi. L'alta erettidosi è stata ottenuta dopo sette giorni di pre-incubazione nel tampone senza zucchero. Sciogliere un milligrammo di sale di calcio di ionomicina in 630 microlitri di DMSO per raggiungere una concentrazione finale di due millimolari.Aliquota in 20 millilitri e conservare a meno 20 gradi Celsius. Prendere un millilitro dello 0,4% di ematocrito preparato e aggiungere 0,5 microlitri di due ionomicina millimolare per raggiungere una concentrazione finale di un micromolare. Incubare per due ore a 37 gradi Celsius.Utilizzare un millilitro dell'ematocrito senza trattamento con ionomicina come controllo negativo. Centrifugare gli ematocriti trattati con ionomicina e non trattati a 700 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere i loro supernaganti per lasciare i pellet cellulari nella parte inferiore dei tubi. Lavare le celle tre volte con soluzione Ringer sospendendo i pellet cellulari in 1,5 millilitri di soluzione Ringer, centrifugando a 700 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente e scartando i supernatanti.Per misurare l'emolisi, aggiungere un millilitro dell'ematocrito non trattato allo 0,4% a un tubo di microcentrifugo e incubare per due ore a 37 gradi Celsius come controllo negativo dello 0%emolisi. Per preparare il controllo positivo dell'emolisi al 100%, aggiungere un millilitro dell'ematocrito non trattato allo 0,4% a un tubo di microcentrifugo e centrifugare a 700 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il supernatante e aggiungere un millilitro di acqua distillata al pellet cellulare per rimescolare e incubare per due ore a 37 gradi Celsius.Aggiungere quindi un millilitro della ionomicina trattata con 0,4% di ematocrito a un tubo di microcentrifugo. Centrifugare le cellule non trattate, le cellule trattate e le cellule in acqua distillata a 700 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Trasferire 200 microlitri dei supernatanti in ogni pozzo di una piastra da 96 porri.Misurare l'assorbanza a 541 nanometri utilizzando un lettore di micro lastre. Calcola l'emolisi usando l'equazione in cui A0, A100 e AT sono l'assorbanza degli eriociti nella soluzione di Ringer in acqua e l'assorbanza degli erthyrociti trattati dalla ionomicina. Diluire due millilitri del tampone di legame 5X Annexin-V in otto millilitri di PBS per ottenere un buffer di legame 1X.Rimossare il pellet di cellule trattate con ionomicina e non trattate in un millilitro del tampone di legame 1X. Prendere 235 microlitri delle sospensioni cellulari nel tampone di legame e aggiungere 15 microlitri di annesso-V Alexa Fluor 488 coniugati in un tubo di microcentrifugo. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 20 minuti in un luogo buio.Centrifugare a 700 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il supernatante. Lavare le celle due volte con tampone legante 1X sospendendo il pellet cellulare in 1,5 millilitri del tampone di legame e centrifugando a 700 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente.Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 250 microlitri di tampone legante 1X per la misurazione della citometria del flusso. Ora trasferisci 200 microlitri degli erytrociti macchiati Annexin-V in un tubi di polistirolo rotondo inferiore millilitro compatibili con la citometria a flusso. Accedere al software di citometria a flusso e fare clic sul nuovo pulsante esperimento.Clicca sul nuovo pulsante del tubo. Selezionare il foglio globale e scegliere l'analisi di applicazione per misurare l'intensità della fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nanometri. Impostare il numero di celle su 20.000 da raccogliere per l'analisi di smistamento delle celle attivata a fluorescenza.Selezionare il tubo desiderato e fare clic sul pulsante di caricamento. Fare clic sul pulsante di registrazione per la misurazione della dispersione in avanti e della dispersione laterale. Ripetere l'audio per tutti i campioni.Fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante del campione e scegliere applica analisi batch per generare il file dei risultati. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante campione e fare clic su genera file FSC. In questo protocollo, il trattamento degli eriociti con una soluzione di ionomicina micromolare e suoneria per due ore è stato sufficiente a indurre l'erioptosi, come evidenziato da un'etichettatura riuscita con coniugato Annexin-V Fluor 488 e quantificazione mediante analisi FACS.Concentrazioni più elevate di ionomicina a cinque e 10 micromolari hanno provocato un leggero aumento dell'erettidosi. Tuttavia, tali concentrazioni hanno anche migliorato l'emolisi. L'incubazione di erytrociti in soluzione di ionomicina e suoneria per soli 30 minuti è stata sufficiente a indurre l'erioptosi.L'aumento del tempo di incubazione ha aumentato il livello di erettidosi per un massimo di due ore. Tuttavia, un ulteriore tempo di incubazione ha portato a una leggera diminuzione del livello di erettidosi. Il valore più elevato dell'emolisi dopo 180 minuti spiega la riduzione dell'erioptosi dopo la stessa quantità di incubazione delle cellule meno vitali esistevano dopo 180 minuti di trattamento con ionomicina.Gli eriociti con trattamento con ionomicina hanno mostrato un segnale di fluorescenza brillante al legame dell'annesso-V alla fosfatidil serina nel foglio illustrativo esterno. Al contrario, le cellule senza trattamento hanno mostrato un segnale di fluorescenza molto debole che indica un'erettidosi molto bassa. La pre-incubazione in un tampone privo di glucosio è un fattore scatenante importante per l'induzione dell'erettidosi.Poiché l'erioptosi è osservata in una vasta gamma di malattie, gli esperimenti che seguono questo protocollo sono specifici sul campo. Nel nostro laboratorio, siamo interessati ad esaminare gli effetti dell'erioptosi sulle proprietà biofisiche della membrana e sulle interazioni di membrana con i nanomateriali. L'erioptosi è associata a un gran numero di malattie tra cui diabete, anemia falciforme e talassemia.Avere un protocollo riproducibile per indurre l'erioptosi può aiutare i ricercatori in uno di questi campi a indagare ulteriori questioni scientifiche specifiche per ogni campo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analisi di afflusso del calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Ricerca

Biochimica

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo per studiare la dinamica di associazione del fosfolipide proteina Annessina A2 a lipidici solido-supportato utilizzando un risonatore al quarzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Muscoli della parete del corpo

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Traduzione della purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per l'isolamento dell'RNA dalle cellule endoteliali In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Entità DI legame SUMO (SUBE) come strumenti per l'arricchimento, l'isolamento, l'identificazione e la caratterizzazione del proteoma SUMO nel cancro al fegato

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Western Blot ad altissima velocità che utilizza la tecnologia di miglioramento dell'immunoreazione

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Rapida determinazione dell'affinità anticorpo-antigene mediante fotometria di massa

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Un saggio di fluorescenza del calcio "a doppia aggiunta" per lo screening ad alta produttività dei recettori accoppiati a proteine G ricombinanti

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins

Rilevazione basata sull'immunocolorazione di alterazioni dinamiche nelle proteine dei globuli rossi

Antibody labeling of red blood cell (RBC) proteins is a commonly used, semi-quantitative method to detect changes in overall protein content or acute ...

Smartphone come dispositivo analitico per quantificare le proteine utilizzando il saggio di Bradford

RGBradford: Protein Quantitation with a Smartphone Camera

Autore in primo piano: Un approccio alternativo alla quantificazione delle proteine mediante il saggio Bradford utilizzando uno smartphone 

RGBradford: quantificazione delle proteine con la fotocamera di uno smartphone

Protein quantitation is an essential procedure in life sciences research. Amongst several other methods, the Bradford assay is one of the most used. ...