Name: a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization
Uploaded: 2021-09-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization at JoVE.com

نشكر الأعضاء السابقين في مختبرنا وعالمنا شريف سينتورك على العمل السابق. نشكر دانيلو سيغوفيا على قراءته الناقدة لهذه المخطوطة. كانت هذه الدراسة ممكنة وبدعم من برنامج السباحة في جميع أنحاء أمريكا والمعهد الوطني للسرطان لاكتشاف أهداف السرطان وتطويره.

1.the DD-Cas9 متجه
<ol><li>الحصول على ناقلات DD-Cas9 من أدجين (DD-Cas9 مع تسلسل حشو وفينوس (EDCPV)، بلازميد 90085). ملاحظة: هذا هو العدسي DD-Cas9 plasmid مع المروج U6 الذي يدفع نسخة RNA دليل واحد (sgRNA) في حين أن المروج EFS يدفع النسخ DD-Cas9. تسلسل DYKDDDDK (علامة العلم) موجود في المحطة C من Cas9 تليها 2A الببتيد الذاتي المشقوق (P2A) الذي ي...

<ol>
	<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats+(CRISPRs):+the+hallmark+of+an+ingenious+antiviral+defense+mechanism+in+prokaryotes.">Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes.</a> Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CRISPR-Cas9+genome+engineering:+lessons+learned+from+RNA+interference.">Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference.</a> Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).</li><li>Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Inducible+CRISPR/Cas+Systems.">Drug Inducible CRISPR/Cas Systems.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).</li><li>Wade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Silencing+Using+the+CRISPR-Cas9+System:+A+Review+of+the+Benefits+and+Challenges.">High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).</li><li>Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-switchable+substrates+for+a+ubiquitin-proteasome+system.">Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+efficient+inducible+CRISPR/Cas9+platform+with+improved+specificity+for+multiple+gene+targeting.">An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting.</a> Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).</li><li>Oakes, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+engineering+hotspots+identifies+an+allosteric+CRISPR-Cas9+switch.">Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch.</a> Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+protein+tagging+in+cells+with+split+fluorescent+protein.">Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein.</a> Nature Communications. 7, 11046 (2016).</li><li>Roper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+and+organoid+transplantation+models+of+colorectal+cancer+and+metastasis.">In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis.</a> Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).</li><li>Chu, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+with+FKBP-derived+destabilizing+domains.">Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+control+of+protein+stability+and+function+in+living+mice.">Chemical control of protein stability and function in living mice.</a> Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+reversible,+and+tunable+method+to+regulate+protein+function+in+living+cells+using+synthetic+small+molecules.">A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules.</a> Cell. 126, 995-1004 (2006).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing.">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+CRISPR/Cas9-induced+mutant+screening.">A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening.</a> Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).</li><li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification.">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).</li><li>Senturk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+tunable+method+to+temporally+control+gene+editing+based+on+conditional+Cas9+stabilization.">Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization.</a> Nature Communications. 8, 14370 (2017).</li><li>McJunkin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+suppression+of+an+essential+gene+in+adult+mice+using+transgenic+RNA+interference.">Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).</li><li>Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-triggered+Cas9+protein+with+improved+genome-editing+specificity.">Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity.</a> Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).</li><li>Dow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).</li><li>Wright, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+split-Cas9+enzyme+complex.">Rational design of a split-Cas9 enzyme complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).</li><li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lentiviral+Packaging+Mixes+and+Producer+Cell+Lines+for+RNAi+Applications.">Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications.</a> Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).</li><li>Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Protein+Stabilization+In+Vivo+Mediated+by+Shield-1+in+Transgenic+Medaka.">Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka.</a> PLOS One. , (2015).</li><li>Sellmyer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+context+affects+levels+of+a+chemically+dependent+destabilizing+domain.">Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain.</a> PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).</li><li>Iwamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+chemical+method+to+regulate+protein+stability+in+the+mammalian+central+nervous+system.">A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system.</a> Chemistry &amp; Biology. 17 (9), 981-988 (2010).</li><li>Tai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+domains+mediate+reversible+transgene+expression+in+the+brain.">Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain.</a> PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).</li><li>Auffenberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+and+reversible+inhibition+of+neurons+and+circuits+by+small+molecule+induced+potassium+channel+stabilization.">Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization.</a> Scientific Reports. 6, 19293 (2016).</li></ol>

أحدثت تقنية CRISPR/Cas9 ثورة في قدرة استجواب الجينوم2وظيفيا. ومع ذلك ، فإن تعطيل الجينات غالبا ما يؤدي إلى فتك الخلايا ، والعجز الوظيفي ، والعيوب التنموية ، مما يحد من فائدة هذه النهج لدراسة الوظائف الجينية7. بالإضافة إلى ذلك، التعبير التأسيسي لل Cas9 قد يؤدي إلى سمية وتو...

CRISPR-Cas9 الذي يرمز إلى "تتجمع بانتظام باليندروميك قصيرة يكرر البروتين المرتبطة 9" اكتشفت لأول مرة كجزء من الدراسات على مناعة التكيف البكتيري1،2. اليوم، أصبح CRISPR/Cas9 الأداة الأكثر شهرة لتحرير الجينات القابلة للبرمجة وتم تطوير تكرارات مختلفة للنظام للسماح بالتعديلات النسخية واللاجينية3. هذه التكنولوجيا تمكن التلاعب الجيني دقيقة للغاية من أي تسلسل تقريبا من الحمض النووي4.
المكونات الأساسية لأي تحرير الجينات CRISPR هي تسلسل الحمض النووي الريبي دليل للتخصيص ونوكليا Cas95. يرتبط دليل الحمض النووي الريبي بالتسلسل التكميلي المستهدف في الحمض النووي ، ويوجه نواة Cas9 لأداء كسر مزدوج في نقطة محددة في الجينوم3،4. ثم يتم إصلاح موقع الانقسام الناتج عن طريق الربط النهائي غير المتجانس (NHEJ) أو الإصلاح الموجه بالهومولوجيا (HDR) ، مع إدخال تغييرات لاحقة في تسلسل الحمض النووي المستهدف5.
CRISPR /Cas9 القائم على تحرير الجينات سهلة الاستخدام، وغير مكلفة نسبيا بالمقارنة مع تقنيات تحرير الجينات السابقة، وقد ثبت أن تكون فعالة وقوية على حد سواء في تعدد النظم2،4،5. ومع ذلك، فإن النظام يفرض بعض القيود. التعبير التأسيسي لل Cas9 كثيرا ما تبين أن يؤدي إلى زيادة عدد من خارج الأهداف وارتفاعسميةالخلية 4 ،6،7،8. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاستهداف التأسيسي لجينات البقاء على قيد الحياة الأساسية والخلايا من قبل Cas9 يأخذ من قدرته على إجراء أنواع معينة من الدراسات الوظيفية مثل الدراسات الحركية لوفاة الخلية7.
وقد تم تطوير أدوات مختلفة غير قابلة للانعزال أو تسيطر عليها مشروط CRISPR-Cas9 لمعالجة تلك القضايا6، مثل تيت أون وتيت أوف9؛ إعادة التركيب الخاصة بالموقع10; القرب الناجم كيميائيا11; intein الربط التابعة3; و 4-هيدروكسيتاموكسيفين الإستروجين مستقبلات (ER) القائم على أنظمة التعريب النووي12. بشكل عام ، فإن معظم هذه الإجراءات (الربط intein وأنظمة تقسيم القرب الناجمة كيميائيا) لا توفر تحكما قابلا للعكس ، أو تقدم استجابة حركية بطيئة جدا للعلاج الدوائي (نظام Tet-On / Off) ، أو غير قابلة للتلاعب عالي الإنتاجية6.
ولمعالجة هذه القيود، قمنا بتطوير مجموعة أدوات جديدة لا توفر تحرير الجينات السريع والقوية التي يتم التحكم فيها زمنيا فحسب، بل تضمن أيضا إمكانية التتبع، والقابلية للتتبع، والقدرة على الثبات، والقدرة على التلاعب الجيني عالي الإنتاجية. يمكن استخدام هذه التكنولوجيا الجديدة في خطوط الخلايا ، والأعضاء ، والنماذج الحيوانية. ويستند نظامنا على نطاق هندسي، عندما تنصهر في Cas9، فإنه يحفز تدهورها السريع. ومع ذلك، يمكن استقراره بسرعة مع جزيء صغير انتقائي للغاية، غير سام، نفاذية الخلية. وبشكل أكثر تحديدا، قمنا بهندسة FKBP12 الإنسان متحولة "المجال المزعزع للاستقرار" (DD) إلى Cas9، بمناسبة Cas9 للتدهور السريع والتكويني عن طريق نظام ubiquitin-proteasome عندما أعرب في خلايا الثدييات13. يمكن ليغاند DD الاصطناعية، درع-1 استقرار تشكيل DD، وبالتالي منع تدهور البروتينات تنصهر إلى DD (مثل Cas9) بطريقة فعالة جدا، ومع استجابة الحركيةالسريعة 14،15. من الجدير بالذكر، يربط Shield-1 بثلاثة أوامر من الحجم أكثر إحكاما إلى FKBP12 متحولة من نظيرتها البرية من نوع14.
يمكن استخدام زوج DD-Cas9/Shield-1 لدراسة التحديد المنهجي وتوصيف الجينات الأساسية في الخلايا المستزرعة والنماذج الحيوانية كما أظهرنا سابقا من خلال الاستهداف المشروط لجين CypD ، الذي يلعب دورا مهما في عملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا ؛ EGFR، لاعب رئيسي في التحول أونوجينيك؛ و Tp53، جين مركزي في الاستجابة لتلف الحمض النووي. بالإضافة إلى تحرير الجينات مؤقتا ومشروطا، ميزة أخرى من هذه الطريقة هو أن استقرار DD-Cas9 مستقلة عن النسخ. هذه الميزة تمكن التعبير المشترك، تحت نفس المروج، من علامات يمكن تتبعها، فضلا عن recombinases، مثل recombinase مستقبلات هرمون الاستروجين تعتمد، CREER. في هذا العمل، نظهر كيف يمكن استخدام طريقتنا بنجاح في المختبر، لاستهداف مشروط على سبيل المثال، جين تكرار الحمض النووي، RPA3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100mM DTT</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X FastDigest buffer</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>B64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 Ligation Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorimetric BCA kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, glutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>EF0654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest BsmBI</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>FD0454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag [M2] mouse mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR &#38; Gel Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibodies</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shield-1</td>
			<td>Cheminpharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 competent bacterial cells</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURVEYOR Mutation Detection Kit</td>
			<td>Transgenomic/IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin [DM1A] mouse mAb</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CP06-100UG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization

أصبحت تكنولوجيا تكرار palindromic القصيرة المتجمعة بانتظام (CRISPR-) المرتبطة بالبروتين 9 (CRISPR/Cas9) أداة مختبرية سائدة لإدخال تعديلات دقيقة ومستهدفة في الجينوم. ويعزى شعبيته الهائلة وانتشار سريع إلى سهولة استخدامها ودقة بالمقارنة مع سابقاتها. ومع ذلك، فإن التنشيط التأسيسي للنظام له تطبيقات محدودة. في هذه الورقة، ونحن نصف طريقة جديدة تسمح السيطرة الزمنية للنشاط CRISPR/Cas9 على أساس الاستقرار المشروط للبروتين Cas9. دمج متحولة هندسية من البروتين rapamycin ملزمة FKBP12 إلى Cas9 (DD-Cas9) تمكن من التدهور السريع للكاس9 التي بدورها يمكن أن تستقر من خلال وجود ليغاند الاصطناعية FKBP12 (الدرع-1). على عكس الطرق الأخرى غير القابلة للانتهاك ، يمكن تكييف هذا النظام بسهولة لتوليد أنظمة ثنائية ال سيسترونيك للتعبير المشترك عن DD-Cas9 مع جين آخر من الاهتمام ، دون تنظيم مشروط للجين الثاني. تمكن هذه الطريقة من توليد أنظمة يمكن تتبعها بالإضافة إلى التلاعب المستقل الموازي بال alleles المستهدفة من قبل نواة Cas9. ويمكن استخدام منصة هذه الطريقة لتحديد وتوصيف الجينات الأساسية بشكل منهجي واستجواب التفاعلات الوظيفية للجينات في المختبر وفي البيئات الحية.

لتمكين التعبير المشروط عن Cas9 ، قمنا بتطوير بناء ناقل ثنائي العدسية يتكون من مروج مدفوع ب U6 للتعبير عن sgRNA بشكل تأسيسي ، ومروج أساسي EF-1α لدفع التعبير عن بروتين الاندماج DD-Cas9 (الشكل 1A)19. كنموذج لتوضيح قوة وكفاءة النظام، قمنا بنقل خط الخلية A549 carcino...

Watch this Scientific Journal Video about A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization at JoVE.com

A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization

هنا، ونحن نصف أداة تحرير الجينوم على أساس الاستقرار الزمني والمشروط من تتجمع بانتظام تكرار palindromic قصيرة متباعدة- (CRISPR-) البروتين المرتبطة 9 (Cas9) تحت جزيء صغير، الدرع-1. ويمكن استخدام هذه الطريقة للخلايا المستزرعة والنماذج الحيوانية.

مجموعة أدوات جديدة لتقييم وظائف الجينات باستخدام تثبيت Cas9 الشرطي

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associated protein 9 (CRISPR/Cas9) technology has become a prevalent laboratory ...

توفر هذه الطريقة تحرير الجينات CRISPR-Cas9 بسرعة ودرجة الحرارة تحت جزيء صغير، Shield-1. كما أنه يوفر تأثيرات أقل خارج الهدف ، وانخفاض سمية الخلية ، وكذلك تحرير الجينات أعلى تسيطر عليها داخليا عند مقارنتها تنشيط التأسيسية للكاس9. الميزة الرئيسية لهذا الجسيم هو أنه يمكن استخدامه لتوصيف الجينات الأساسية، فضلا عن جينات البقاء على قيد الحياة الورم.إن زعزعة استقرار DD-Cas9 مستقلة عن تعبيرها ، وهذا يسمح بالتعبير المشترك عن جين الاهتمام تحت نفس المروج. يمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة على في الجسم الحي وفي الدراسات المختبرية. درع-1 يمكن أن تخترق أيضا من خلال حاجز الدم في الدماغ، مما يجعل من السهل أيضا لدراسة الجينات التي تشارك في نمو الدماغ.بالتساوي البذور خلايا صحية HEK293T في كثافة 1-2 مليون خلية لكل 10 سم لوحة زراعة الأنسجة باستخدام 10 ملليلتر من DMEM الجلوكوز مع 10٪ FBS المصفاة. احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الأنسجة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية لمدة 20 ساعة. في اليوم التالي، تأكد من أن الخلايا وصلت إلى 70٪ التقاء عن طريق المجهر برايتفيلد وأنها موزعة بالتساوي عبر لوحة.تغيير الوسائط قبل ساعة واحدة من التحويل مع وحدة تخزين نهائية من 10 ملليلتر. إعداد أنبوبين مع 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام الدافئة. أضف 25 ميكرولتر من كاشف العدوى إلى الأنبوب الأول، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.إلى الأنبوب الآخر، أضف خليطا من البلازميدات. مزيج أنبوب واحد مع أنبوب اثنين لتشكيل خليط transfection، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. إضافة خليط العدوى المنسدلة إلى خلايا HEK293T واحتضان لوحة في حاضنة ثقافة الأنسجة.بعد 18 ساعة، قم بتغيير الوسائط بعناية إلى 10 ملليلترات من DMEM الطازجة مع 10٪ FBS لإزالة كاشف العدوى. احتضان الخلايا لل 48 ساعة القادمة. بعد 48 ساعة، اجمع الناطقة الفائقة بحقنة 10 ملليلتر ومررها عبر فلتر 0.45 ميكرومتر.Aliquot الفيروس العملاق وتخزينه في ناقص 80 درجة مئوية. لتحديد تيتر الفيروس، البذور 5 ملايين خلايا HEK293T لكل بئر في اثنين من لوحات ستة آبار. احتضان كل من لوحات في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها للوصول إلى 50 إلى 60٪ التقاء.في اليوم التالي، استخدم إحدى اللوحات ذات الآبار الستة لحساب الخلايا في الآبار الستة. تذوب aliquot الفيروس التي ستستخدم لأداء التخفيف التسلسلي وإضافة ثمانية ميكروغرام لكل ملليلتر من كاشف البوليبرين، وإعداد DMEM مع 10٪ FBS لتخفيف المسلسل من الفيروس، وإضافة كاشف البوليبرين. إعداد اثنين من ملليلتر من تخفيف المسلسل عشرة أضعاف من الفيروس العدسي من 0.1 إلى 0.0001 في البوليبرين التي تحتوي على وسائل الإعلام.إزالة وسائل الإعلام من لوحة ستة آبار وإضافة ملليلتر واحد من التخفيفات الفيروسية إلى الآبار، وترك بئر واحد مع وسائل الإعلام وحدها كسيطرة سلبية وجيد واحد مع فيروس 100٪. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، قم بإزالة الوسائط المصابة بالفيروس من لوحات الآبار الستة وغيرها إلى ملليلترين من DMEM الطازجة بنسبة 10٪FBS.احتضان الخلايا لمدة 48 إلى 72 ساعة، ومراقبة GFP مع المجهر الفلورسنت كل يوم. بعد 48 إلى 72 ساعة، فصل الخلايا وإعادة إنفاقها في الحد الأقصى العازلة. استخدم مقياس تدفق الخلايا لتحديد النسبة المئوية لتعبير GFP وحساب تاتر الفيروس باستخدام الصيغة المعطاة في مخطوطة النص.لوحة خط الخلية من الفائدة في لوحة 10 سم واحتضان بين عشية وضحاها للوصول إلى التقاء 50 إلى 60٪ثم تصيب الخلايا مع 500 إلى 2، 000 ميكرولتر من جزيئات الفيروس في حجم إجمالي 10 ملليلتر من المتوسطة الثقافة. احتضان وسائل الإعلام الفيروسية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، قم بتغيير الوسائط الفيروسية إلى وسائط الثقافة، وحدد النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ل GFP باستخدام قياس التدفق الخلوي.حدد الخلايا الإيجابية GFP باستخدام BD FACSAria II لفرز الخلايا. توسيع الخلايا المختارة بشكل إيجابي وتجميد المخزون. صفيحة الخلايا المختارة بشكل إيجابي والخلايا غير المنقولة في لوحات 12 بئرا بشكل منفصل ، بعد 24 ساعة من العدوى.انتظر حتى إرفاق الخلايا وتغيير الوسائط إلى وسائط ثقافة الخلية التي تحتوي على 200 nanomolar Shield-1. استبدال الوسائط في لوحات مع الخلايا المنقولة وغير المنقولة، وترك بئرين لكل لوحة مع وسائل الإعلام العادية كعنصر تحكم سلبي. احتضان واستخراج البروتينات من كل بئر في صفر، اثنين، ستة، 12، 24، 48، و 72 ساعة بعد إضافة الدرع-1 إلى الآبار.ثم إزالة وسائل الإعلام مع درع-1 من بقية الآبار وتغييره لوسائل الإعلام الخلية العادية. جمع البروتينات من تلك الآبار في ساعتين وستة و 12 ساعة بعد تغيير وسائل الإعلام. تم تأكيد تحريض بروتين Cas9 من خلال مستويات التعبير التي تكون متشابهة بين الخلايا المنقولة والسيارة ، على الرغم من وجود أو غياب Shield-1.هناك ما يكفي من التعريفي التعبير Cas9 في خط الخلية A549 المنقولة بعد ساعتين من العلاج مع الدرع-1، والتي تصبح ضئيلة في غضون ست إلى 12 ساعة بعد انسحاب الدرع-1. الدرع-1 تعامل الخلايا A549 المنقولة انخفض في العدد بعد 48 ساعة دون التأثير على عينة رينيلا, التي تم التحقق من صحتها عن طريق immunoblotting باستخدام الأجسام المضادة ضد البروتين RPA3 المنضب. تم تأكيد انعكاس تحرير الجينات أو طفرات indel باستخدام مقايسات نواة المساح.كان بناء ناقلات الفيروس العدسي المصمم نظاما للسيتسيترونيك يحمل جينا آخر مهما تحت نفس المروج EF-1a. وأضيف بروتين فلوري معدل، P2A، لتتبع الخلايا المصابة. لوحظ التعبير عن بروتين mVenus في السيارة والخلايا المحولة A549 ، بغض النظر عن تعبير DD-Cas9 وعلاج Shield-1.إن النقل الفعال لخط الخلية مع ناقل DD-Cas9 هو أحد الخطوات المقيدة للمعدل ، لوجود خلايا HEK293T صحية واستخدام عدد المرور المنخفض أمر بالغ الأهمية. التحسين من النسبة بين DD-Cas9 plasmid، التعبئة والتغليف البلازميد، وplasmid المغلف مهم جدا لtransfection الأمثل. ولكن بجانبه ، أيضا كمية الدرع -1 اللازمة لتحقيق الاستقرار في الخلايا المستهدفة DD-Cas9 هو شيء تحتاج إلى توخي الحذر منه.وDD-Cas9 مع كريم البلازميد هو متاح أيضا، ويمكن استخدامه لدراسة التفاعلات الجينية في دراسات في الجسم الحي على أساس نظام كري لوكسي.

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

كتل رسم الخرائط و كريسبر / Cas9 تحرير لتحديد الجينات المقاومة للمخدرات في<em&gt; التوكسوبلازما غونديي</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

منهجية موحدة لدراسة المحدثة للطفرات في الموقع كدالة لإصلاح نقطة تحور تحفزها كريسبر/Cas9 وسودن في الخلايا البشرية

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection كريسبر/Cas9 البروتين في أجنة سمك السلور القناة، Ictalurus punctatus، لتحرير الجينات

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

بروتوكول لإنتاج ناقلات لينتيفيرال إينتيجراسي التي تفتقر لخروج المغلوب كريسبر/Cas9-بوساطة الجينات في تقسيم الخلايا

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

كفاءة الإنتاج وتحديد كريسبر/Cas9-المنشأة الضربة القاضية الجينات في "النظام النموذجي" دانيو rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

استخدام الماوس بويضات لتقييم وظيفة الجينات البشرية أثناء الانقسام الاختزالي أنا

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

السريع وخط أنابيب سهلة "توليد طفرات نقطة الجينوم" في C. ايليجانس باستخدام كريسبر/Cas9 "ريبونوكليوبروتينس"

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

"جعل طفرات مشروطة طفيل الملاريا البشرية" المنجلية "تحرير الجينات" كريسبر/Cas9

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...