Name: a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization
Uploaded: 2021-09-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization at JoVE.com

Vi takker tidligere medlemmer af vores laboratorium og videnskabsmand Serif Senturk for tidligere arbejde. Vi takker Danilo Segovia for kritisk læsning af dette manuskript. Denne undersøgelse var mulig og støttet af Swim Across America og National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center program.

1.DD-Cas9 vektoren
<ol><li>Få DD-Cas9 vektor fra Addgene (DD-Cas9 med fyldstof sekvens og Venus (EDCPV), Plasmid 90085). BEMÆRK: Dette er en lentiviral DD-Cas9 plasmid med en U6 promotor, der driver enkelt guide RNA (sgRNA) transskription, mens EFS promotor drev DD-Cas9 transskription. DYKDDDDK-sekvensen (flag-tag) er til stede ved C-terminalen i Cas9 efterfulgt af 2A selvkløvende peptid (P2A), der adskiller DD-Cas9 og modificeret fluorescerende protein Venus (mVenus).</li>
</ol>2. Lille gui...

<ol>
	<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats+(CRISPRs):+the+hallmark+of+an+ingenious+antiviral+defense+mechanism+in+prokaryotes.">Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes.</a> Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CRISPR-Cas9+genome+engineering:+lessons+learned+from+RNA+interference.">Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference.</a> Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).</li><li>Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Inducible+CRISPR/Cas+Systems.">Drug Inducible CRISPR/Cas Systems.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).</li><li>Wade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Silencing+Using+the+CRISPR-Cas9+System:+A+Review+of+the+Benefits+and+Challenges.">High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).</li><li>Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-switchable+substrates+for+a+ubiquitin-proteasome+system.">Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+efficient+inducible+CRISPR/Cas9+platform+with+improved+specificity+for+multiple+gene+targeting.">An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting.</a> Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).</li><li>Oakes, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+engineering+hotspots+identifies+an+allosteric+CRISPR-Cas9+switch.">Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch.</a> Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+protein+tagging+in+cells+with+split+fluorescent+protein.">Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein.</a> Nature Communications. 7, 11046 (2016).</li><li>Roper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+and+organoid+transplantation+models+of+colorectal+cancer+and+metastasis.">In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis.</a> Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).</li><li>Chu, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+with+FKBP-derived+destabilizing+domains.">Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+control+of+protein+stability+and+function+in+living+mice.">Chemical control of protein stability and function in living mice.</a> Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+reversible,+and+tunable+method+to+regulate+protein+function+in+living+cells+using+synthetic+small+molecules.">A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules.</a> Cell. 126, 995-1004 (2006).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing.">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+CRISPR/Cas9-induced+mutant+screening.">A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening.</a> Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).</li><li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification.">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).</li><li>Senturk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+tunable+method+to+temporally+control+gene+editing+based+on+conditional+Cas9+stabilization.">Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization.</a> Nature Communications. 8, 14370 (2017).</li><li>McJunkin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+suppression+of+an+essential+gene+in+adult+mice+using+transgenic+RNA+interference.">Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).</li><li>Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-triggered+Cas9+protein+with+improved+genome-editing+specificity.">Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity.</a> Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).</li><li>Dow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).</li><li>Wright, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+split-Cas9+enzyme+complex.">Rational design of a split-Cas9 enzyme complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).</li><li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lentiviral+Packaging+Mixes+and+Producer+Cell+Lines+for+RNAi+Applications.">Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications.</a> Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).</li><li>Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Protein+Stabilization+In+Vivo+Mediated+by+Shield-1+in+Transgenic+Medaka.">Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka.</a> PLOS One. , (2015).</li><li>Sellmyer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+context+affects+levels+of+a+chemically+dependent+destabilizing+domain.">Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain.</a> PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).</li><li>Iwamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+chemical+method+to+regulate+protein+stability+in+the+mammalian+central+nervous+system.">A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system.</a> Chemistry &amp; Biology. 17 (9), 981-988 (2010).</li><li>Tai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+domains+mediate+reversible+transgene+expression+in+the+brain.">Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain.</a> PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).</li><li>Auffenberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+and+reversible+inhibition+of+neurons+and+circuits+by+small+molecule+induced+potassium+channel+stabilization.">Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization.</a> Scientific Reports. 6, 19293 (2016).</li></ol>

CRISPR/Cas9-teknologien har revolutioneret evnen til funktionelt at afhøre genomer2. Inaktivering af gener resulterer imidlertid ofte i celledødelighed, funktionelle underskud og udviklingsdefekter, hvilket begrænser nytten af sådanne tilgange til undersøgelse af genfunktioner7. Desuden kan det konstituerende udtryk for Cas9 resultere i toksicitet og generering af virkninger uden for målet6. Der er udviklet forskellige tilgange til tidsmæssig ...

CRISPR-Cas9, som står for "grupperet regelmæssigt interspaced kort palindromisk gentager-associeret protein 9" blev først opdaget som en del af undersøgelser af bakteriel adaptiv immunitet1,2. I dag er CRISPR/Cas9 blevet det mest anerkendte værktøj til programmerbar genredigering, og der er udviklet forskellige gentagelser af systemet for at muliggøre transskriptionelle og epigenetiske modulationer3. Denne teknologi muliggør den meget præcise genmanipulation af næsten enhver sekvens af DNA4.
De væsentlige komponenter i enhver CRISPR-genredigering er en tilpasselig guide RNA-sekvens og Cas9-kerne5. RNA-føringen binder sig til den mål komplementære sekvens i DNA'et og leder Cas9-kernen til at udføre en dobbeltstrengsbrud på et bestemt punkt i genomet3,4. Det resulterende kavalergangssted repareres derefter af ikke-homolog end-join (NHEJ) eller homologi-rettet reparation (HDR) med den deraf følgende indførelse af ændringer i den målrettede DNA-sekvens5.
CRISPR/Cas9-baseret genredigering er nem at bruge og relativt billig sammenlignet med tidligere genredigeringsteknikker , og det har vist sig at være både effektivt og robust i en mangfoldighed af systemer2,4,5. Alligevel indeholder systemet nogle begrænsninger. Det konstituerende udtryk for Cas9 har ofte vist sig at resultere i et øget antal off-targets og højcelletoksicitet 4,6,7,8. Derudover tager cas9's konstituerende målretning af essentielle og celleoverlevelsesgener væk fra dets evne til at udføre visse typer funktionelle undersøgelser såsom kinetiske undersøgelser af celledød7.
Der er udviklet forskellige induktions- eller betinget kontrollerede CRISPR-Cas9-værktøjer til løsning af disse spørgsmål6, såsom Tet-ON og Tet-Off9; lokalitetsspecifik rekombination10; kemisk induceret nærhed11; inteinafhængig splejsning3; og 4-Hydroxytamoxifen Østrogen Receptor (ER) baserede nukleare lokaliseringssystemer12. Generelt giver de fleste af disse procedurer (intein splejsning og kemisk inducerede nærhedssplitsystemer) ikke reversibel kontrol, udgør en meget langsom kinetisk reaktion på narkotikabehandling (Tet-On/Off-system) eller kan ikke aktiveres til manipulation med høj gennemstrømning6.
For at løse disse begrænsninger udviklede vi et nyt værktøjssæt, der ikke kun giver hurtig og robust tidsstyret genredigering, men også sikrer sporbarhed, tunabilitet og imødekommelse til høj gennemløbsgenmanipulation. Denne nye teknologi kan bruges i cellelinjer, organoider og dyremodeller. Vores system er baseret på et manipuleret domæne, når det smeltes sammen til Cas9, det fremkalder en hurtig nedbrydning. Det kan dog hurtigt stabiliseres med et meget selektivt, ikke-giftigt, celletrængeligt lille molekyle. Mere specifikt, vi manipuleret den menneskelige FKBP12 mutant "destabiliserende domæne" (DD) til Cas9, mærkning Cas9 for hurtig og konstituerende nedbrydning via ubiquitin-proteasome system, når udtrykt i pattedyr celler13. DD syntetisk ligand, Shield-1 kan stabilisere DD kropsbygning, og dermed forhindre nedbrydning af proteiner smeltet til DD (såsom Cas9) på en meget effektiv måde, og med en hurtig kinetiskreaktion 14,15. Bemærk, Shield-1 binder med tre størrelsesordener strammere til mutant FKBP12 end til sin vilde type modstykke14.
DD-Cas9/Shield-1-parret kan bruges til at studere systematisk identifikation og karakterisering af essentielle gener i dyrkede celler og dyremodeller, som vi tidligere har vist ved betinget at målrette CypD-genet, som spiller en vigtig rolle i metabolismen af mitokondrier; EGFR, en nøglespiller i onkogen transformation; og Tp53, et centralt gen i DNA-skaderespons. Ud over tidsmæssigt og betinget kontrolleret genredigering er en anden fordel ved metoden, at stabiliseringen af DD-Cas9 er uafhængig af transskriptionen. Denne funktion gør det muligt co-udtryk, under samme promotor, af sporbare markører samt rekombinisser, såsom østrogen receptor-afhængige rekombininase, CREER. I dette arbejde viser vi, hvordan vores metode med succes kan bruges in vitro, til betinget mål for eksempel DNA-replikationsgen, RPA3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100mM DTT</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X FastDigest buffer</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>B64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 Ligation Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorimetric BCA kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, glutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>EF0654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest BsmBI</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>FD0454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag [M2] mouse mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR &#38; Gel Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibodies</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shield-1</td>
			<td>Cheminpharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 competent bacterial cells</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURVEYOR Mutation Detection Kit</td>
			<td>Transgenomic/IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin [DM1A] mouse mAb</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CP06-100UG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization

Den regelmæssigt sammenkoblede kort palindromiske repeat- (CRISPR-) tilknyttede protein 9 -teknologi (CRISPR/Cas9) er blevet et udbredt laboratorieværktøj til at indføre nøjagtige og målrettede modifikationer i genomet. Dens enorme popularitet og hurtige spredning tilskrives dens nemme brug og nøjagtighed sammenlignet med sine forgængere. Men den konstituerende aktivering af systemet har begrænsede anvendelser. I dette papir beskriver vi en ny metode, der giver tidsmæssig kontrol af CRISPR/Cas9-aktivitet baseret på betinget stabilisering af Cas9-proteinet. Fusing en manipuleret mutant af rapamycin-bindende protein FKBP12 til Cas9 (DD-Cas9) gør det muligt hurtigt nedbrydning af Cas9, som igen kan stabiliseres ved tilstedeværelsen af en FKBP12 syntetisk ligand (Shield-1). I modsætning til andre inducible metoder kan dette system let tilpasses til at generere bi-cistronic-systemer til at udtrykke DD-Cas9 med et andet gen af interesse uden betinget regulering af det andet gen. Denne metode gør det muligt at generation af sporbare systemer samt parallel, uafhængig manipulation af alleler målrettet af Cas9 nuklease. Platformen for denne metode kan bruges til systematisk identifikation og karakterisering af essentielle gener og forhør af de funktionelle interaktioner mellem gener i in vitro- og in vivo-indstillinger.

For at gøre det muligt for det betingede udtryk for Cas9 udviklede vi en dobbelt lentiviral vektorkonstruktion bestående af en U6-drevet promotor til at udgøre ekspressivt sgRNA og en EF-1α kernepromotor til at drive udtrykket af DD-Cas9 fusionsprotein (Figur 1A)19. Som et paradigme til at illustrere systemets robusthed og effektivitet transducerede vi lungekarcinomatøsE A549-cellelinje med lentiviral konstruktionen. Niveauerne af...

Watch this Scientific Journal Video about A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization at JoVE.com

A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization

Her beskriver vi et genomredigeringsværktøj baseret på den tidsmæssige og betingede stabilisering af grupperet regelmæssigt interspaced kort palindromisk repeat- (CRISPR-) associeret protein 9 (Cas9) under det lille molekyle, Shield-1. Metoden kan bruges til dyrkede celler og dyremodeller.

Et nyt værktøjssæt til evaluering af genfunktioner ved hjælp af betinget Cas9-stabilisering

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associated protein 9 (CRISPR/Cas9) technology has become a prevalent laboratory ...

Denne metode giver hurtig, temperaturstyret CRISPR-Cas9 genredigering under et lille molekyle, Shield-1. Det giver også mindre off-target effekter, lavere celletoksicitet, og også højere internt kontrolleret genredigering, når man sammenligner det med konstituerende aktivering af Cas9. Den største fordel ved denne partikel er, at den kan bruges til karakterisering af essentielle gener samt tumoroverlevelsesgener.Destabilisering af DD-Cas9 er uafhængig af dets udtryk, og dette gør det muligt at udtrykke interessegen under samme initiativtager. Denne metode kan let anvendes på in vivo- og in vitro-undersøgelser. Shield-1 kan også trænge igennem blod-hjerne barrieren, hvilket gør det nemt også at studere gener, der er involveret i hjernens udvikling.Jævnt frø sunde HEK293T celler ved en tæthed på en til to millioner celler pr 10 centimeter væv kultur plade ved hjælp af 10 milliliter glukose DMEM med 10%filtreret FBS. Inkuber cellerne i vævskulturens inkubator ved 5% kuldioxid og 37 grader Celsius i 20 timer. Den næste dag skal du bekræfte, at cellerne nåede 70% sammenløb af brightfield mikroskopi, og at de er jævnt spredt over pladen.Skift medie en time før transinfektionen med et sidste volumen på 10 milliliter. Forbered to rør med 500 mikroliter af varme medier. Tilsæt 25 mikroliter transfekture reagens til rør et, og inkuber ved stuetemperatur i fem minutter.Til det andet rør tilsættes en blanding af plasmider. Bland rør et med rør to for at danne en transfektblanding, og inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter. Tilsæt transfektureblandingen dråbevis til HEK293T-cellerne og inkubat pladen i vævskulturinkubatoren.Efter 18 timer skal du forsigtigt ændre mediet til 10 milliliter frisk DMEM med 10% FBS for at fjerne transfektreagenset. Inkuber cellerne i de næste 48 timer. Efter 48 timer skal du samle supernatanten med en 10 milliliter sprøjte og passere den gennem et 0,45 mikrometerfilter.Aliquot virus supernatant og gemme det på minus 80 grader Celsius. Til bestemmelse af virus titer, frø 5 millioner HEK293T celler per godt i to seks-godt plader. Inkuber begge plader ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid natten over for at nå 50 til 60% sammenløb.Den næste dag skal du bruge en af de seks brøndsplader til at tælle cellerne i de seks brønde. Optø virus aliquot, der vil blive brugt til at udføre den serielle fortynding og tilsæt otte mikrogram pr milliliter polybryn reagens, forberede DMEM med 10% FBS til seriel fortynding af virus, og tilsæt polybrene reagens. Der fremstilles to milliliter tidobbelt seriefortyndinger af lentivirus fra 0,1 til 0,0001 i polybrene indeholdende medier.Fjern medier fra seks-brønds plade og tilføje en milliliter viral fortyndinger til brøndene, forlader en godt med medierne alene som en negativ kontrol og en godt med 100% virus. Inkuber cellerne i 24 timer. Den næste dag skal du fjerne mediet med virussen fra de seks-brønds plader og ændre det til to milliliter frisk DMEM med 10% FBS.Inkubat cellerne i 48 til 72 timer, observere GFP med en fluorescerende mikroskop hver dag. Efter 48 til 72 timer skal du løsne cellerne og genbruge dem i maksimal buffer. Brug et flowcytometer til at bestemme procentdelen af GFP-udtryk og beregne virustitleren ved hjælp af formlen i tekstmanuskriptet.Plade cellelinjen af interesse i en 10 centimeter plade og inkuber natten over for at nå sammenløbet på 50 til 60%Så inficere cellerne med 500 til 2.000 mikroliter af viruspartikler i en 10 milliliter samlet mængde kultur medium. Inkubere virale medier i 24 timer. Den næste dag skal du ændre virusmedierne til kulturmedier og bestemme procentdelen af GFP-positive celler ved hjælp af flowcytometry.Vælg GFP-positive celler ved hjælp af BD FACSAria II til cellesortering. Udvid positivt markerede celler, og frys bestanden. Plade de positivt udvalgte celler og utransducerede celler i 12-brønds plader separat, 24 timer efter infektion.Vent, indtil cellerne tillægger og ændrer mediet til cellekulturmedier, der indeholder 200 nanomolar Shield-1. Udskift mediet i pladerne med transducerede og utransducerede celler, hvilket efterlader to brønde pr. plade med almindelige medier som en negativ kontrol. Inkuber og ekstrakt proteiner fra hver brønd på nul, to, seks, 12, 24, 48 og 72 timer efter at have tilføjet Shield-1 til brøndene.Fjern derefter mediet med Shield-1 fra resten af brøndene og skift det til almindelige cellemedier. Saml proteinerne fra disse brønde på to, seks og 12 timer efter at have skiftet mediet. Induktionen af Cas9-protein blev bekræftet ved, at dets ekspressionsniveauer var ens blandt de transducerede celler og køretøjet, uanset tilstedeværelsen eller fraværet af Shield-1.Der er tilstrækkelig induktion af Cas9 udtryk i den transducerede A549 celle linje to timer efter behandling med Shield-1, som bliver ubetydelig inden for seks til 12 timer efter tilbagetrækning af Shield-1. Shield-1-behandlede transducerede A549-celler faldt i antal efter 48 timer uden at påvirke Rinella-prøven, som blev valideret ved immunoblotting ved hjælp af et antistof mod det udtømte RPA3-protein. Genredigering inversion eller indel mutationer blev bekræftet ved hjælp af landmåler nuklease assays.Den lentivirus vektor konstruktion designet var en bicistronic system, der bærer et andet gen af interesse under samme EF-1a initiativtager. Et modificeret fluorescerende protein, P2A, blev tilsat for at spore inficerede celler. Ekspressionen af mVenus-proteinet blev observeret i køretøjet og A549 transducerede celler, uafhængigt af DD-Cas9-ekspression og Shield-1-behandling.Den effektive transduktion af cellelinjen med DD-Cas9 vektor er et af de hastighedsbegrænsende trin, for at have sunde HEK293T-celler og bruge deres lave passagenummer er afgørende. Optimeringen af forholdet mellem DD-Cas9 plasmid, emballageplasmid og kuvertplasmid er meget vigtig for optimal transinfektion. Men ved siden af det, også mængden af Shield-1, der er nødvendig for at stabilisere DD-Cas9 målceller er noget, du skal være forsigtig med.DD-Cas9 med Cre plasmid er også tilgængelig, og det kan bruges til at studere de genetiske interaktioner i in vivo-undersøgelser baseret på Cre-lox-systemet.

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping og CRISPR / Cas9 redigering for at identificere et lægemiddelresistensgen i<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En standardmetode til at undersøge ejendommen mutagenicitet som en funktion af punkt Mutation reparation katalyseret af CRISPR/Cas9 og SsODN i humane celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Mikroinjektion af CRISPR/Cas9 Protein i kanal havkat, Ictalurus punctatus, embryoner til Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

En protokol til produktion af Integrase-mangelfuld Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-medieret gen Knockout i dividere celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effektiv produktion og identifikation af CRISPR/Cas9-genereret gen Knockouts i Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Højeffektive gen afbrydelse af Murine og menneskelige hæmatopoietisk stamceller ved CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Ved hjælp af musen oocyter at vurdere menneskelige genfunktion under meiose jeg

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

En hurtig og letkøbt Pipeline for generering af genomisk punkt mutanter i C. elegans bruger CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen redigering at gøre betinget mutanter af menneskelige Malaria parasitten, P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...