Name: induction of eryptosis in red blood cells using a calcium ionophore
Uploaded: 2020-01-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore at JoVE.com

이 작품은 NIH 교부금 R15ES030140 및 NSF 교부금 CBET1903568에 의해 지원되었다. 러스 공과대학과 오하이오 대학교 화학 및 생물분자 공학부의 재정 지원도 인정받고 있습니다.

아래에 기술된 프로토콜에 사용된 모든 인간 혈액 샘플은 비식별 샘플로서 구입하였다. 어떤 인간 과목이 직접 참여 하거나이 연구에 대 한 모집 했다. 헬싱키 선언의 지침은 연구가 인간의 과목을 포함 할 때 사용되어야한다.
1. 전혈로부터적혈구 분리
<ol><li>500 μL의 전혈을 산구연산 덱스트로스(ACD)(4°C에서 보관)에 미세원심지 튜브에 넣습니다. 참고: 전혈은 ACD에서 구입...

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	<li>Bratosin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Cell+Death+in+Mature+Erythrocytes:+A+Model+for+Investigating+Death+Effector+Pathways+Operating+in+the+Absence+of+Mitochondria.">Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 8 (12), 1143-1156 (2001).</li><li>Lang, E., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Pathophysiological+Significance+of+Eryptosis,+the+Suicidal+Erythrocyte+Death.">Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).</li><li>Garnier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+Deformability+in+Diabetes+and+Erythrocyte+Membrane+Lipid+Composition.">Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition.</a> Metabolism. 39 (8), 794-798 (1990).</li><li>Verkleij, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Asymmetric+Distribution+of+Phospholipids+in+the+Human+Red+Cell+Membrane.+A+Combined+Study+Using+Phospholipases+and+Freeze-Etch+Electron+Microscopy.">The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323 (2), 178-193 (1973).</li><li>de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Macrophages+and+Red+Blood+Cells;+A+Complex+Love+Story.">Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story.</a> Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).</li><li>Fadok, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Receptor+for+Phosphatidylserine-Specific+Clearance+of+Apoptotic+Cells.">A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells.</a> Nature. 405 (6782), 85-90 (2000).</li><li>Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phosphatidylserine+Receptor:+A+Crucial+Molecular+Switch.">The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (8), 627-633 (2001).</li><li>Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Insights+into+the+Mechanism+for+Clearance+of+Apoptotic+Cells.">New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells.</a> BioEssays. 22 (10), 878-881 (2000).</li><li>Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis+in+Hereditary+Spherocytosis+and+Thalassemia:+Role+of+Glycoconjugates.">Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates.</a> Glycoconjugate Journal. 27 (9), 717-722 (2010).</li><li>Kuypers, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Altered+Membrane+Phospholipid+Asymmetry+in+Subpopulations+of+Human+Red+Blood+Cells+Using+Fluorescently+Labeled+Annexin+V.">Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V.</a> Blood. 87 (3), 1179-1197 (1996).</li><li>Lang, F., Lang, E., Fller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+Pathophysiology+of+Eryptosis.">Physiology and Pathophysiology of Eryptosis.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 308-314 (2012).</li><li>Wr&#243;bel, A., Bobrowska-H&#228;gerstrand, M., Lindqvist, C., H&#228;gerstrand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Membrane+Phospholipid+Scrambling+in+Human+Erythrocytes+and+K562+Cells+with+FM1-43+-+a+Comparison+with+Annexin+V-FITC.">Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 - a Comparison with Annexin V-FITC.</a> Cellular and Molecular Biology Letters. 19 (2), 262-276 (2014).</li><li>Mohandas, N., Gallagher, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+Cell+Membrane:+Past,+Present,+and+Future.">Red Cell Membrane: Past, Present, and Future.</a> Blood. 112 (10), 3939-3948 (2008).</li><li>Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminophospholipid+Translocase+and+Phospholipid+Scramblase+Activities+in+Sickle+Erythrocyte+Subpopulations.">Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations.</a> British Journal of Haematology. 146 (4), 447-455 (2009).</li><li>Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Review+on+Eryptosis.">A Comprehensive Review on Eryptosis.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 39 (5), 1977-2000 (2016).</li><li>Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-Dependent+Phospholipid+Scrambling+by+TMEM16F.">Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F.</a> Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).</li><li>Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Suicidal+Erythrocyte+Death+by+Volasertib.">Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (4), 1472-1486 (2017).</li><li>Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Phospholipid+Organization+in+Calcium-Loaded+Human+Erythrocytes.">Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 902 (2), 253-262 (1987).</li><li>Alzoubi, K., Calabr&#242;, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+of+Programmed+Erythrocyte+Death+by+Alantolactone.">Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone.</a> Toxins (Basel). 6 (12), 3596-3612 (2014).</li><li>Jacobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+Erythrocyte+Cell+Membrane+Scrambling+by+Mitotane.">Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 4 (33), 1516-1526 (2014).</li><li>Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractoriness+of+Eryptotic+Red+Blood+Cells+to+Plasmodium+Falciparum+Infection:+A+Putative+Host+Defense+Mechanism+Limiting+Parasitaemia.">Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia.</a> PLoS One. 6 (10), e26575 (2011).</li><li>Borst, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Adhesion+of+Eryptotic+Erythrocytes+to+Endothelial+Cells+via+CXCL16/SR-PSOX.">Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (4), C644-C651 (2011).</li><li>Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Phosphatidylserine-Specific+Peptide-Conjugated+Liposomes+Using+a+Model+System+of+Malaria-Infected+Erythrocytes.">Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38 (10), 1649-1651 (2015).</li><li>Mahmud, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suicidal+Erythrocyte+Death,+Eryptosis,+as+a+Novel+Mechanism+in+Heart+Failure-Associated+Anaemia.">Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia.</a> Cardiovascular Research. 98 (1), 37-46 (2013).</li><li>Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+Eryptosis,+the+Suicidal+Erythrocyte+Death+by+Piceatannol.">Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (6), 2300-2310 (2016).</li><li>Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrambling+of+Phospholipids+Activates+Red+Cell+Membrane+Cholesterol.">Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol.</a> Biochemistry. 46 (8), 2233-2238 (2007).</li><li>Lang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis,+a+Window+to+Systemic+Disease.">Eryptosis, a Window to Systemic Disease.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 22 (6), 373-380 (2008).</li><li>Gil-Parrado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionomycin-Activated+Calpain+Triggers+Apoptosis.+A+Probable+Role+for+Bcl-2+Family+Members.">Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27217-27226 (2002).</li><li>Liu, C. M., Hermann, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ionomycin+as+a+Calcium+Ionophore.">Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore.</a> Journal of Biological Chemistry. 253 (17), 5892-5894 (1978).</li><li>Klarl, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Mediates+Erythrocyte+"Programmed+Cell+Death"+Following+Glucose+Depletion.">Protein Kinase C Mediates Erythrocyte "Programmed Cell Death" Following Glucose Depletion.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), C244-C253 (2006).</li><li>Danilov, Y. N., Cohen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Germ+Agglutinin+but+Not+Concanavalin+A+Modulates+Protein+Kinase+C-Mediated+Phosphorylation+of+Red+Cell+Skeletal+Proteins.">Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins.</a> FEBS Letters. 257 (2), 431-434 (1989).</li><li>Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Outer+Leaflet+Is+the+Primary+Regulator+of+Membrane+Damage+Induced+by+Silica+Nanoparticles+in+Vesicles+and+Erythrocytes.">Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes.</a> Environmental Science Nano. 6 (4), 1219-1232 (2019).</li><li>Jaroszeski, M. J., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow Cytometry Protocols. , (2003).</li><li>Ghashghaeinia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Erythrocyte+Age+on+Eryptosis.">The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis.</a> British Journal of Haematology. 157 (5), 1365 (2012).</li><li>Repsold, L., Joubert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis:+An+Erythrocyte's+Suicidal+Type+of+Cell+Death.">Eryptosis: An Erythrocyte's Suicidal Type of Cell Death.</a> Biomed Research International. 2018 (5), 9405617 (2018).</li><li>Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+Binding+Properties+of+Human+Placental+Anticoagulant+Protein-I,+a+Member+of+the+Lipocortin+Family.">Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 7944-7949 (1989).</li><li>Andree, H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Vascular+Anticoagulant+&#945;+(VAC&#945;)+to+Planar+Phospholipid+Bilayers.">Binding of Vascular Anticoagulant &#945; (VAC&#945;) to Planar Phospholipid Bilayers.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (9), 4923-4928 (1990).</li><li>Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+Affinity+and+Cooperativity+of+Annexin+V-Membrane+Binding+under+Conditions+of+Low+Membrane+Occupancy.">Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy.</a> Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).</li><li>Jiang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis+as+an+Underlying+Mechanism+in+Systemic+Lupus+Erythematosus-Related+Anemia.">Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).</li><li>Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+and+Platelet+Proteomics+in+Hematological+Disorders.">Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).</li></ol>

이 절차의 목표는 이오노포어 농도, 치료 시간 및 적색증의 성공적인 유도를 보장하는 데 중요한 요소인 세포외 포도당 농도에 대한 최적의 값을 제공하는 것입니다. 프로토콜의 중요한 단계는 그 중요성에도 불구하고 문헌에서 충분히 강조되지 않은 세포 외 포도당의 고갈입니다. 정상 링거 용액 (5 mM)의 당도는 에리펙트증에 억제 효과가 있습니다. 세포 외 환경에서 포도당 고갈은 세포 스트레?...

적혈구에서 프로그래밍 된 세포 죽음, 또한 적혈구로 알려진, 많은 임상 조건 및 혈액 학적 장애에서 일반적이다. 에반색은 세포혈장막1,2에서세포 수축 및 인지질 비대칭의 손실과 관련이 있다. 비대칭의 손실은 내부 전단지3,4에국한된 지질인 포스파티딜세린(PS)의 전좌를 초래하며, 이는 세포 외부 리플렛에, 이는 식세포에 대식세포를 신호하고 결함이 있는 적혈구5,6,7,8을제거한다. 적혈구의 정상적인 수명이 끝나면 대식세포에 의한 적혈구 세포를 제거하면 순환에 적혈구의 균형이 보장됩니다. 그러나, 겸상적혈구 및 탈라세미증9,10,11,강화된 적혈구와 같은 병든조건에서는심한 빈혈을 초래할 수 있다 2. 혈액학적 인 질병에 그것의 중요성 때문에, 이 프로세스의 밑에 있는 적혈구및 분자 기계장치를 유도하거나 억제하는 요인을 검토에 있는 중요한 관심사가 있습니다.
건강한 적혈구의 혈장 막은 비대칭이며, 다른 인지질이 외부 및 내부 전단지에 국한됩니다. 막 비대칭은 주로 막 효소의 작용에 의해 조절됩니다. 아미노포스포이시드 트랜스로케이스는 이러한 지질을 세포 내부 리플렛으로 유도하여 아미노포스포이시드, PS 및 포스파티딜레탄아민(PE)의 수송을 용이하게 한다. 한편, 플롭파제는 인지질, 포스파티딜콜린(PC) 및 스핑고미엘린(SM)을 함유하는 콜린을세포막(12)의외부 리플렛으로 내부에서 수송한다. 그러나 건강한 세포와 달리 적혈구의 막이 스크램블됩니다. 이것은 아미노포스포이시드13,14,15,16의양방향 수송을 촉진하여 인지질 비대칭을 방해하는 제 3 효소 인 스크램블라제의 작용에 기인한다. 스크램블라제는 Ca2+이상의 높은 세포내 수준에 의해 활성화됩니다. 따라서세포막(12)을가로질러Ca2+의 수송을 용이하게 하는 칼슘 이온포르는 적색증의 효율적인 유도제이다.
요오노마이신, 칼슘 이오노포어는 적혈구12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26에서적혈구를 유도하는 데 널리 사용되어 왔다. 이오노마이신은Ca2+ 이온을 결합하고 포획하는 데 필요한 친수성 및 소수성 그룹을 모두 가지고 있으며, 이를 세포순환 공간27,28,29로수송한다. 이는 PS12에대한 높은 친화성을 가진 세포 단백질인 annexin-V를 사용하여 쉽게 검출될 수 있는 외부 리플렛으로의 스크램블라제 및 전좌의 활성화를 유도한다. 이오노마이신에 의한 에릭토증을 유발하는 것은 일반적으로 보고되지만, 문헌에 상당한 방법 불일치가있다(표 1). 적혈구의 인구는 이오노포어 농도, 이오노포어를 통한 치료 시간 및 세포외 환경의 당도(포도당 고갈이 양이온 채널을 활성화하고 Cytosolic 공간으로Ca2+의 진입을 용이하게 함)30,31과같은 다른 요인에 의존한다. 그러나, 문헌에서 이러한 요인에 약간의 일관성이 있어 시험관 내에서에리프토증을 재현하기 어렵게 만듭니다.
이 프로토콜에서는, 우리는 인간 적혈구에 있는 홍색토증을 유도하는 단계별 절차를 제시합니다. Ca2+ 농도, 이오노포어 농도, 치료 시간 및 포도당 고갈 된 완충제의 사전 배양을 포함하여 성공적인 에적혈관증에 영향을 미치는 요인을 검사하고 최적의 값이보고됩니다. 이 절차는 포도당 없는 완충액에 있는 적혈구의 사전 배양이 포도당 함유 완충액에 비해 적색지대의 백분율을 현저하게 증가시킨다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 다양한 응용 프로그램에 대한 적혈구 적혈구를 생산하기 위해 실험실에서 사용할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A10788</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>643177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M7157</td>
			<td>Model Eppendorf 5415C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Zeiss, LSM Tek Thornwood</td>
			<td></td>
			<td>Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses circles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable round bottom flow cytometry tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRU47729-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer (1 M)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7290</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>EMD Milipore Corp.</td>
			<td>407952-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain glass microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HFM microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole blood in ACD</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4 &#176;C and warm to 37 &#176;C prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of eryptosis in red blood cells using a calcium ionophore

적혈구, 적혈구 프로그램 세포 사멸, 혈액 학적 질환의 숫자와 적혈구 부상 동안 발생합니다. 홍반 세포의 특징은 세포막의 조성 비대칭의 손실이며, 막 외부 전단지로 포스 파티딜세린의 전좌로 이어진다. 이 과정은Ca2+의세포 내 농도 증가에 의해 유발되며, 이는 멤브레인 리플렛 사이의 인지질의 양방향 이동을 용이하게하는 효소인 스크램블라제를 활성화시킵니다. 다양한 질병 조건에서 에적혈구증의 중요성을 감안할 때, 시험관내에서에리프토시스를 유도하기 위한 노력이 있었다. 이러한 노력은 일반적으로 칼슘 이오노포어, 요오마이신에 의존하여 세포내 Ca2+ 농도를 향상시키고 에리프토증을 유발합니다. 그러나, 많은 불일치는 요오마이신을 사용하여 에적ptosis를 유도하기위한 절차에 관한 문헌에서보고되었다. 본 명세서에서, 우리는 인간 적혈구에서 이오노마이신 유도 적혈구에 대한 단계별 프로토콜을 보고한다. 우리는 이오노포어 농도, 배양 시간 및 포도당 고갈을 포함하여 절차의 중요한 단계에 집중하고, 대표적인 결과를 제공합니다. 이 프로토콜은 실험실에서 재생성 적으로 홍채증을 유도하는 데 사용할 수 있습니다.

이오노마이신 농도 최적화
이오노마이신은 홍색증을 유도하는 데 필요한 반면, 증가 된 요오마이신 농도는 혈우만에 발생할 수 있습니다 (즉, 적혈구의 포해와 헤모글로빈의 방출), 이는 피해야 할 필요가있다. 링거 용액에서 1 μM 요오마이신을 2 시간 동안 적혈구로 처리하면 아넥신-V 알렉사 가루 488 컨쥬게이트?...

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Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

적혈구에서 적혈구의 세포 사멸, 칼슘 이오노포어, 요오마이신을 사용하여 적혈구의 유도를위한 프로토콜이 제공됩니다. 성공적인 에적엽증은 막 외부 전단지에서 국소화 포스파티딜세린을 모니터링하여 평가됩니다. 프로토콜의 성공에 영향을 미치는 요인을 검토하고 최적의 조건을 제공했습니다.

칼슘 이오노포어를 사용하여 적혈구에 있는 에리녹증의 유도

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...

이오노마이신을 사용하여 홍도를 유도하기 위한 많은 노력이 있었습니다. 그러나 이 과정에 대한 정확한 절차는 문헌에 명확하게 설명되어 있지 않습니다. 우리는 이오노마이신을 사용하여 홍안염을 유도하는 단계별 절차를 제공합니다.이 절차의 주요 장점은 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방식으로 인간의 적혈구에 있는 적혈구를 유도하는 것입니다. 시작하려면 산성 구연산 덱스트로오스에 500 마이크로리터의 감기 전혈을 미세 원심분리기 튜브에 추가하십시오. 실온에서 5분 동안 700배 g의 전체 혈액을 원심분리하고 파이펫을 사용하여 맑은 플라즈마와 얇은 버피 코트를 제거하여 적혈구층을 남깁니다.염화 나트륨 125밀리머 나트륨, 염화칼륨 5개, 밀리머 마그네슘 황산염 1개, 밀리머 헤페스 32개, 밀리모어 포도당 5개, 염화칼슘 1개를 함유한 링거 용액 1리터를 준비합니다. 1개의 어금니 나트륨 수산화물의 2개의 마이크로리터 방울을 추가하여 pH를 7.4로 조정합니다. 포도당 없는 링거 용액을 준비하려면 동일한 프로토콜을 따르지만 용액에는 포도당을 포함하지 마십시오.링거 용액의 1.5 밀리리터에서 세포 펠릿을 중단하고 실온에서 5 분 동안 700 배 g에서 원심 분리하고 상퍼를 제거하여 링거 용액에서 적혈구를 두 번 세척하십시오. 그런 다음 9, 960 마이크로리터의 적혈구 펠릿 40 마이크로리터를 재중단하여 10 밀리리터의 최종 부피에 도달함으로써 0.4%의 헤마토크릿을 만듭니다. 7일 동안 세포 현탁액을 섭씨 37도에서 배양합니다.포도당 없는 완충제에서 적혈구의 사전 잠복은 적혈구를 크게 유발합니다. 높은 홍변은 무설탕 완충제에서 7일간의 사전 배양 후 수득하였다. DMSO의 630 마이크로리터에 1밀리그램의 이오노마이신 칼슘 소금을 녹여 2밀리알러의 최종 농도에 도달하십시오.알리쿼트 20 밀리리터에 보관하고 영하 20도에 보관하십시오. 준비된 0.4%의 헤마토크릿 1밀리리터를 복용하고 2개의 밀리머 이오노마이신의 0.5 마이크로리터를 추가하여 1개의 마이크로몰라의 최종 농도에 도달하십시오. 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양하세요.이오노마이신 처리없이 헤마토크릿의 1 밀리리터를 부정적인 대조군으로 사용하십시오. 원심 분리는 실온에서 5 분 동안 700 배 g에서 치료및 처리되지 않은 혈종으로 처리되고 처리되지 않은 혈종을 원심분리하고 체퍼나티를 제거하여 세포 펠릿을 튜브 바닥에 둡니다. 링거 용액의 1.5 밀리리터에서 세포 펠릿을 일시 중단하고 실온에서 5 분 동안 700 배 g에서 원심 분리하고 슈퍼 네이티퍼를 폐기하여 링거 용액으로 세포를 세 번 세척하십시오.혈연을 측정하기 위해, 처리되지 않은 0.4% 혈종투에 1밀리리터를 마이크로센트심리후각관에 넣고 0%의 혈청을 부정적으로 조절할 수 있도록 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양한다. 100% 혈혈의 긍정적 인 제어를 준비하려면, 실온에서 5 분 동안 700 배 g에서 미세 원심 분리기 튜브및 원심 분리기에 처리되지 않은 0.4 %의 혈종 1 밀리리터를 추가하십시오. 상체를 제거하고 세포 펠릿에 증류수 1밀리리터를 추가하여 섭씨 37도에서 2시간 동안 재일시 중단하고 배양합니다.다음으로, 마이크로센트심분리기 튜브에 0.4%헤마토크릿 처리된 이오노마이신의 밀리리터 1개를 추가한다. 처리되지 않은 세포, 처리된 세포 및 증류수의 세포를 실온에서 5분 동안 700배 g에서 원심분리합니다. 슈퍼네티츠의 마이크로리터 200개를 96웰 플레이트의 각 웰에 옮기.마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 541 나노미터에서 흡광도를 측정합니다. A0, A100 및 AT가 링거 용액의 적혈구의 흡수력과 요오노마이신에 의한 처리된 에르티로시테스의 흡수도인 방정식을 사용하여 용혈을 계산합니다. PBS의 8밀리리터에 5X 부속서-V 바인딩 버퍼의 2밀리리터를 희석하여 1X 바인딩 버퍼를 얻습니다.1X 결합 버퍼의 1 밀리리터에서 이오노마이신 처리 및 처리되지 않은 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 결합 버퍼에서 세포 현탁액의 235 마이크로 리터를 가져 와서 마이크로 센트심분리기 튜브에 부속서-V 알렉사 플루오 488 컨쥬게이트 15 마이크로리터를 추가하십시오. 어두운 곳에서 20 분 동안 실온에서 세포를 배양하십시오.원심분리기는 실온에서 5분 동안 700배 g로 원심분리기. 상부체를 제거합니다. 1X 결합 버퍼로 셀 펠릿을 1.5 밀리리터로 일시 중단하고 실온에서 5분 동안 700배 g에서 원심분리를 하여 세포를 두 번 세척한다.유동 세포측정을 위한 1X 결합 버퍼의 250마이크로리터에서 상체를 제거하고 세포 펠릿을 재축한다. 이제 200개의 마이크로리터를 부속-V 스테인드 에리스로사이클을 유동 세포측정과 호환되는 1밀리리터 라운드 바닥 폴리스티렌 튜브로 이송합니다. 흐름 세포 측정 소프트웨어에 로그인하고 새 실험 버튼을 클릭합니다.새 튜브 버튼을 클릭합니다. 글로벌 시트를 선택하고 488 나노미터의 발산 파장과 530 나노미터의 방출 파장으로 형광 강도를 측정하기 위해 적용 분석을 선택합니다. 형광 활성화 된 세포 선별 분석을 위해 수집될 세포 수를 20, 000으로 설정합니다.원하는 튜브를 선택하고 로드 버튼을 클릭합니다. 앞으로 산란 및 측면 산란 측정을 위해 레코드 버튼을 클릭합니다. 모든 샘플에 대해 반복합니다.표본 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 배치 분석을 적용하여 결과 파일을 생성합니다. 표본 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 FSC 파일 생성을 클릭합니다. 이 프로토콜에서, 2시간 동안 1개의 마이크로몰라 이오노마이신 및 링거 용액을 가진 적혈구의 처리는 FACS 분석에 의하여 부속신-V 플루서 488 의 성공적으로 라벨링에 의해 입증된 바와 같이 적혈구를 유도하기에 충분했습니다.5 및 10 마이크로 몰라에서 이오노마이신의 높은 농도는 홍도증의 약간의 증가를 초래했다. 그러나, 이러한 농도 또한 혈혈증을 향상. 이오노마이신및 링거 용액에서 적혈구를 30분 간 배양하는 것만으로도 홍안증을 유발하기에 충분했다.인큐베이션 시간이 증가하여 최대 2시간 동안 홍도 수준을 증가시다. 그러나, 추가 잠복기 시간은 홍하의 수준에 있는 약간 감소귀착되었습니다. 180분 후에 혈혈의 더 높은 값은 이오노마이신으로 처리의 180분에 존재하는 보다 적게 실행 가능한 세포로 인큐베이션의 동일한 양 후에 적층의 감소를 설명합니다.이오노마이신 치료를 가진 적혈구는 외부 전단지에서 인스파디딜 세린에 대한 부속서-V의 결합에 밝은 형광 신호를 보였다. 대조적으로, 처리가 없는 세포는 아주 낮은 홍위를 나타내는 아주 약한 형광 신호를 보여주었습니다. 포도당 없는 완충제에서의 사전 잠복은 홍안증유도를 위한 중요한 트리거입니다.홍반은 광범위한 질병에서 관찰되기 때문에,이 프로토콜에 따른 실험은 필드 특정입니다. 우리의 실험실에서, 우리는 멤브레인 생물학적 특성 및 나노 물질과의 멤브레인 상호 작용에 대한 홍안의 효과를 검사하는 데 관심이 있습니다. 홍변은 당뇨병, 겸상적혈구 빈혈 및 탈라세미를 포함한 많은 수의 질병과 관련이 있습니다.홍안증을 유도하기위한 재현 가능한 프로토콜을 갖는 것은 각 필드에 특정 추가 과학적 질문을 조사하는 이 분야의 연구원을 도울 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 칼슘 유입의 분석

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

연구

생화학

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

C. 예쁜꼬마선충의 생체내 칼슘 이미징

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

생체 내피 세포에서 RNA 격리를 위한 리보솜 친화성 정제(TRAP) 번역

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

간암에서 스모 프로테오메의 농축, 격리, 식별 및 특성화를 위한 도구로 스모 결합 엔티티(SUBEs)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

면역 반응 강화 기술을 이용한 초고속 웨스턴 블롯

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

질량 광합성에 의한 항체 항원 선호도의 신속한 결정

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Na+에 대한 내부 미토콘드리아 막 민감도, 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀 공개

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

시험관 내에서 칼슘 침착을 정량화하기 위한 반자동화되고 재현 가능한 생물학적 기반 방법

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

재조합 G 단백질 결합 수용체의 고처리량 스크리닝을 위한 "이중 첨가" 칼슘 형광 분석

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...