Name: induction of eryptosis in red blood cells using a calcium ionophore
Uploaded: 2020-01-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH Grant R15ES030140 och NSF Grant CBET1903568. Ekonomiskt stöd från Russ College of Engineering och teknik och Institutionen för kemisk och Biomolekylär teknik vid Ohio University är också erkänt.

Alla humanblod prov som används i protokollet som beskrivs nedan köptes som avidentifierade prover. Inga försökspersoner var direkt involverade eller rekryterade för denna studie. Riktlinjerna i Helsingforsdeklarationen bör användas när forskningen involverar försökspersoner.
1. erytrocytisolering från helblod
<ol><li>Tillsätt 500 μL helblod i surt citrat dextros (ACD) (förvaras vid 4 ° c) till ett microcentrifugerör. Obs: helblod köptes i ACD. Enligt företaget, 1,5 mL a...

<ol>
	<li>Bratosin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Cell+Death+in+Mature+Erythrocytes:+A+Model+for+Investigating+Death+Effector+Pathways+Operating+in+the+Absence+of+Mitochondria.">Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 8 (12), 1143-1156 (2001).</li><li>Lang, E., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Pathophysiological+Significance+of+Eryptosis,+the+Suicidal+Erythrocyte+Death.">Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).</li><li>Garnier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+Deformability+in+Diabetes+and+Erythrocyte+Membrane+Lipid+Composition.">Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition.</a> Metabolism. 39 (8), 794-798 (1990).</li><li>Verkleij, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Asymmetric+Distribution+of+Phospholipids+in+the+Human+Red+Cell+Membrane.+A+Combined+Study+Using+Phospholipases+and+Freeze-Etch+Electron+Microscopy.">The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323 (2), 178-193 (1973).</li><li>de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Macrophages+and+Red+Blood+Cells;+A+Complex+Love+Story.">Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story.</a> Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).</li><li>Fadok, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Receptor+for+Phosphatidylserine-Specific+Clearance+of+Apoptotic+Cells.">A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells.</a> Nature. 405 (6782), 85-90 (2000).</li><li>Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phosphatidylserine+Receptor:+A+Crucial+Molecular+Switch.">The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (8), 627-633 (2001).</li><li>Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Insights+into+the+Mechanism+for+Clearance+of+Apoptotic+Cells.">New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells.</a> BioEssays. 22 (10), 878-881 (2000).</li><li>Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis+in+Hereditary+Spherocytosis+and+Thalassemia:+Role+of+Glycoconjugates.">Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates.</a> Glycoconjugate Journal. 27 (9), 717-722 (2010).</li><li>Kuypers, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Altered+Membrane+Phospholipid+Asymmetry+in+Subpopulations+of+Human+Red+Blood+Cells+Using+Fluorescently+Labeled+Annexin+V.">Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V.</a> Blood. 87 (3), 1179-1197 (1996).</li><li>Lang, F., Lang, E., Fller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+Pathophysiology+of+Eryptosis.">Physiology and Pathophysiology of Eryptosis.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 308-314 (2012).</li><li>Wr&#243;bel, A., Bobrowska-H&#228;gerstrand, M., Lindqvist, C., H&#228;gerstrand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Membrane+Phospholipid+Scrambling+in+Human+Erythrocytes+and+K562+Cells+with+FM1-43+-+a+Comparison+with+Annexin+V-FITC.">Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 - a Comparison with Annexin V-FITC.</a> Cellular and Molecular Biology Letters. 19 (2), 262-276 (2014).</li><li>Mohandas, N., Gallagher, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+Cell+Membrane:+Past,+Present,+and+Future.">Red Cell Membrane: Past, Present, and Future.</a> Blood. 112 (10), 3939-3948 (2008).</li><li>Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminophospholipid+Translocase+and+Phospholipid+Scramblase+Activities+in+Sickle+Erythrocyte+Subpopulations.">Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations.</a> British Journal of Haematology. 146 (4), 447-455 (2009).</li><li>Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Review+on+Eryptosis.">A Comprehensive Review on Eryptosis.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 39 (5), 1977-2000 (2016).</li><li>Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-Dependent+Phospholipid+Scrambling+by+TMEM16F.">Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F.</a> Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).</li><li>Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Suicidal+Erythrocyte+Death+by+Volasertib.">Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (4), 1472-1486 (2017).</li><li>Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Phospholipid+Organization+in+Calcium-Loaded+Human+Erythrocytes.">Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 902 (2), 253-262 (1987).</li><li>Alzoubi, K., Calabr&#242;, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+of+Programmed+Erythrocyte+Death+by+Alantolactone.">Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone.</a> Toxins (Basel). 6 (12), 3596-3612 (2014).</li><li>Jacobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+Erythrocyte+Cell+Membrane+Scrambling+by+Mitotane.">Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 4 (33), 1516-1526 (2014).</li><li>Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractoriness+of+Eryptotic+Red+Blood+Cells+to+Plasmodium+Falciparum+Infection:+A+Putative+Host+Defense+Mechanism+Limiting+Parasitaemia.">Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia.</a> PLoS One. 6 (10), e26575 (2011).</li><li>Borst, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Adhesion+of+Eryptotic+Erythrocytes+to+Endothelial+Cells+via+CXCL16/SR-PSOX.">Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (4), C644-C651 (2011).</li><li>Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Phosphatidylserine-Specific+Peptide-Conjugated+Liposomes+Using+a+Model+System+of+Malaria-Infected+Erythrocytes.">Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38 (10), 1649-1651 (2015).</li><li>Mahmud, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suicidal+Erythrocyte+Death,+Eryptosis,+as+a+Novel+Mechanism+in+Heart+Failure-Associated+Anaemia.">Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia.</a> Cardiovascular Research. 98 (1), 37-46 (2013).</li><li>Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+Eryptosis,+the+Suicidal+Erythrocyte+Death+by+Piceatannol.">Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (6), 2300-2310 (2016).</li><li>Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrambling+of+Phospholipids+Activates+Red+Cell+Membrane+Cholesterol.">Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol.</a> Biochemistry. 46 (8), 2233-2238 (2007).</li><li>Lang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis,+a+Window+to+Systemic+Disease.">Eryptosis, a Window to Systemic Disease.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 22 (6), 373-380 (2008).</li><li>Gil-Parrado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionomycin-Activated+Calpain+Triggers+Apoptosis.+A+Probable+Role+for+Bcl-2+Family+Members.">Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27217-27226 (2002).</li><li>Liu, C. M., Hermann, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ionomycin+as+a+Calcium+Ionophore.">Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore.</a> Journal of Biological Chemistry. 253 (17), 5892-5894 (1978).</li><li>Klarl, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Mediates+Erythrocyte+"Programmed+Cell+Death"+Following+Glucose+Depletion.">Protein Kinase C Mediates Erythrocyte "Programmed Cell Death" Following Glucose Depletion.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), C244-C253 (2006).</li><li>Danilov, Y. N., Cohen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Germ+Agglutinin+but+Not+Concanavalin+A+Modulates+Protein+Kinase+C-Mediated+Phosphorylation+of+Red+Cell+Skeletal+Proteins.">Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins.</a> FEBS Letters. 257 (2), 431-434 (1989).</li><li>Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Outer+Leaflet+Is+the+Primary+Regulator+of+Membrane+Damage+Induced+by+Silica+Nanoparticles+in+Vesicles+and+Erythrocytes.">Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes.</a> Environmental Science Nano. 6 (4), 1219-1232 (2019).</li><li>Jaroszeski, M. J., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow Cytometry Protocols. , (2003).</li><li>Ghashghaeinia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Erythrocyte+Age+on+Eryptosis.">The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis.</a> British Journal of Haematology. 157 (5), 1365 (2012).</li><li>Repsold, L., Joubert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis:+An+Erythrocyte's+Suicidal+Type+of+Cell+Death.">Eryptosis: An Erythrocyte's Suicidal Type of Cell Death.</a> Biomed Research International. 2018 (5), 9405617 (2018).</li><li>Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+Binding+Properties+of+Human+Placental+Anticoagulant+Protein-I,+a+Member+of+the+Lipocortin+Family.">Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 7944-7949 (1989).</li><li>Andree, H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Vascular+Anticoagulant+&#945;+(VAC&#945;)+to+Planar+Phospholipid+Bilayers.">Binding of Vascular Anticoagulant &#945; (VAC&#945;) to Planar Phospholipid Bilayers.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (9), 4923-4928 (1990).</li><li>Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+Affinity+and+Cooperativity+of+Annexin+V-Membrane+Binding+under+Conditions+of+Low+Membrane+Occupancy.">Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy.</a> Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).</li><li>Jiang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis+as+an+Underlying+Mechanism+in+Systemic+Lupus+Erythematosus-Related+Anemia.">Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).</li><li>Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+and+Platelet+Proteomics+in+Hematological+Disorders.">Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).</li></ol>

Målet med detta förfarande är att ge optimala värden för jonofortoxikos koncentration, behandlingstid, och extracellulära glukoskoncentration, som är viktiga faktorer för att säkerställa en framgångsrik induktion av eryptos. Ett kritiskt steg i protokollet är utarmningen av extracellulära glukos, som, trots dess betydelse, inte har tillräckligt betonats i litteraturen. Sockerhalten i normal ring lösning (5 mM) har en hämmande effekt på eryptos. Glukos utarmning i den extracellulära miljön inducerar cel...

Programmerad celldöd i erytrocyter, även känd som eryptos, är vanligt i många kliniska tillstånd och hematologiska sjukdomar. Eryptos är associerat med cell krympning och förlusten av fosfolipid asymmetri i cell plasmamembranet1,2. Förlust av asymmetri resulterar i flyttning av Fosfatidylserin (PS), en lipid normalt lokaliserad i den inre broschyren3,4, till cellen yttre broschyren, som signalerar till makrofager till fagocytos och ta bort defekta erytrocyter5,6,7,8. I slutet av den normala livslängden av erytrocyter, avlägsnande av eryptotiska celler av makrofager säkerställer balansen av erytrocyter i omlopp. Emellertid, i sjuka förhållanden, såsom sicklecellanemi och thalassemi9,10,11, förbättrad eryptos kan resultera i allvarlig anemi2. På grund av dess betydelse i hematologiska sjukdomar, det finns ett betydande intresse för att undersöka de faktorer som inducerar eller hämmar eryptos och de molekylära mekanismerna bakom denna process.
Plasmamembranet av friska erytrocyter är asymmetriskt, med olika fosfolipider lokalisera på den yttre och inre broschyrer. Membran asymmetri regleras främst av effekten av membran enzymer. Aminofosfolipid translocase underlättar transporten av aminofosfolipider, PS och fosfatidyletanolamin (PE), genom att rikta dessa lipider till cellen inre broschyr. Å andra sidan, floppase transporterar kolin som innehåller fosfolipider, fosfatidylkolin (PC) och ceramidas (SM), från insidan till den yttre broschyren av cellmembranet12. Men, till skillnad från friska celler, membranet av eryptotiska erytrocyter är förvrängd. Detta beror på effekten av ett tredje enzym, scramblase, som stör fosfolipid asymmetri genom att underlätta dubbelriktad transport av aminofosfolipider13,14,15,16. Scramblase aktiveras av förhöjda intracellulära nivåer av ca2 +. Därför är kalcium ionophores, som underlättar transporten av ca2 + över cellmembranet12, effektiva inducerare av eryptos.
Ionomycin, en kalciumionophore, har använts i stor utsträckning för att inducera eryptos i erytrocyter12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Ionomycin har både hydrofila och hydrofoba grupper, som är nödvändiga för att binda och fånga ca2 + Jon, och transportera den till cytosoliska utrymme27,28,29. Detta leder till aktivering av scramblase och flyttning av PS till den yttre broschyren, som lätt kan upptäckas med Annexin-V, ett cellulärt protein med hög affinitet till PS12. Även om utlösande eryptos av ionomycin rapporteras vanligen, det finns betydande metod avvikelse i litteraturen (tabell 1). Populationen av erytrocyter som genomgår eryptos beror på olika faktorer såsom jonofortoxikos koncentration, behandlingstid med jonofortoxikos, och sockerhalt i extracellulära miljön (glukos utarmning aktiverar cation kanaler och underlättar införsel av ca2 + in i cytosoliska rymden)30,31. Emellertid, det finns lite konsekvens i dessa faktorer i litteraturen, vilket gör det svårt att utföra eryptosis reproducerbart in vitro-.
I detta protokoll presenterar vi ett steg-för-steg-förfarande för att inducera eryptos i humana erytrocyter. Faktorer som påverkar framgångsrik eryptos inklusive ca2 + koncentration, jonofortoxikos koncentration, behandlingstid, och pre-inkubation i glukos-utarmat buffert undersöks och optimala värden rapporteras. Detta förfarande visar att pre-inkubation av erytrocyter i en glukos-fri buffert avsevärt ökar andelen eryptos jämfört med glukos-innehållande buffert. Detta protokoll kan användas i laboratoriet för att producera eryptotiska erytrocyter för olika tillämpningar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A10788</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>643177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M7157</td>
			<td>Model Eppendorf 5415C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Zeiss, LSM Tek Thornwood</td>
			<td></td>
			<td>Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses circles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable round bottom flow cytometry tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRU47729-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer (1 M)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7290</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>EMD Milipore Corp.</td>
			<td>407952-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain glass microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HFM microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole blood in ACD</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4 &#176;C and warm to 37 &#176;C prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of eryptosis in red blood cells using a calcium ionophore

Eryptosis, erytrocyt programmerad celldöd, förekommer i ett antal hematologiska sjukdomar och under skador på erytrocyter. Ett kännetecken för eryptotiska celler är förlusten av kompositionella asymmetri i cellmembranet, vilket leder till flyttning av fosfatidylserin till membranet yttre broschyren. Denna process utlöses av ökad intracellulär koncentration av ca2 +, som aktiverar scramblase, ett enzym som underlättar dubbelriktad förflyttning av fosfolipider mellan membran broschyrer. Med tanke på betydelsen av eryptos i olika sjuka förhållanden, det har gjorts ansträngningar för att inducera eryptos in vitro-. Sådana insatser har i allmänhet förlitat sig på kalcium Ionophore, ionomycin, att öka intracellulära ca2 + koncentration och inducera eryptos. Emellertid, många avvikelser har rapporterats i litteraturen om förfarandet för inducera eryptos med ionomycin. Häri rapporterar vi ett steg-för-steg-protokoll för ionomycin-inducerad eryptos i humana erytrocyter. Vi fokuserar på viktiga steg i förfarandet inklusive jonofortoxikos koncentration, inkubationstid, och glukos utarmning, och ge representativa resultat. Detta protokoll kan användas för att reproducerbart inducera eryptos i laboratoriet.

Optimering av ionomycin koncentration
Medan ionomycin krävs för att inducera eryptos, ökade ionomycin koncentrationer kan leda till hemolys (dvs. lys av erytrocyter och frisättning av hemoglobin), som måste undvikas. Behandling av erytrocyter med 1 μM ionomycin i ringsignal lösning för 2 h är tillräckligt för att inducera eryptos, vilket framgår av framgångsrik märkning med Annexin-V Alexa Flour 48...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore at JoVE.com

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

Ett protokoll för induktion av eryptos, programmerad celldöd i erytrocyter, med hjälp av kalciumionophore, ionomycin, tillhandahålls. Framgångsrik eryptos utvärderas genom att övervaka lokalisering fosfatidylserin i membranet yttre broschyren. Faktorer som påverkar protokollets framgång har undersökts och optimala villkor har ställts.

Induktion av Eryptos i röda blodkroppar med hjälp av en Kalciumionophore

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...

Det har gjorts många ansträngningar för att inducera erytos med hjälp av jonomycin. Det exakta förfarandet för denna process är dock inte tydligt beskrivs i litteraturen. Vi tillhandahåller en steg-för-steg-procedur för att inducera eryptos med hjälp av jonomycin.Den största fördelen med detta förfarande är att inducera eryptos i mänskliga erytrocyter på ett tillförlitligt och reproducerbart sätt. Till att börja med, tillsätt 500 mikroliter kallt helblod i syra citrat dextros till en microcentrifug röret. Centrifugera hela blodet vid 700 gånger g i fem minuter vid rumstemperatur och ta bort den klara plasman och den tunna buffy pälsen med hjälp av en pipett för att lämna den röda erytrocytskiktet.Bered en liter Ringer-lösning innehållande 125 millimolarnatriumklorid, fem millimolärt kaliumklorid, en millimolar magnesiumsulfat, 32 millimolar HEPES, fem millimolarglukos och en millimolarkaloklorid. Justera pH-värdet till 7,4 genom att tillsätta två mikroliterdroppar av en molarnatriumhydroxid. För att förbereda glukosfri Ringer-lösning, följ samma protokoll men inkludera inte glukos i lösningen.Tvätta erytrocyterna två gånger i Ringer-lösning genom att suspendera cellpelletsen i 1,5 milliliter av Ringer-lösning, centrifugera vid 700 gånger g i fem minuter vid rumstemperatur och ta bort supernatanten. Gör sedan en 0,4%hematokrit genom att resuspending 40 mikroliter av erytrocyt pellet i 9, 960 mikroliter glukos-fri Ringer lösning för att nå en slutlig volym på 10 milliliter. Inkubera cellen suspension vid 37 grader Celsius i sju dagar.Pre-inkubation av erytrocyter i en glukosfri buffert utlöser avsevärt eryptos. Hög eryposis erhölls efter sju dagar av pre-inkubation i socker-fri buffert. Lös upp ett milligram jonomycinkalciumsalt i 630 mikroliter dmso för att nå en slutlig koncentration på två millimolar.Aliquot i 20 milliliter och förvara på minus 20 grader Celsius. Ta en milliliter av den beredda 0,4%hematokrit och tillsätt 0,5 mikroliter av två millimolar ionomycin för att nå en slutlig koncentration av en mikromolar. Inkubera i två timmar vid 37 grader Celsius.Använd en milliliter av hematokriten utan ionomycinbehandling som negativ kontroll. Centrifugera de ionomycin behandlade och obehandlade hematokriter vid 700 gånger g i fem minuter vid rumstemperatur och ta bort deras supernatanter för att lämna cellpelletsen längst ner på rören. Tvätta cellerna tre gånger med Ringer-lösning genom att suspendera cellpelletsen i 1,5 milliliter Av Ringer-lösning, centrifugera vid 700 gånger g i fem minuter i rumstemperatur och kassera supernatanterna.För att mäta hemolys, tillsätt en milliliter av den obehandlade 0,4%hematokrit till ett mikrocentrifugrör och inkubera i två timmar vid 37 grader Celsius som negativ kontroll av 0%hemolys. För att förbereda den positiva kontrollen av 100%hemolys, tillsätt en milliliter av den obehandlade 0,4%hematokrit till ett microcentrifugrör och centrifug vid 700 gånger g i fem minuter vid rumstemperatur. Ta bort supernatanten och tillsätt en milliliter destillerat vatten till cellpelletsen för att återanvända och inkubera i två timmar vid 37 grader Celsius.Därefter lägger du till en milliliter av ionomycinbehandlade 0,4%hematokrit till ett microcentrifugrör. Centrifugera de obehandlade cellerna, behandlade celler, och cellerna i destillerat vatten vid 700 gånger g i fem minuter vid rumstemperatur. Överför 200 mikroliter av supernatanterna i varje brunn av en 96-brunnsplatta.Mät absorbansen vid 541 nanometer med hjälp av en mikroplattasläsare. Beräkna hemolysen med hjälp av ekvationen där A0, A100, och AT är absorbansen av erytrocyter i Ringer-lösning i vatten och absorbansen av behandlade erthyrocyter genom ionomycin. Späd två milliliter av 5X-bindningsbufferten 5X i åtta milliliter av PBS för att erhålla 1X bindningsbuffert.Resuspend den ionomycin-behandlade och obehandlade cell pellets i en milliliter av 1X bindningsbuffert. Ta 235 mikroliter av cellupphängningarna i bindningsbufferten och tillsätt 15 mikroliter av Annexin-V Alexa Fluor 488 konjugat i ett mikrocentrifugrör. Inkubera cellerna i rumstemperatur i 20 minuter på en mörk plats.Centrifugera vid 700 gånger g i fem minuter vid rumstemperatur. Ta bort supernatanten. Tvätta cellerna två gånger med 1X bindningsbuffert genom att dra upp cellpelletsen i 1,5 milliliter av bindningsbufferten och centrifugera vid 700 gånger g i fem minuter vid rumstemperatur.Ta bort supernatanten och resuspend cellpelletsen i 250 mikroliter av 1X bindningsbuffert för flödescytometrimätning. Överför nu 200 mikroliter av Annexin-V-färgade erytrocyter till en milliliter rund botten polystyren rör som är kompatibla med flödescytometri. Logga in på flödescytometriprogramvaran och klicka på den nya experimentknappen.Klicka på den nya tube-knappen. Välj det globala arket och välj tillämpa analysen för att mäta fluorescensintensiteten med en excitationsvåglängd på 488 nanometer och en emissionsvåglängd på 530 nanometer. Ställ in antal celler till 20, 000 som ska samlas in för fluorescens aktiverad cellsorteringsanalys.Välj önskat rör och klicka på lastknappen. Klicka på rekordknapp för framåt scatter och sida scatter mätning. Upprepa för alla prover.Högerklicka på provexemplarknappen och klicka på tillämpa batchanalys för att generera resultatfilen. Högerklicka på exemplar knappen och klicka på generera FSC filer. I detta protokoll, behandling av erytrocyter med en mikromolar ionomycin och Ringer lösning i två timmar var tillräckligt för att framkalla eryptos som framgår av framgångsrika märkning med Annexin-V Fluor 488 konjugat och kvantifiering genom FACS analys.Högre koncentrationer av jonoscin vid fem och 10 mikromolar resulterade i en liten ökning av eryptosis. Sådana koncentrationer förbättrade dock även hemolys. Inkubation av erytrocyter i jonommycin och Ringer lösning för så lite som 30 minuter var tillräckligt för att inducera eryptos.Ökad inkubationstid ökade nivån av eryptos i upp till två timmar. Ytterligare inkubationstid resulterade dock i en liten minskning av erytosens nivå. Det högre värdet av hemolys efter 180 minuter förklarar minskningen av eryptos efter samma mängd inkubation som mindre livskraftiga celler fanns på 180 minuters behandling med jonomymos.Erytrocyter med ionomycin behandling visade en ljus fluorescens signal till bindning av Annexin-V till fosfatidyl serin i den yttre bipacksedeln. Däremot visade celler med ingen behandling en mycket svag fluorescens signal som indikerar mycket låg eryptos. Pre-inkubation i en glukos-fri buffert är en viktig utlösande faktor för induktion av eryptos.Eftersom eryptos observeras i ett brett spektrum av sjukdomar, de experiment som följer detta protokoll är fältspecifika. I vårt labb är vi intresserade av att undersöka erytosens effekter på membranbiofysiska egenskaper och membraninteraktioner med nanomaterial. Eryptos är associerad med ett stort antal sjukdomar inklusive diabetes, sickle cell anemi, och thalassemi.Att ha ett reproducerbart protokoll för att inducera erytos kan hjälpa forskare inom något av dessa områden att undersöka ytterligare vetenskapliga frågor som är specifika för varje område.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyser av mitokondrie kalcium tillströmningen i isolerade mitokondrier och odlade celler

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In vivo kalcium avbildning i C. elegans kropps vägg muskler

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Översätta ribosom affinitetsrening (fälla) för RNA-isolering från endotelceller in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindande enheter (SUBEs) som verktyg för berikning, isolering, identifiering och karakterisering av SUMO Proteome i lever cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ultrahög hastighet Western Blot med hjälp av immunoreaction förbättra teknik

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Snabb bestämning av antikropp-antigen affinitet genom Mass Photometry

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Inre mitokondriell membrankänslighet för Na + avslöjar delvis segmenterade funktionella Q-pooler

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

En halvautomatiserad och reproducerbar biologisk baserad metod för att kvantifiera kalciumdeposition in vitro

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

En "dual-addition" kalciumfluorescensanalys för screening med hög genomströmning av rekombinanta G-proteinkopplade receptorer

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...