Name: induction of eryptosis in red blood cells using a calcium ionophore
Uploaded: 2020-01-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH gi R15ES030140 og NSF Grant CBET1903568. Finansiell støtte fra Russ College of Engineering and Technology og Institutt for kjemisk og Biomolecular Engineering ved Ohio University er også anerkjent.

Alle humane blodprøver brukt i protokollen beskrevet nedenfor ble kjøpt som de-identifiserte prøvene. Ingen menneskelig var direkte involvert eller rekruttert for denne studien. Retningslinjene for Declaration of Helsinki skal brukes når forskning involverer mennesker.
1. erytrocytt isolering fra hele blod
<ol><li>Tilsett 500 μL av hele blod i syre citrate druesukker (ACD) (oppbevares ved 4 ° c) til et mikrosentrifugen rør. Merk: hele blod ble kjøpt i ACD. Ifølge selskapet tilset...

<ol>
	<li>Bratosin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Cell+Death+in+Mature+Erythrocytes:+A+Model+for+Investigating+Death+Effector+Pathways+Operating+in+the+Absence+of+Mitochondria.">Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 8 (12), 1143-1156 (2001).</li><li>Lang, E., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Pathophysiological+Significance+of+Eryptosis,+the+Suicidal+Erythrocyte+Death.">Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).</li><li>Garnier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+Deformability+in+Diabetes+and+Erythrocyte+Membrane+Lipid+Composition.">Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition.</a> Metabolism. 39 (8), 794-798 (1990).</li><li>Verkleij, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Asymmetric+Distribution+of+Phospholipids+in+the+Human+Red+Cell+Membrane.+A+Combined+Study+Using+Phospholipases+and+Freeze-Etch+Electron+Microscopy.">The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323 (2), 178-193 (1973).</li><li>de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Macrophages+and+Red+Blood+Cells;+A+Complex+Love+Story.">Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story.</a> Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).</li><li>Fadok, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Receptor+for+Phosphatidylserine-Specific+Clearance+of+Apoptotic+Cells.">A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells.</a> Nature. 405 (6782), 85-90 (2000).</li><li>Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phosphatidylserine+Receptor:+A+Crucial+Molecular+Switch.">The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (8), 627-633 (2001).</li><li>Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Insights+into+the+Mechanism+for+Clearance+of+Apoptotic+Cells.">New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells.</a> BioEssays. 22 (10), 878-881 (2000).</li><li>Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis+in+Hereditary+Spherocytosis+and+Thalassemia:+Role+of+Glycoconjugates.">Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates.</a> Glycoconjugate Journal. 27 (9), 717-722 (2010).</li><li>Kuypers, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Altered+Membrane+Phospholipid+Asymmetry+in+Subpopulations+of+Human+Red+Blood+Cells+Using+Fluorescently+Labeled+Annexin+V.">Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V.</a> Blood. 87 (3), 1179-1197 (1996).</li><li>Lang, F., Lang, E., Fller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+Pathophysiology+of+Eryptosis.">Physiology and Pathophysiology of Eryptosis.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 308-314 (2012).</li><li>Wr&#243;bel, A., Bobrowska-H&#228;gerstrand, M., Lindqvist, C., H&#228;gerstrand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Membrane+Phospholipid+Scrambling+in+Human+Erythrocytes+and+K562+Cells+with+FM1-43+-+a+Comparison+with+Annexin+V-FITC.">Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 - a Comparison with Annexin V-FITC.</a> Cellular and Molecular Biology Letters. 19 (2), 262-276 (2014).</li><li>Mohandas, N., Gallagher, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+Cell+Membrane:+Past,+Present,+and+Future.">Red Cell Membrane: Past, Present, and Future.</a> Blood. 112 (10), 3939-3948 (2008).</li><li>Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminophospholipid+Translocase+and+Phospholipid+Scramblase+Activities+in+Sickle+Erythrocyte+Subpopulations.">Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations.</a> British Journal of Haematology. 146 (4), 447-455 (2009).</li><li>Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Review+on+Eryptosis.">A Comprehensive Review on Eryptosis.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 39 (5), 1977-2000 (2016).</li><li>Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-Dependent+Phospholipid+Scrambling+by+TMEM16F.">Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F.</a> Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).</li><li>Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Suicidal+Erythrocyte+Death+by+Volasertib.">Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (4), 1472-1486 (2017).</li><li>Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Phospholipid+Organization+in+Calcium-Loaded+Human+Erythrocytes.">Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 902 (2), 253-262 (1987).</li><li>Alzoubi, K., Calabr&#242;, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+of+Programmed+Erythrocyte+Death+by+Alantolactone.">Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone.</a> Toxins (Basel). 6 (12), 3596-3612 (2014).</li><li>Jacobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+Erythrocyte+Cell+Membrane+Scrambling+by+Mitotane.">Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 4 (33), 1516-1526 (2014).</li><li>Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractoriness+of+Eryptotic+Red+Blood+Cells+to+Plasmodium+Falciparum+Infection:+A+Putative+Host+Defense+Mechanism+Limiting+Parasitaemia.">Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia.</a> PLoS One. 6 (10), e26575 (2011).</li><li>Borst, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Adhesion+of+Eryptotic+Erythrocytes+to+Endothelial+Cells+via+CXCL16/SR-PSOX.">Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (4), C644-C651 (2011).</li><li>Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Phosphatidylserine-Specific+Peptide-Conjugated+Liposomes+Using+a+Model+System+of+Malaria-Infected+Erythrocytes.">Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38 (10), 1649-1651 (2015).</li><li>Mahmud, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suicidal+Erythrocyte+Death,+Eryptosis,+as+a+Novel+Mechanism+in+Heart+Failure-Associated+Anaemia.">Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia.</a> Cardiovascular Research. 98 (1), 37-46 (2013).</li><li>Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+Eryptosis,+the+Suicidal+Erythrocyte+Death+by+Piceatannol.">Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (6), 2300-2310 (2016).</li><li>Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrambling+of+Phospholipids+Activates+Red+Cell+Membrane+Cholesterol.">Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol.</a> Biochemistry. 46 (8), 2233-2238 (2007).</li><li>Lang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis,+a+Window+to+Systemic+Disease.">Eryptosis, a Window to Systemic Disease.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 22 (6), 373-380 (2008).</li><li>Gil-Parrado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionomycin-Activated+Calpain+Triggers+Apoptosis.+A+Probable+Role+for+Bcl-2+Family+Members.">Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27217-27226 (2002).</li><li>Liu, C. M., Hermann, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ionomycin+as+a+Calcium+Ionophore.">Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore.</a> Journal of Biological Chemistry. 253 (17), 5892-5894 (1978).</li><li>Klarl, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Mediates+Erythrocyte+"Programmed+Cell+Death"+Following+Glucose+Depletion.">Protein Kinase C Mediates Erythrocyte "Programmed Cell Death" Following Glucose Depletion.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), C244-C253 (2006).</li><li>Danilov, Y. N., Cohen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Germ+Agglutinin+but+Not+Concanavalin+A+Modulates+Protein+Kinase+C-Mediated+Phosphorylation+of+Red+Cell+Skeletal+Proteins.">Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins.</a> FEBS Letters. 257 (2), 431-434 (1989).</li><li>Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Outer+Leaflet+Is+the+Primary+Regulator+of+Membrane+Damage+Induced+by+Silica+Nanoparticles+in+Vesicles+and+Erythrocytes.">Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes.</a> Environmental Science Nano. 6 (4), 1219-1232 (2019).</li><li>Jaroszeski, M. J., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow Cytometry Protocols. , (2003).</li><li>Ghashghaeinia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Erythrocyte+Age+on+Eryptosis.">The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis.</a> British Journal of Haematology. 157 (5), 1365 (2012).</li><li>Repsold, L., Joubert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis:+An+Erythrocyte's+Suicidal+Type+of+Cell+Death.">Eryptosis: An Erythrocyte's Suicidal Type of Cell Death.</a> Biomed Research International. 2018 (5), 9405617 (2018).</li><li>Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+Binding+Properties+of+Human+Placental+Anticoagulant+Protein-I,+a+Member+of+the+Lipocortin+Family.">Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 7944-7949 (1989).</li><li>Andree, H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Vascular+Anticoagulant+&#945;+(VAC&#945;)+to+Planar+Phospholipid+Bilayers.">Binding of Vascular Anticoagulant &#945; (VAC&#945;) to Planar Phospholipid Bilayers.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (9), 4923-4928 (1990).</li><li>Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+Affinity+and+Cooperativity+of+Annexin+V-Membrane+Binding+under+Conditions+of+Low+Membrane+Occupancy.">Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy.</a> Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).</li><li>Jiang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis+as+an+Underlying+Mechanism+in+Systemic+Lupus+Erythematosus-Related+Anemia.">Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).</li><li>Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+and+Platelet+Proteomics+in+Hematological+Disorders.">Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).</li></ol>

Målet med denne prosedyren er å gi optimale verdier for ionophore konsentrasjon, behandlingstid, og ekstracellulære glukose konsentrasjon, som er viktige faktorer for å sikre vellykket induksjon av eryptosis. Et kritisk trinn i protokollen er tømming av ekstracellulære glukose, som, til tross for dens betydning, ikke har blitt tilstrekkelig vektlagt i litteraturen. Sukkerinnholdet i normal ringe løsning (5 mM) har en hemmende effekt på eryptosis. Glukose reduksjon i ekstracellulære miljøet induserer cellulær s...

Programmert celle død i erytrocytter, også kjent som eryptosis, er vanlig i mange kliniske tilstander og hematologiske lidelser. Eryptosis er assosiert med celle krymping og tap av fosfolipid asymmetri i cellen plasma membran1,2. Tap av asymmetri resulterer i translokasjon av fosfatidylserin (PS), et lipid normalt lokalisert i det indre pakningsvedlegget3,4, til cellenes ytre pakningsvedlegget, som signaliserer til makrofager for å fagocyttere og fjerne defekte erytrocytter5,6,7,8. På slutten av den normale levetiden av erytrocytter, sikrer fjerning av eryptotic celler av makrofager balansen av erytrocytter i omløp. Men i syke forhold, slik som sigdcellesykdom og talassemi9,10,11, kan forsterket eryptosis føre til alvorlig anemi2. På grunn av sin betydning i hematologiske sykdommer, det er betydelig interesse for å undersøke faktorene inducing eller hemme eryptosis og molekylære mekanismer underliggende denne prosessen.
Plasma membranen av friske erytrocytter er asymmetrisk, med ulike fosfolipider lokalisere på ytre og indre brosjyrer. Membran asymmetri er primært regulert av virkningen av membran enzymer. Aminophospholipid translocase forenkler transport av aminophospholipids, PS og phosphatidylethanolamine (PE), ved å dirigere disse lipider til celle indre pakningsvedlegget. På den annen side, floppase transporterer kolin som inneholder fosfolipider, phosphatidylcholine (PC) og sphingomyelin (SM), fra den indre til den ytre pakningsvedlegget av cellemembranen12. Men i motsetning til friske celler, er membranen av eryptotic erytrocytter forvrengt. Dette skyldes virkningen av et tredje enzym, scramblase, som forstyrrer fosfolipid asymmetri ved å tilrettelegge toveis transport av aminophospholipids13,14,15,16. Scramblase aktiveres ved forhøyede intracellulære nivåer av ca2 +. Derfor er kalsium ionophores, som letter transporten av ca2 + på tvers av cellemembranen12, effektive induktorer av eryptosis.
Ionomycin, en kalsium ionophore, har blitt mye brukt til å indusere eryptosis i erytrocytter12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Ionomycin har både hydrofile og hydrofobe grupper, som er nødvendige for å binde og fange ca2 + ION, og transportere den til cytosolic plass27,28,29. Dette fører til aktivering av scramblase og translokasjon av PS til den ytre pakningsvedlegget, som lett kan oppdages ved hjelp av annexin-V, en mobilnettet protein med høy affinitet til PS12. Selv om utløser eryptosis av ionomycin er ofte rapportert, det er betydelig metode avvik i litteraturen (tabell 1). Bestanden av erytrocytter som gjennomgår eryptosis avhenger av ulike faktorer som ionophore konsentrasjon, behandlingstid med ionophore, og sukkerinnholdet i ekstracellulære miljø (glukose nedbryting aktiverer kanaler og Letter registreringen av ca2 + inn i cytosolic rommet)30,31. Det er imidlertid liten konsistens i disse faktorene i litteraturen, noe som gjør det vanskelig å utføre eryptosis reproduserbar in vitro.
I denne protokollen, presenterer vi en trinnvis fremgangsmåte for å indusere eryptosis i menneskelige erytrocytter. Faktorer som påvirker vellykkede eryptosis inkludert ca2 + konsentrasjon, ionophore konsentrasjon, behandlingstid, og pre-inkubasjons i glukose-utarmet buffer er undersøkt og optimale verdier rapporteres. Denne fremgangsmåten viser at pre-inkubasjons av erytrocytter i en glukose fri buffer øker betydelig prosentandelen av eryptosis sammenlignet med glukose inneholdende buffer. Denne protokollen kan brukes i laboratoriet for å produsere eryptotic erytrocytter for ulike bruksområder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A10788</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>643177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M7157</td>
			<td>Model Eppendorf 5415C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Zeiss, LSM Tek Thornwood</td>
			<td></td>
			<td>Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses circles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable round bottom flow cytometry tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRU47729-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer (1 M)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7290</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>EMD Milipore Corp.</td>
			<td>407952-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain glass microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HFM microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole blood in ACD</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4 &#176;C and warm to 37 &#176;C prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of eryptosis in red blood cells using a calcium ionophore

Eryptosis, erytrocytt programmert celle død, forekommer i en rekke hematologiske sykdommer og under skade på erytrocytter. Et kjennetegn på eryptotic celler er tap av kant asymmetri i cellemembranen, noe som fører til translokasjon av fosfatidylserin til membranen ytre pakningsvedlegget. Denne prosessen utløses av økt intracellulære konsentrasjon av ca2 +, som aktiverer scramblase, et enzym som letter toveis bevegelse av fosfolipider mellom membran brosjyrer. Gitt viktigheten av eryptosis i ulike syke forhold, har det vært forsøk på å indusere eryptosis in vitro. Slike anstrengelser har generelt vært avhengig av kalsium ionophore, ionomycin, for å forbedre intracellulære ca2 + konsentrasjon og indusere eryptosis. Det er imidlertid rapportert om mange uoverensstemmelser i litteraturen om fremgangsmåten for å indusere eryptosis ved hjelp av ionomycin. Heri rapporterer vi en trinnvis protokoll for ionomycin-indusert eryptosis i menneskelige erytrocytter. Vi fokuserer på viktige trinn i prosedyren inkludert ionophore konsentrasjon, inkubasjonstid, og glukose tømming, og gi representative resultat. Denne protokollen kan brukes til å reproduserbar indusere eryptosis i laboratoriet.

Optimalisering av ionomycin konsentrasjon
Mens ionomycin er nødvendig for å indusere eryptosis, økte ionomycin konsentrasjoner kan føre til hemolyse (dvs. lyse av erytrocytter og frigjøring av hemoglobin), som må unngås. Behandling av erytrocytter med 1 μM ionomycin i ringer løsning for 2 h er nok til å indusere eryptosis, noe som gjenspeiles av vellykket merking med annexin-V Alexa Flour 488 bøye og ...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore at JoVE.com

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

En protokoll for induksjon av eryptosis, programmert celle død i erytrocytter, ved hjelp av kalsium ionophore, ionomycin, er gitt. Vellykket eryptosis vurderes ved å overvåke lokalisering fosfatidylserin i membranen ytre pakningsvedlegget. Faktorer som påvirker suksessen til protokollen har blitt undersøkt og optimale forhold gitt.

Induksjon av Eryptosis i røde blodlegemer ved hjelp av en kalsium Ionophore

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...

Det har vært mange anstrengelser for å indusere eryptose ved hjelp av ionomycin. Den nøyaktige prosedyren for denne prosessen er imidlertid ikke tydelig skissert i litteraturen. Vi tilbyr en trinnvis prosedyre for å indusere eryptose ved hjelp av ionomycin.Den største fordelen med denne prosedyren er å indusere eryptose hos menneskelige erytrocytter på en pålitelig og reproduserbar måte. For å begynne, tilsett 500 mikroliter kaldt fullblod i syre citrate dekstrose til et mikrocentrifugerør. Sentrifuger hele blodet på 700 ganger g i fem minutter ved romtemperatur og fjern det klare plasmaet og den tynne buffy pelsen ved hjelp av en pipette for å forlate det røde erytrocyttlaget.Forbered en liter Ringeoppløsning som inneholder 125 millimolar natriumklorid, fem millimolar kaliumklorid, en millimolar magnesiumsulfat, 32 millimolar HEPES, fem millimolar glukose og en millimolar kalsiumklorid. Juster pH til 7,4 ved å legge til to mikroliter dråper av en molar natriumhydroksid. For å forberede glukosefri Ringer-løsning, følg samme protokoll, men ikke ta med glukose i løsningen.Vask erytrocytter to ganger i Ringer løsning ved å suspendere cellepellet i 1,5 milliliter Ringer løsning, sentrifuging på 700 ganger g i fem minutter ved romtemperatur og fjerne supernatant. Deretter gjør en 0,4% hematokrit ved å gjenopplive 40 mikroliter av erytrocyttpellet i 9, 960 mikroliter glukosefri Ringer-løsning for å nå et endelig volum på 10 milliliter. Inkuber cellesuspensjonen ved 37 grader Celsius i syv dager.Pre-inkubasjon av erytrocytter i en glukosefri buffer utløser eryptose betydelig. Høy eryptose ble oppnådd etter syv dager med pre-inkubasjon i den sukkerfrie bufferen. Oppløs ett mg ionomycin kalsiumsalt i 630 mikroliter DMSO for å nå en endelig konsentrasjon på to millimolar.Aliquot i 20 milliliter og lagre på minus 20 grader Celsius. Ta en milliliter av den tilberedte 0,4% hematokrit og tilsett 0,5 mikroliter med to millimolar ionomycin for å nå en endelig konsentrasjon av en mikromos. Inkuber i to timer ved 37 grader Celsius.Bruk en milliliter hematocrit uten ionomycinbehandling som en negativ kontroll. Sentrifuger ionomycin behandlet og ubehandlet hematocrits på 700 ganger g i fem minutter ved romtemperatur og fjern sine supernatanter for å forlate cellepellets på bunnen av rørene. Vask cellene tre ganger med Ringer-oppløsning ved å suspendere cellepellets i 1,5 milliliter ringerløsning, sentrifugering ved 700 ganger g i fem minutter ved romtemperatur og kast supernativa.For å måle hemolyse, legg til en milliliter av den ubehandlede 0,4% hematokrit til et mikrocentrifugerør og inkuber i to timer ved 37 grader Celsius som negativ kontroll av 0% hemolyse. For å forberede den positive kontrollen av 100% hemolyse, legg til en milliliter av den ubehandlede 0,4% hematokrit til et mikrocentrifugerør og sentrifuge ved 700 ganger g i fem minutter ved romtemperatur. Fjern supernatant og tilsett en milliliter destillert vann til cellepelleten for å gjenopplive og inkubere i to timer ved 37 grader Celsius.Deretter legger du til en milliliter av ionomycin behandlet 0,4% hematokrit til et mikrocentrifugerør. Sentrifuger de ubehandlede cellene, behandlede cellene og cellene i destillert vann ved 700 ganger g i fem minutter ved romtemperatur. Overfør 200 mikroliter av supernativa til hver brønn av en 96-brønns plate.Mål absorbansen ved 541 nanometer ved hjelp av en mikroplateleser. Beregn hemolysen ved hjelp av ligningen der A0, A100 og AT er absorbansen av erytrocytter i Ringer-løsning i vann og absorbansen av behandlede erthyrocytter ved ionomycin. Fortynn to milliliter av 5X Annexin-V bindingsbufferen i åtte milliliter PBS for å oppnå 1X bindingsbuffer.Resuspend ionomycin-behandlet og ubehandlet celle pellets i en milliliter av 1X binding buffer. Ta 235 mikroliter av cellesuspensjonene i bindingsbufferen og tilsett 15 mikroliter annexin-V Alexa Fluor 488 konjugat i et mikrocentrifugerør. Inkuber cellene ved romtemperatur i 20 minutter på et mørkt sted.Sentrifuge ved 700 ganger g i fem minutter ved romtemperatur. Fjern det overnaturlige. Vask cellene to ganger med 1X bindingsbuffer ved å suspendere cellepelleten i 1,5 milliliter av bindingsbufferen og sentrifugering ved 700 ganger g i fem minutter ved romtemperatur.Fjern de supernaturlige og resuspend cellepellets i 250 mikroliter av 1X bindingbuffer for strømningscytometrimåling. Nå overføre 200 mikroliter av Annexin-V farget erytrocytter til en milliliter rund bunn polystyren rør kompatibel med strømningscytometri. Logg på flytcytoometriprogramvaren og klikk på den nye eksperimentknappen.Klikk på den nye rørknappen. Velg det globale arket, og velg den anvende analysen for å måle fluorescensintensiteten med en eksitasjonsbølgelengde på 488 nanometer og en utslippsbølgelengde på 530 nanometer. Angi antall celler til 20 000 som skal samles inn for fluorescensaktivert cellesorteringsanalyse.Velg ønsket rør og klikk på lastknappen. Klikk på postknappen for fremover punkt- og sidepunktmåling. Gjenta for alle eksempler.Høyreklikk på prøveknappen og klikk på bruk batchanalyse for å generere resultatfilen. Høyreklikk på prøveknappen og klikk på generere FSC-filer. I denne protokollen var behandling av erytrocytter med en mikromolar ionomycin og Ringer-løsning i to timer nok til å indusere eryptose som det fremgår av vellykket merking med Annexin-V Fluor 488 konjugat og kvantifisering ved FACS-analyse.Høyere konsentrasjoner av ionomycin ved fem og 10 mikromos resulterte i en liten økning i eryptose. Imidlertid forbedret slike konsentrasjoner også hemolyse. Inkubasjon av erytrocytter i ionomycin og Ringer løsning i så lite som 30 minutter var nok til å indusere eryptose.Økt inkubasjonstid økte nivået av eryptose i opptil to timer. Imidlertid resulterte ytterligere inkubasjonstid i en liten reduksjon i nivået av eryptose. Den høyere verdien av hemolyse etter 180 minutter forklarer reduksjonen i eryptose etter samme mengde inkubasjon som mindre levedyktige celler eksisterte ved 180 minutters behandling med ionomycin.Erytrocytter med ionomycinbehandling viste et sterkt fluorescenssignal til bindingen av Annexin-V til fosfalaterin i det ytre pakningsvedlegget. I motsetning viste celler uten behandling et svært svakt fluorescenssignal som indikerer svært lav eryptose. Pre-inkubasjon i en glukosefri buffer er en viktig utløser for induksjon av eryptose.Siden eryptose observeres i et bredt spekter av sykdommer, er forsøkene som følger denne protokollen feltspesifikke. I laboratoriet vårt er vi interessert i å undersøke effekten av eryptose på membranbiofysiske egenskaper og membraninteraksjoner med nanomaterialer. Eryptose er forbundet med et stort antall sykdommer, inkludert diabetes, sigdcelleanemi og talassemi.Å ha en reproduserbar protokoll for å indusere eryptose kan hjelpe forskere på noen av disse feltene til å undersøke ytterligere vitenskapelige spørsmål som er spesifikke for hvert felt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyser av mitokondrie kalsium tilstrømning av isolerte mitokondrier og kultivert celler

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Inne vivo kalsium tenkelig inne C. elegans kropp mur muskelen

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) for RNA Isolation fra endothelial celler in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende enheter (SUBEs) som verktøy for berikelse, isolasjon, identifisering og karakterisering av SUMO proteom i leverkreft

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ultra-High-Speed Western Blot ved hjelp av immunoreaction styrke teknologi

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Rask bestemmelse av antistoff-antigen affinitet av masse fotometri

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Indre mitokondriemembranfølsomhet overfor Na+ avslører delvis segmenterte funksjonelle coq-bassenger

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

En semi-automatisert og reproduserbar biologisk-basert metode for å kvantifisere kalsiumavsetning in vitro

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

En "dual-addisjon" kalsiumfluorescensanalyse for høy gjennomstrømningsscreening av rekombinante G-proteinkoblede reseptorer

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...