Name: induction of eryptosis in red blood cells using a calcium ionophore
Uploaded: 2020-01-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом NIH R15ES030140 и грантом NSF CBET1903568. Подтверждена также финансовая поддержка со стороны Русского инженерно-технологического колледжа и кафедры химической и биомолекулярной инженерии Университета Огайо.

Все образцы крови человека, использованные в описанном ниже протоколе, были приобретены в качестве деидентифицированных образцов. Ни один человек не был непосредственно вовлечен или набран для этого исследования. Руководящие принципы Хельсинкской декларации должны использоваться в ...

<ol>
	<li>Bratosin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Cell+Death+in+Mature+Erythrocytes:+A+Model+for+Investigating+Death+Effector+Pathways+Operating+in+the+Absence+of+Mitochondria.">Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 8 (12), 1143-1156 (2001).</li><li>Lang, E., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Pathophysiological+Significance+of+Eryptosis,+the+Suicidal+Erythrocyte+Death.">Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).</li><li>Garnier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+Deformability+in+Diabetes+and+Erythrocyte+Membrane+Lipid+Composition.">Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition.</a> Metabolism. 39 (8), 794-798 (1990).</li><li>Verkleij, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Asymmetric+Distribution+of+Phospholipids+in+the+Human+Red+Cell+Membrane.+A+Combined+Study+Using+Phospholipases+and+Freeze-Etch+Electron+Microscopy.">The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323 (2), 178-193 (1973).</li><li>de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Macrophages+and+Red+Blood+Cells;+A+Complex+Love+Story.">Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story.</a> Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).</li><li>Fadok, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Receptor+for+Phosphatidylserine-Specific+Clearance+of+Apoptotic+Cells.">A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells.</a> Nature. 405 (6782), 85-90 (2000).</li><li>Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phosphatidylserine+Receptor:+A+Crucial+Molecular+Switch.">The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (8), 627-633 (2001).</li><li>Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Insights+into+the+Mechanism+for+Clearance+of+Apoptotic+Cells.">New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells.</a> BioEssays. 22 (10), 878-881 (2000).</li><li>Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis+in+Hereditary+Spherocytosis+and+Thalassemia:+Role+of+Glycoconjugates.">Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates.</a> Glycoconjugate Journal. 27 (9), 717-722 (2010).</li><li>Kuypers, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Altered+Membrane+Phospholipid+Asymmetry+in+Subpopulations+of+Human+Red+Blood+Cells+Using+Fluorescently+Labeled+Annexin+V.">Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V.</a> Blood. 87 (3), 1179-1197 (1996).</li><li>Lang, F., Lang, E., Fller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+Pathophysiology+of+Eryptosis.">Physiology and Pathophysiology of Eryptosis.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 308-314 (2012).</li><li>Wr&#243;bel, A., Bobrowska-H&#228;gerstrand, M., Lindqvist, C., H&#228;gerstrand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Membrane+Phospholipid+Scrambling+in+Human+Erythrocytes+and+K562+Cells+with+FM1-43+-+a+Comparison+with+Annexin+V-FITC.">Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 - a Comparison with Annexin V-FITC.</a> Cellular and Molecular Biology Letters. 19 (2), 262-276 (2014).</li><li>Mohandas, N., Gallagher, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+Cell+Membrane:+Past,+Present,+and+Future.">Red Cell Membrane: Past, Present, and Future.</a> Blood. 112 (10), 3939-3948 (2008).</li><li>Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminophospholipid+Translocase+and+Phospholipid+Scramblase+Activities+in+Sickle+Erythrocyte+Subpopulations.">Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations.</a> British Journal of Haematology. 146 (4), 447-455 (2009).</li><li>Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Review+on+Eryptosis.">A Comprehensive Review on Eryptosis.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 39 (5), 1977-2000 (2016).</li><li>Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-Dependent+Phospholipid+Scrambling+by+TMEM16F.">Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F.</a> Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).</li><li>Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Suicidal+Erythrocyte+Death+by+Volasertib.">Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (4), 1472-1486 (2017).</li><li>Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Phospholipid+Organization+in+Calcium-Loaded+Human+Erythrocytes.">Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 902 (2), 253-262 (1987).</li><li>Alzoubi, K., Calabr&#242;, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+of+Programmed+Erythrocyte+Death+by+Alantolactone.">Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone.</a> Toxins (Basel). 6 (12), 3596-3612 (2014).</li><li>Jacobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+Erythrocyte+Cell+Membrane+Scrambling+by+Mitotane.">Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 4 (33), 1516-1526 (2014).</li><li>Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractoriness+of+Eryptotic+Red+Blood+Cells+to+Plasmodium+Falciparum+Infection:+A+Putative+Host+Defense+Mechanism+Limiting+Parasitaemia.">Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia.</a> PLoS One. 6 (10), e26575 (2011).</li><li>Borst, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Adhesion+of+Eryptotic+Erythrocytes+to+Endothelial+Cells+via+CXCL16/SR-PSOX.">Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (4), C644-C651 (2011).</li><li>Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Phosphatidylserine-Specific+Peptide-Conjugated+Liposomes+Using+a+Model+System+of+Malaria-Infected+Erythrocytes.">Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38 (10), 1649-1651 (2015).</li><li>Mahmud, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suicidal+Erythrocyte+Death,+Eryptosis,+as+a+Novel+Mechanism+in+Heart+Failure-Associated+Anaemia.">Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia.</a> Cardiovascular Research. 98 (1), 37-46 (2013).</li><li>Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+Eryptosis,+the+Suicidal+Erythrocyte+Death+by+Piceatannol.">Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (6), 2300-2310 (2016).</li><li>Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrambling+of+Phospholipids+Activates+Red+Cell+Membrane+Cholesterol.">Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol.</a> Biochemistry. 46 (8), 2233-2238 (2007).</li><li>Lang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis,+a+Window+to+Systemic+Disease.">Eryptosis, a Window to Systemic Disease.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 22 (6), 373-380 (2008).</li><li>Gil-Parrado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionomycin-Activated+Calpain+Triggers+Apoptosis.+A+Probable+Role+for+Bcl-2+Family+Members.">Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27217-27226 (2002).</li><li>Liu, C. M., Hermann, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ionomycin+as+a+Calcium+Ionophore.">Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore.</a> Journal of Biological Chemistry. 253 (17), 5892-5894 (1978).</li><li>Klarl, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Mediates+Erythrocyte+"Programmed+Cell+Death"+Following+Glucose+Depletion.">Protein Kinase C Mediates Erythrocyte "Programmed Cell Death" Following Glucose Depletion.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), C244-C253 (2006).</li><li>Danilov, Y. N., Cohen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Germ+Agglutinin+but+Not+Concanavalin+A+Modulates+Protein+Kinase+C-Mediated+Phosphorylation+of+Red+Cell+Skeletal+Proteins.">Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins.</a> FEBS Letters. 257 (2), 431-434 (1989).</li><li>Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Outer+Leaflet+Is+the+Primary+Regulator+of+Membrane+Damage+Induced+by+Silica+Nanoparticles+in+Vesicles+and+Erythrocytes.">Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes.</a> Environmental Science Nano. 6 (4), 1219-1232 (2019).</li><li>Jaroszeski, M. J., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow Cytometry Protocols. , (2003).</li><li>Ghashghaeinia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Erythrocyte+Age+on+Eryptosis.">The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis.</a> British Journal of Haematology. 157 (5), 1365 (2012).</li><li>Repsold, L., Joubert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis:+An+Erythrocyte's+Suicidal+Type+of+Cell+Death.">Eryptosis: An Erythrocyte's Suicidal Type of Cell Death.</a> Biomed Research International. 2018 (5), 9405617 (2018).</li><li>Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+Binding+Properties+of+Human+Placental+Anticoagulant+Protein-I,+a+Member+of+the+Lipocortin+Family.">Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 7944-7949 (1989).</li><li>Andree, H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Vascular+Anticoagulant+&#945;+(VAC&#945;)+to+Planar+Phospholipid+Bilayers.">Binding of Vascular Anticoagulant &#945; (VAC&#945;) to Planar Phospholipid Bilayers.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (9), 4923-4928 (1990).</li><li>Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+Affinity+and+Cooperativity+of+Annexin+V-Membrane+Binding+under+Conditions+of+Low+Membrane+Occupancy.">Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy.</a> Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).</li><li>Jiang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis+as+an+Underlying+Mechanism+in+Systemic+Lupus+Erythematosus-Related+Anemia.">Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).</li><li>Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+and+Platelet+Proteomics+in+Hematological+Disorders.">Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).</li></ol>

Целью данной процедуры является обеспечение оптимальных значений концентрации ионофора, времени лечения и внеклеточной концентрации глюкозы, которые являются важными факторами обеспечения успешной индукции эриптобиа. Важным шагом в протоколе является истощение внеклеточной глюко?...

Запрограммированная гибель клеток в эритроцитах, также известных как эриптоз, распространена во многих клинических условиях и гематологических расстройствах. Eryptosis связано с усадкой клеток и потерей фосфолипидной асимметрии в мембране плазмы клетки1,2. Потеря асимметрии приводит к транслокации фосфатидилсерина (PS), липида, обычно локализуемого во внутренней листовке3,4, к клеточной внешней листовке, которая сигнализирует макрофагам на фагоциты и удаляет дефектные эритроциты5,6,7,8. В конце нормальной продолжительности жизни эритроцитов удаление эриптотических клеток макрофагами обеспечивает баланс эритроцитов в обращении. Однако, в болезненных условиях, таких как серповидно-клеточная болезнь и талассемия9,10,11, повышенный эриптоз может привести к тяжелой анемии2. Из-за его важности в гематологических заболеваний, существует значительный интерес к изучению факторов, вызывающих или ингибирующих эриптоб и молекулярных механизмов, лежащих в основе этого процесса.
Плазменная мембрана здоровых эритроцитов асимметрична, с различными фосфолипидами, локализующихся на наружных и внутренних листовках. Мембранная асимметрия в первую очередь регулируется действием мембранных ферментов. Аминофосфолипид транслокс облегчает транспортировку аминофосфолипидов, PS и фосфатидиэтаноламин (ПЭ), направляя эти липиды на клеточной внутренней листовке. С другой стороны, флоппас транспортирует холин, содержащий фосфолипиды, фосфатидилхолин (ПК) и сфингомиелин (СМ), от внутренней к внешней листовке клеточной мембраны12. Однако, в отличие от здоровых клеток, мембрана эритроцитов скремблируется. Это связано с действием третьего фермента, скремблаза, который нарушает фосфолипидную асимметрию, облегчая двунаправленный перенос аминофосфолипидов13,14,15,16. Scramblase активируется повышенными внутриклеточными уровнями Ca2 . Таким образом, ионофоры кальция, которые облегчают транспортировку Ca2 "через клеточную мембрану12, являются эффективными индукторами эриптоса.
Иономицин, ионофор кальция, широко используется для индуцирования эриптоза в эритроцитах12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Иономицин имеет как гидрофильные, так и гидрофобные группы, которые необходимы для связывания и захвата иона Ca2 и транспортировать его в цитозолическое пространство27,28,29. Это приводит к активации скремблаза и транслокации PS на внешнюю листовку, которая может быть легко обнаружена с помощью приложения-V, клеточного белка с высоким сродством к PS12. Хотя запуск эриптоза иомамицином обычно сообщается, есть значительное расхождение метода в литературе (Таблица 1). Популяция эритроцитов, проходящих эриптоз, зависит от различных факторов, таких как концентрация ионофора, время лечения ионофором, а также содержание сахара в внеклеточной среде (истощение глюкозы активирует каналы катионов и облегчает вхождение Ca2 в цитозоликическое пространство)30,31. Тем не менее, есть мало последовательности в этих факторов в литературе, что затрудняет выполнение эриптоза воспроизводимо in vitro.
В этом протоколе мы представляем пошаговую процедуру, чтобы вызвать эритроциты человека. Учитываются факторы, влияющие на успешный эрипток, включая концентрацию Ca2, концентрацию ионофора, время лечения и предварительное инкубацию в глюкозно-обеденный буфер и сообщается об оптимальных значениях. Эта процедура показывает, что прединкубация эритроцитов в буфере без глюкозы значительно увеличивает процент эриптоза по сравнению с глюкозосодержащим буфером. Этот протокол может быть использован в лаборатории для производства эриптотических эритроцитов для различных применений.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A10788</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>643177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M7157</td>
			<td>Model Eppendorf 5415C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Zeiss, LSM Tek Thornwood</td>
			<td></td>
			<td>Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses circles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable round bottom flow cytometry tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRU47729-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer (1 M)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7290</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>EMD Milipore Corp.</td>
			<td>407952-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain glass microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HFM microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole blood in ACD</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4 &#176;C and warm to 37 &#176;C prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of eryptosis in red blood cells using a calcium ionophore

Эриптоз, эритроцит запрограммированной клеточной смерти, возникает при ряде гематологических заболеваний и при травме эритроцитов. Отличительной чертой эриптотических клеток является потеря композиционной асимметрии клеточной мембраны, что приводит к транслокации фосфатидилсерина в мембранную внешнюю листовку. Этот процесс вызван повышенной внутриклеточной концентрацией Ca2 ,который активирует скремблаз, фермент, который облегчает двунаправленное движение фосфолипидов между мембранными листовками. Учитывая важность эриптоз в различных заболеваний, были предприняты усилия, чтобы вызвать эриптоз в пробирке. Такие усилия, как правило, опирались на ионофор кальция, иономицин, для повышения внутриклеточной концентрации Ca2 "и вызвать эриптоз. Тем не менее, многие расхождения были зарегистрированы в литературе в отношении процедуры индуцирования эриптоз с использованием иомамицина. В этом мы сообщаем о поэтапном протоколе для иономицина индуцированного эриптозва в эритроцитах человека. Мы фокусируемся на важных шагах в процедуре, включая концентрацию ионофора, время инкубации и истощение глюкозы, и обеспечиваем репрезентативный результат. Этот протокол может быть использован для воспроизводимого индуцирования эриптоза в лаборатории.

Оптимизация концентрации иомицина
В то время как иономицин необходим для индуцирования эриптоза, увеличение концентрации иомицина может привести к гемолизу (т.е. лизозу эритроцитов и высвобождению гемоглобина), чего необход?...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore at JoVE.com

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

Предусмотрен протокол индукции эриптоз, запрограммированный клеточной смерти в эритроцитах, с использованием ионофора кальция, иономицина. Успешный эриптоз оценивается путем мониторинга локализации фосфатидилсерина во мембранной внешней листовке. Были изучены факторы, влияющие на успешность протокола, и обеспечены оптимальные условия.

Индукция эриптоза в клетках красных кровяных клеток с использованием ионофора кальция

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...

Там было много усилий, чтобы вызвать эриптоз с помощью иономицина. Однако точная процедура этого процесса четко не изложена в литературе. Мы предоставляем пошаговую процедуру, чтобы вызвать эриптоз с помощью иономицина.Основным преимуществом этой процедуры является индуцировать эриптоз в эритроцитах человека надежным и воспроизводимым образом. Для начала добавьте 500 микролитров холодной цельной крови в кислотный цитрат декстроза в микроцентрифугную трубку. Центрифуга всей крови в 700 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре и удалить щепу плазмы и тонкой баффи пальто с помощью пипетки, чтобы оставить красный слой эритроцитов.Приготовьте один литр раствора Ringer, содержащего 125 миллимолярия хлорида натрия, пять миллимолярия хлорида калия, один миллимолянный сульфат магния, 32 миллимолярных HEPES, пять миллимоляр глюкозы и один миллимолянный хлорид кальция. Отрегулируйте рН до 7,4, добавив две капли микролитера одного гидроксида натрия моляра. Для приготовления раствора Ringer без глюкозы следуйте тому же протоколу, но не включайтесь в раствор глюкозы.Вымойте эритроциты дважды в растворе Ringer, приостановив гранулы клетки в 1,5 миллилитров раствора Ringer, центрифугирование в 700 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре и удаление супернатанта. Затем сделайте 0,4%гематокрит путем повторного перерасхода 40 микролитров эритроцитов гранулы в 9, 960 микролитров без глюкозы Ringer раствор для достижения окончательного объема 10 миллилитров. Инкубировать подвеску клетки при 37 градусах по Цельсию в течение семи дней.Предварительная инкубация эритроцитов в буфере без глюкозы значительно вызывает эриптоз. Высокий эриптоз был получен после семи дней предварительной инкубации в буфере без сахара. Растворите один миллиграмм соли кальция иономицина в 630 микролитров DMSO, чтобы достичь конечной концентрации двух миллимоляров.Aliquot в 20 миллилитров и хранить при минус 20 градусов по Цельсию. Возьмите один миллилитр подготовленного 0,4% гематокрита и добавьте 0,5 микролитров двух миллимолярный иономицин, чтобы достичь конечной концентрации одного микромолара. Инкубировать в течение двух часов при 37 градусах по Цельсию.Используйте один миллилитр гематокрита без лечения иономицина в качестве отрицательного контроля. Центрифуга иономицин лечение и необработанные гематокриты в 700 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре и удалить их supernatants оставить клетки гранулы в нижней части труб. Вымойте клетки три раза раствором Ringer, приостановив клеточные гранулы в 1,5 миллилитров раствора Ringer, центрифугирование при 700 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре и отбрасывая супернатанты.Для измерения гемолита добавьте один миллилитр необработанного 0,4%гематократа в микроцентрифугную трубку и инкубировать в течение двух часов при 37 градусах по Цельсию в качестве отрицательного контроля 0%гемолита. Чтобы подготовить положительный контроль 100%гемолита, добавьте один миллилитр необработанного 0,4%гематократа в микроцентрифугную трубку и центрифугу при 700 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Удалите супернатант и добавьте один миллилитр дистиллированной воды в клеточные гранулы, чтобы повторно использовать и инкубировать в течение двух часов при 37 градусах по Цельсию.Затем добавьте один миллилитр иономицина, обработанного 0,4% гематократа, в микроцентрифугную трубку. Центрифуга необработанных клеток, обработанных клеток и клеток в дистиллированной воде в 700 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре. Перенесите 200 микролитров супернатантов в каждый колодец из пластины из 96 колодец.Измерьте абсорбанс на 541 нанометров с помощью микро-считыватель пластин. Рассчитайте гемолиз с помощью уравнения, где A0, A100 и AT являются абсорбцией эритроцитов в растворе Ringer в воде и поглощением обработанных эртироцитов иономицином. Разбавить два миллилитров 5X Annexin-V связывающего буфера в восьми миллилитров PBS для получения 1X связывания буфера.Повторное производство обработанных иономицином и необработанных клеточных гранул в одном миллилитре 1X связывающего буфера. Возьмите 235 микролитров клеточных суспензий в буфере связывания и добавьте 15 микролитров конъюгации Annexin-V Alexa Fluor 488 в микроцентрифуговую трубку. Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 20 минут в темном месте.Центрифуга при 700 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре. Удалите супернатант. Вымойте клетки дважды с 1X связывающим буфером, приостановив гранулы клетки в 1,5 миллилитров связывающего буфера и центрифугирование при 700 раз g в течение пяти минут при комнатной температуре.Удалите супернатант и повторно посовестите клеточные гранулы в 250 микролитров 1X связывающего буфера для измерения цитометрии потока. Теперь перенесите 200 микролитров окрашенных эритроцитов Annexin-V в один миллилитр круглых нижних полистироловых трубок, совместимых с цитометрией потока. Войдите в программное обеспечение цитометрии потока и нажмите на новую кнопку эксперимента.Нажмите на новую кнопку трубки. Выберите глобальный лист и выберите анализ применения для измерения интенсивности флуоресценции с возбуждением длины волны 488 нанометров и длиной волны выбросов 530 нанометров. Установите количество ячеек до 20 000, которые будут собраны для анализа флуоресценции активированной сортировки клеток.Выберите нужную трубку и нажмите на кнопку нагрузки. Нажмите на кнопку записи для измерения рассеяния вперед и бокового рассеяния. Повторите для всех образцов.Нажмите кнопку «Справа» на кнопку «Образец» и нажмите на анализ партии для создания файла результатов. Нажмите кнопку «Справа» и нажмите на файлы FSC. В этом протоколе, лечение эритроцитов с одним микромолярным иономицином и Ringer решение в течение двух часов было достаточно, чтобы вызвать эриптоз, о чем свидетельствует успешная маркировка с Annexin-V Fluor 488 спряжения и количественной оценки по анализу FACS.Более высокие концентрации иономицина в 5 и 10 микромолях привели к небольшому увеличению эриптоза. Однако такие концентрации также усиливают гемолиз. Инкубации эритроцитов в растворе иономицин и рингер всего за 30 минут было достаточно, чтобы вызвать эриптоз.Увеличение инкубации увеличило уровень эриптоза на срок до двух часов. Однако дальнейшее инкубацио время привело к незначительному снижению уровня эриптоза. Более высокое значение гемолизиса через 180 минут объясняет снижение эриптоза после того же количества инкубации, что и менее жизнеспособные клетки, существовавшие на 180 минут лечения иономицином.Эритроциты с иономицином показали яркий сигнал флуоресценции к связыванию Приложения-V с фосфатил серином во внешней листовке. В отличие от этого, клетки без лечения показали очень слабый сигнал флуоресценции, указывающий на очень низкий эриптоз. Предварительная инкубация в буфере без глюкозы является важным триггером для индукции эриптоза.Так как эриптоз наблюдается при широком спектре заболеваний, эксперименты, следующие по этому протоколу, специфичны для поля. В нашей лаборатории мы заинтересованы в изучении влияния эриптоза на мембранные биофизические свойства и мембранные взаимодействия с наноматериалами. Эриптоз связан с большим количеством заболеваний, включая диабет, серповидноклеточная анемия и талассемия.Наличие воспроизводимого протокола для индуцирования эриптоза может помочь исследователям в любой из этих областей исследовать дальнейшие научные вопросы, характерные для каждой области.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Анализ митохондриальной кальция приток в изолированных митохондриях и культивируемых клеток

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

В Vivo Кальций Imaging в C. elegans мышцы стены тела

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Перевод Рибосома Сроднистого Очищения (TRAP) для изоляции РНК от эндотелиальных клеток In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-обязательные организации (SUBEs) как инструменты для обогащения, изоляции, идентификации и характеристики ПРОтеоме СУМО при раке печени

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ультра-высокоскоростной западный пятно с использованием иммунореакции Повышение технологии

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Быстрое определение антител-антигена Аффинити по массовой фотометрии

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Анализ флуоресценции кальция с двойным добавлением для высокопроизводительного скрининга рекомбинантных рецепторов, связанных с G-белком

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins

Выявление динамических изменений белков эритроцитов с помощью иммуноокрашивания

Antibody labeling of red blood cell (RBC) proteins is a commonly used, semi-quantitative method to detect changes in overall protein content or acute ...

Смартфон как аналитическое устройство для количественного определения белка с помощью анализа Брэдфорда

RGBradford: Protein Quantitation with a Smartphone Camera

В центре внимания автора: Альтернативный подход к количественной оценке белка с помощью анализа Брэдфорда с помощью смартфона 

RGBradford: Количественное определение белка с помощью камеры смартфона

Protein quantitation is an essential procedure in life sciences research. Amongst several other methods, the Bradford assay is one of the most used. ...