Name: induction of eryptosis in red blood cells using a calcium ionophore
Uploaded: 2020-01-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore at JoVE.com

Bu çalışma NIH hibe R15ES030140 ve NSF hibe CBET1903568 tarafından desteklenmiştir. Russ Mühendislik ve Teknoloji Koleji ve Ohio Üniversitesi Kimya ve Biyomoleküler Mühendislik Bölümü'nden de finansal destek kabul edilmektedir.

Aşağıda açıklanan protokolde kullanılan tüm insan kanı örnekleri tanımlanmamış numuneler olarak satın alınmıştır. Hiçbir insan denek doğrudan dahil edildi veya bu çalışma için işe. Helsinki Bildirgesi'nin yönergeleri, araştırma insan denekleri kapsadığında kullanılmalıdır.
1. Tam kandan eritrosit izolasyonu
<ol><li>Bir mikrosantrifüj tüpüne asit sitrat dekstrozuna (ACD) (4 °C'de depolanır) 500 μL'lik tam kan ekleyin. NOT: Tam kan ACD olarak satın al...

<ol>
	<li>Bratosin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Cell+Death+in+Mature+Erythrocytes:+A+Model+for+Investigating+Death+Effector+Pathways+Operating+in+the+Absence+of+Mitochondria.">Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 8 (12), 1143-1156 (2001).</li><li>Lang, E., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Pathophysiological+Significance+of+Eryptosis,+the+Suicidal+Erythrocyte+Death.">Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).</li><li>Garnier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+Deformability+in+Diabetes+and+Erythrocyte+Membrane+Lipid+Composition.">Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition.</a> Metabolism. 39 (8), 794-798 (1990).</li><li>Verkleij, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Asymmetric+Distribution+of+Phospholipids+in+the+Human+Red+Cell+Membrane.+A+Combined+Study+Using+Phospholipases+and+Freeze-Etch+Electron+Microscopy.">The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323 (2), 178-193 (1973).</li><li>de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Macrophages+and+Red+Blood+Cells;+A+Complex+Love+Story.">Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story.</a> Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).</li><li>Fadok, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Receptor+for+Phosphatidylserine-Specific+Clearance+of+Apoptotic+Cells.">A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells.</a> Nature. 405 (6782), 85-90 (2000).</li><li>Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phosphatidylserine+Receptor:+A+Crucial+Molecular+Switch.">The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (8), 627-633 (2001).</li><li>Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Insights+into+the+Mechanism+for+Clearance+of+Apoptotic+Cells.">New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells.</a> BioEssays. 22 (10), 878-881 (2000).</li><li>Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis+in+Hereditary+Spherocytosis+and+Thalassemia:+Role+of+Glycoconjugates.">Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates.</a> Glycoconjugate Journal. 27 (9), 717-722 (2010).</li><li>Kuypers, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Altered+Membrane+Phospholipid+Asymmetry+in+Subpopulations+of+Human+Red+Blood+Cells+Using+Fluorescently+Labeled+Annexin+V.">Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V.</a> Blood. 87 (3), 1179-1197 (1996).</li><li>Lang, F., Lang, E., Fller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+Pathophysiology+of+Eryptosis.">Physiology and Pathophysiology of Eryptosis.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 308-314 (2012).</li><li>Wr&#243;bel, A., Bobrowska-H&#228;gerstrand, M., Lindqvist, C., H&#228;gerstrand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Membrane+Phospholipid+Scrambling+in+Human+Erythrocytes+and+K562+Cells+with+FM1-43+-+a+Comparison+with+Annexin+V-FITC.">Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 - a Comparison with Annexin V-FITC.</a> Cellular and Molecular Biology Letters. 19 (2), 262-276 (2014).</li><li>Mohandas, N., Gallagher, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+Cell+Membrane:+Past,+Present,+and+Future.">Red Cell Membrane: Past, Present, and Future.</a> Blood. 112 (10), 3939-3948 (2008).</li><li>Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminophospholipid+Translocase+and+Phospholipid+Scramblase+Activities+in+Sickle+Erythrocyte+Subpopulations.">Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations.</a> British Journal of Haematology. 146 (4), 447-455 (2009).</li><li>Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Review+on+Eryptosis.">A Comprehensive Review on Eryptosis.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 39 (5), 1977-2000 (2016).</li><li>Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-Dependent+Phospholipid+Scrambling+by+TMEM16F.">Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F.</a> Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).</li><li>Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Suicidal+Erythrocyte+Death+by+Volasertib.">Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (4), 1472-1486 (2017).</li><li>Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Phospholipid+Organization+in+Calcium-Loaded+Human+Erythrocytes.">Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 902 (2), 253-262 (1987).</li><li>Alzoubi, K., Calabr&#242;, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+of+Programmed+Erythrocyte+Death+by+Alantolactone.">Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone.</a> Toxins (Basel). 6 (12), 3596-3612 (2014).</li><li>Jacobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+Erythrocyte+Cell+Membrane+Scrambling+by+Mitotane.">Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 4 (33), 1516-1526 (2014).</li><li>Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractoriness+of+Eryptotic+Red+Blood+Cells+to+Plasmodium+Falciparum+Infection:+A+Putative+Host+Defense+Mechanism+Limiting+Parasitaemia.">Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia.</a> PLoS One. 6 (10), e26575 (2011).</li><li>Borst, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Adhesion+of+Eryptotic+Erythrocytes+to+Endothelial+Cells+via+CXCL16/SR-PSOX.">Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (4), C644-C651 (2011).</li><li>Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Phosphatidylserine-Specific+Peptide-Conjugated+Liposomes+Using+a+Model+System+of+Malaria-Infected+Erythrocytes.">Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38 (10), 1649-1651 (2015).</li><li>Mahmud, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suicidal+Erythrocyte+Death,+Eryptosis,+as+a+Novel+Mechanism+in+Heart+Failure-Associated+Anaemia.">Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia.</a> Cardiovascular Research. 98 (1), 37-46 (2013).</li><li>Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+Eryptosis,+the+Suicidal+Erythrocyte+Death+by+Piceatannol.">Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (6), 2300-2310 (2016).</li><li>Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrambling+of+Phospholipids+Activates+Red+Cell+Membrane+Cholesterol.">Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol.</a> Biochemistry. 46 (8), 2233-2238 (2007).</li><li>Lang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis,+a+Window+to+Systemic+Disease.">Eryptosis, a Window to Systemic Disease.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 22 (6), 373-380 (2008).</li><li>Gil-Parrado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionomycin-Activated+Calpain+Triggers+Apoptosis.+A+Probable+Role+for+Bcl-2+Family+Members.">Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27217-27226 (2002).</li><li>Liu, C. M., Hermann, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ionomycin+as+a+Calcium+Ionophore.">Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore.</a> Journal of Biological Chemistry. 253 (17), 5892-5894 (1978).</li><li>Klarl, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Kinase+C+Mediates+Erythrocyte+"Programmed+Cell+Death"+Following+Glucose+Depletion.">Protein Kinase C Mediates Erythrocyte "Programmed Cell Death" Following Glucose Depletion.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290 (1), C244-C253 (2006).</li><li>Danilov, Y. N., Cohen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Germ+Agglutinin+but+Not+Concanavalin+A+Modulates+Protein+Kinase+C-Mediated+Phosphorylation+of+Red+Cell+Skeletal+Proteins.">Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins.</a> FEBS Letters. 257 (2), 431-434 (1989).</li><li>Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Outer+Leaflet+Is+the+Primary+Regulator+of+Membrane+Damage+Induced+by+Silica+Nanoparticles+in+Vesicles+and+Erythrocytes.">Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes.</a> Environmental Science Nano. 6 (4), 1219-1232 (2019).</li><li>Jaroszeski, M. J., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow Cytometry Protocols. , (2003).</li><li>Ghashghaeinia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Erythrocyte+Age+on+Eryptosis.">The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis.</a> British Journal of Haematology. 157 (5), 1365 (2012).</li><li>Repsold, L., Joubert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis:+An+Erythrocyte's+Suicidal+Type+of+Cell+Death.">Eryptosis: An Erythrocyte's Suicidal Type of Cell Death.</a> Biomed Research International. 2018 (5), 9405617 (2018).</li><li>Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+Binding+Properties+of+Human+Placental+Anticoagulant+Protein-I,+a+Member+of+the+Lipocortin+Family.">Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 7944-7949 (1989).</li><li>Andree, H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Vascular+Anticoagulant+&#945;+(VAC&#945;)+to+Planar+Phospholipid+Bilayers.">Binding of Vascular Anticoagulant &#945; (VAC&#945;) to Planar Phospholipid Bilayers.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (9), 4923-4928 (1990).</li><li>Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+Affinity+and+Cooperativity+of+Annexin+V-Membrane+Binding+under+Conditions+of+Low+Membrane+Occupancy.">Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy.</a> Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).</li><li>Jiang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eryptosis+as+an+Underlying+Mechanism+in+Systemic+Lupus+Erythematosus-Related+Anemia.">Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).</li><li>Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+and+Platelet+Proteomics+in+Hematological+Disorders.">Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).</li></ol>

Bu işlemin amacı, iyonofor konsantrasyonu, tedavi süresi ve eripozun başarılı indüksiyonunu sağlamada önemli faktörler olan hücre dışı glukoz konsantrasyonu için en uygun değerleri sağlamaktır. Protokoldeki kritik bir adım, önemine rağmen literatürde yeterince vurgulanamayan hücre dışı glikozun tükenmesidir. Normal Ringer çözeltisindeki şeker içeriği (5 mM) eritmetoz üzerinde önleyici etkiye sahiptir. Hücre dışı ortamda glikoz tükenmesi hücresel strese neden olur ve protein kiziaz ...

Eritrositlerde programlanmış hücre ölümü, eritoz olarak da bilinir, birçok klinik durum ve hematolojik bozukluklarda yaygındır. Eritoz hücre büzülmesi ve hücre plazma zarında fosfolipid asimetri kaybı ile ilişkilidir1,2. Asimetri kaybı fosfatidilserin translokasyonu sonuçları (PS), normalde iç broşür lokalize bir lipid3,4, hücre dış broşür, hangi fagositoz makrofajlar sinyalleri ve kusurlu eritrositkaldırmak5,6,7,8. Eritrositlerin normal ömrü sonunda eritofotik hücrelerin makrofajlar tarafından uzaklaştırılması dolaşımdaki eritrositlerin dengesini sağlar. Ancak, hastalıklı koşullarda, orak hücre hastalığı ve talasemi gibi9,10,11, gelişmiş eriptoz ciddi anemi neden olabilir2. Hematolojik hastalıklardaki önemi nden dolayı, eritpoza neden olan veya inhibe eden faktörlerin ve bu sürecin altında yatan moleküler mekanizmaların incelenmesinde önemli bir ilgi vardır.
Sağlıklı eritrositlerin plazma membranı asimetriktir ve dış ve iç broşürlerde farklı fosfolipidler lokalize dir. Membran asimetrisi öncelikle membran enzimlerinin etkisi ile düzenlenir. Aminofosfolipid translocase aminofosfolipidlerin taşınmasını kolaylaştırır, PS ve fosfatidylethanolamine (PE), hücre iç broşür bu lipidler yönlendirerek. Öte yandan, floppase fosfolipidler içeren kolin taşır, fosfatidilkolin (PC) ve sfingomyelin (SM), hücre zarının iç gelen12. Ancak, sağlıklı hücrelerin aksine, eritrositler membran karıştırılır. Bu aminofosfolipidlerin çift yönlü taşıma kolaylaştırarak fosfolipid asimetri sayarıya üçüncü bir enzim, scramblaz, eylem kaynaklanmaktadır13,14,15,16. Scramblase Ca2 +yüksek hücre içi seviyeleri ile aktive edilir. Bu nedenle, kalsiyum iyonoforlar, hangi hücre zarı arasında Ca2 + taşımakolaylaştırmak12,eritrosit etkili indükleyiciler vardır.
Bir kalsiyum ionofor, ionomisin, yaygın eritrositlerde eritrosit12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26eritrosoz neden olmak için kullanılmıştır . İonomisin bağlamak ve Ca2 + iyon yakalamak için gerekli olan hidrofilik ve hidrofobik gruplar vardır, ve sitosolik alana taşıma27,28,29. Bu, PS'nin dış broşüre bağlanması ve scramblazın aktivasyonuna yol açar, bu da PS12'yeyüksek bir yakınlığı olan hücresel protein olan annexin-V kullanılarak kolayca tespit edilebilir. İyomit ile eritotazın tetiklediği yaygın olarak rapor edilse de literatürde önemli yöntem tutarsızlığı bulunmaktadır(Tablo 1). Eritotsitlerin popülasyonu iyonofor konsantrasyonu, iyonofor ile tedavi süresi ve hücre dışı ortamın şeker içeriği (glikoz tükenmesi katyon kanallarını aktive eder ve Ca2+'nın sitosolik alana girişini kolaylaştırır)30,31gibi farklı faktörlere bağlıdır. Ancak literatürde bu faktörlerde çok az tutarlılık vardır, bu da eritotozun tekrartekrar in vitroolarak gerçekleştirilmesi zorhale getirmektedir.
Bu protokolde, insan eritrositlerinde eritoza neden olmak için adım adım bir prosedür sayılacağız. Glukoz tükenmiş tamponda Ca2+ konsantrasyonu, iyonofor konsantrasyonu, tedavi süresi ve pre-kuluçka gibi başarılı eritotzu etkileyen faktörler incelenir ve optimal değerler bildirilmiştir. Bu prosedür, glukoz içermeyen bir tamponda eritrositlerin pre-inkübasyon önemli ölçüde glukoz içeren tampon ile karşılaştırıldığında eritoz yüzdesini artırdığını göstermektedir. Bu protokol çeşitli uygulamalar için eritrosit eritrosit üretmek için laboratuvarda kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A10788</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>643177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M7157</td>
			<td>Model Eppendorf 5415C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Zeiss, LSM Tek Thornwood</td>
			<td></td>
			<td>Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses circles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable round bottom flow cytometry tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRU47729-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer (1 M)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7290</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>EMD Milipore Corp.</td>
			<td>407952-1MG</td>
			<td>Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plain glass microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HFM microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole blood in ACD</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4 &#176;C and warm to 37 &#176;C prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of eryptosis in red blood cells using a calcium ionophore

Eritrosit programlı hücre ölümü olan eritoz, bir dizi hematolojik hastalıkta ve eritrositlerin yaralanması sırasında ortaya çıkar. Eritoretik hücrelerin ayırt edici özelliği hücre zarının bileşimsel asimetri kaybıdır, membran dış broşürfosfatidilserine translokasyon yol. Bu süreç Ca2 artanhücre içi konsantrasyonu tarafından tetiklenir + hangi scramblase aktive, membran broşürler arasında fosfolipidlerin çift yönlü hareketini kolaylaştıran bir enzim. Çeşitli hastalıklı koşullarda eritozun önemi göz önüne alındığında, in vitroeritoz unneden çalışmalar yapılmıştır. Bu tür çabalar genellikle kalsiyum iyonofor dayanıyordu, ionomisin, hücre içi Cageliştirmek için 2 + konsantrasyonu ve eritotsis indüklemek. Ancak literatürde iyonomisin kullanılarak eritotoz unneden işlem le ilgili birçok tutarsızlık bildirilmiştir. Burada, insan eritrositlerinde iyonomisin kaynaklı eritoz için adım adım protokol bildiriyoruz. İonofor konsantrasyonu, kuluçka süresi ve glikoz tükenmesi gibi prosedürdeki önemli adımlara odaklanır ve temsili sonuç sağlarız. Bu protokol laboratuvarda tekrartekrar eritotis indüklemek için kullanılabilir.

İonomisin konsantrasyonunun optimizasyonu
İzomisin eritotaz neden olmak için gerekli iken, artan iyonomisin konsantrasyonları hemoliz yol açabilir (eritrositlerin lysis ve hemoglobin salınımı), kaçınılması gereken. 2 saat için Ringer çözeltisinde 1 μM iyonomisin ile eritrositlerin tedavisi, annexin-V Alexa Un 488 eşleç ve FACS analizi ile nicelleştirme ile başarılı etiketleme ile kanıtland...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore at JoVE.com

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

Eritrositlerde eritrositlerde programlanmış hücre ölümü, kalsiyum iyonofor, iyonomisin kullanılarak programlanmış hücre ölümü için bir protokol sağlanır. Başarılı eritoz membran dış broşüründe lokalizasyon fosfatidilseriniz izleyerek değerlendirilir. Protokolün başarısını etkileyen faktörler incelenmiş ve en uygun koşullar sağlanmıştır.

Kalsiyum İyonofor Kullanarak Kırmızı Kan Hücrelerinde Eritotoz İndüksiyonu

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...

İonomisin kullanarak eritoz adüklemek için birçok çaba olmuştur. Ancak, bu sürecin kesin prosedürü literatürde açıkça belirtilen değildir. Biz iyonomisin kullanarak eritoz neden bir adım-adım prosedür sağlar.Bu işlemin en büyük avantajı güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde insan eritrositlerinde eritoz neden olmaktır. Başlamak için, bir mikrosantrifüj tüp asit sitrat dekstroz soğuk tam kan 500 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 700 kez g tüm kan santrifüj ve kırmızı eritrosit tabakası bırakmak için bir pipet kullanarak açık plazma ve ince buffy ceket çıkarın.125 milimolar sodyum klorür, beş milimolar potasyum klorür, bir milimolar magnezyum sülfat, 32 milimolar HEPES, beş milimolar glikoz ve bir milimolar kalsiyum klorür içeren bir litre Ringer çözeltisi hazırlayın. Bir molar sodyum hidroksit iki mikrolitre damla ekleyerek 7.4 için pH ayarlayın. Glikozsuz Ringer çözeltisi hazırlamak için aynı protokolü uygulayın, ancak çözeltiye glikoz eklemeyin.Ringer çözeltisinde eritrositleri iki kez yıkayın hücre peletini 1,5 mililitre Ringer çözeltisinde askıya alarak, 700 kez g'de oda sıcaklığında beş dakika santrifüj edin ve süpernatantı çıkartın. Daha sonra 10 mililitrelik son bir hacme ulaşmak için 9, 960 mikrolitre glikozsuz Ringer çözeltisi içinde 40 mikrolitre eritrosit peletini yeniden sulayarak %0.4 hematokrit yapın. Hücre süspansiyonuna 7 gün boyunca 37 derecede kuluçkaya yat.Glikozsuz bir tamponda eritrositlerin kuluçka öncesi olması eritozisi önemli ölçüde tetikler. Şekersiz tamponda yedi gün önceden kuluçkadan sonra yüksek eritofoz elde edildi. İki milimolar son konsantrasyonulaşmak için DMSO 630 mikrolitre iyonomisin kalsiyum tuzu bir miligram çözün.Aliquot 20 mililitre ve eksi 20 santigrat derece de saklayın. Hazırlanan 0.4% hematokrit bir mililitre alın ve bir mikromolar son konsantrasyonulaşmak için iki milimolar ionomisin 0.5 mikrolitre ekleyin. 37 derecede iki saat kuluçkaya yat.Negatif kontrol olarak hiçbir iyonomisin tedavisi ile hematokrit bir mililitre kullanın. Horomisin tedavi ve tedavi edilmemiş hematocrits oda sıcaklığında beş dakika boyunca 700 kez g santrifüj ve tüplerin altındaki hücre pelet bırakmak için onların supernatants kaldırın. Hücreleri Ringer çözeltisi ile üç kez yıkayın hücre peletlerini 1,5 mililitre Ringer çözeltisinde askıya alarak, 700 kez g'de oda sıcaklığında beş dakika santrifüj ederek ve süpernatantları atarak.Hemolizi ölçmek için, bir mikrosantrifüj tüpüne bir mililitre işlenmemiş 0.4%hematokrit ekleyin ve %0 hemoliz negatif kontrolü olarak 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. %100 hemoliz pozitif kontrol hazırlamak için, bir mikrocentrifuge tüp ve santrifüj 700 kez g oda sıcaklığında beş dakika için tedavi edilmemiş% 0.4 hematokrit bir mililitre ekleyin. Supernatant çıkarın ve 37 santigrat derece iki saat boyunca yeniden askıya almak ve kuluçka hücre pelet distile su bir mililitre ekleyin.Sonra, bir mikrosantrifüj tüp için tedavi iyonomisin bir mililitre ekleyin 0.4% hematokrit. Tedavi edilmeyen hücreleri, tedavi edilen hücreleri ve damıtılmış sudaki hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 700 kez g.'de santrifüj edin. 96 kuyuluk bir plakanın her kuyuya 200 mikrolitre süpernatant aktarın.Mikro plaka okuyucu kullanarak emiciliği 541 nanometre de ölçün. A0, A100 ve AT'nin ringer çözeltisindeki eritrositlerin suda absorbe edilmesi ve tedavi edilen ertikrositlerin iyonomisin ile absorbe edilmesi denklemini kullanarak hemolizi hesaplayın. 1X bağlama tamponu elde etmek için pBS sekiz mililitre 5X Annexin-V bağlama tampon seyreltmek.1X bağlama tamponunun bir mililitresinde iyonomisin ile tedavi edilen ve işlenmemiş hücre peletlerini yeniden askıya alın. Bağlayıcı tampon hücre süspansiyonları 235 mikrolitre alın ve bir mikrosantrifüj tüp ek15 mikrolitre Annexin-V Alexa Fluor 488 conjugate ekleyin. Hücreleri karanlık bir yerde 20 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 700 kez g santrifüj. Supernatant çıkarın. Hücre peletini 1,5 mililitre bağlayıcı arabellekte askıya alarak hücreleri 1X bağlama tamponuyla iki kez yıkayın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 700 kez g'de santrifüj edin.Akış sitometrisi ölçümü için 1X bağlama tamponunun 250 mikrolitresinde süpernatantı çıkarın ve hücre peletlerini yeniden askıya alın. Şimdi 200 mikrolitre Annexin-V lekeli eritrositleri akış sitometrisi ile uyumlu bir mililitre yuvarlak alt polistiren tüplere aktarın. Akış sitometri yazılımına giriş yapın ve yeni deneme düğmesine tıklayın.Yeni tüp düğmesine tıklayın. Küresel sayfayı seçin ve floresan yoğunluğunu 488 nanometre uyarma dalga boyu ve 530 nanometre emisyon dalga boyu ile ölçmek için uygulama analizini seçin. Floresan aktif hücre sıralama analizi için toplanacak hücre sayısını 20,000 olarak ayarlayın.İstenilen tüpü seçin ve yük düğmesine tıklayın. İleri dağılım ve yan dağılım ölçümü için kayıt düğmesine tıklayın. Tüm numuneler için tekrarlayın.Numune düğmesine sağ tıklayın ve sonuç dosyasını oluşturmak için toplu iş analizi uygula'ya tıklayın. Örnek düğmesine sağ tıklayın ve FSC dosyaları oluştur'a tıklayın. Bu protokolde, bir mikromolar iyonomisin ve Ringer çözeltisi ile eritrositlerin iki saat süreyle tedavisi, Annexin-V Fluor 488 ile başarılı etiketleme ve FACS analizi ile nicelleştirme ile kanıtlanan eritoza neden olmak için yeterli ydi.5 ve 10 mikromolar ionomisin yüksek konsantrasyonlarda eritoz hafif bir artış ile sonuçlandı. Ancak, bu konsantrasyonlar da hemoliz gelişmiş. İonomisin ve Ringer çözeltisinde eritrositlerin 30 dakika gibi kısa bir sürede inkübasyon eritoza neden olması yeterliydi.Artan kuluçka süresi iki saate kadar eritrosit seviyesini artırdı. Ancak, daha fazla kuluçka süresi eritrosit düzeyinde hafif bir azalmaya neden oldu. 180 dakika sonra hemoliz yüksek değeri iyonomisin ile tedavi 180 dakika sonra daha az canlı hücreler var olarak kuluçka aynı miktarda sonra eritoz azalma açıklar.İonomisin tedavisi yapılan eritrositler, Annexin-V'nin dış broşürdeki fosfatidil serine bağlanmasıiçin parlak floresan sinyali gösterdi. Buna karşılık, tedavisi olmayan hücreler çok düşük eritme olduğunu gösteren çok zayıf floresan sinyali gösterdiler. Glikozsuz bir tamponda kuluçka öncesi eritmetozin indüksiyonu için önemli bir tetikleyicidir.Eritrosit çok çeşitli hastalıklarda görüldüğünden, bu protokolü takip eden deneyler alana özgüdür. Laboratuvarımızda, eritrositin membran biyofiziksel özellikleri ve nanomalzemelerle membran etkileşimleri üzerindeki etkilerini incelemek istiyoruz. Eritrosit diyabet, orak hücreli anemi ve talasemi gibi hastalıkların çok sayıda ile ilişkilidir.Eritoz unneden tekrarlanabilir bir protokole sahip olmak, bu alanlardaki araştırmacıların her alana özgü daha fazla bilimsel soruyu araştırmalarına yardımcı olabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Endotel hücrelerinden RNA yalıtım için Ribosome affinity arıtma (TRAP) çevirisi In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Karaciğer Kanserinde SUMO Proteomunun Zenginleştirilmesi, İzolasyon, Tanımlama ve Karakterizasyonu Için Araçlar Olarak SUMO Bağlayıcı Varlıklar (SUBEs)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

İmmünreaksiyon Arttırıcı Teknoloji Kullanan Ultra Yüksek Hızlı Batı Blot

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Kitle Fotometrisi ile Antikor-Antijen Affinitesinin Hızlı Tayini

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

İç Mitokondriyal Membranın Na+' ya Duyarlılığı Kısmen Segmente Edilmiş Fonksiyonel CoQ Havuzlarını Ortaya Çıkarır

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

In Vitro Kalsiyum Birikimini Ölçmek için Yarı Otomatik ve Tekrarlanabilir Biyolojik Tabanlı Bir Yöntem

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...