Name: a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization
Uploaded: 2021-09-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization at JoVE.com

We danken eerdere leden van ons laboratorium en wetenschapper Serif Senturk voor eerder werk. Wij danken Danilo Segovia voor het kritisch lezen van dit manuscript. Deze studie was mogelijk en werd ondersteund door Swim Across America en het National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center-programma.

1.The DD-Cas9 vector
<ol><li>Verkrijg DD-Cas9 vector van Addgene (DD-Cas9 met vulvolgorde en Venus (EDCPV), Plasmid 90085). OPMERKING: Dit is een lentivirale DD-Cas9 plasmide met een U6 promotor die de single guide RNA (sgRNA) transcriptie aanstuurt terwijl de EFS promotor de DD-Cas9 transcriptie aanstuurt. De DYKDDDDK-sequentie (vlag-tag) is aanwezig op de C-terminal van Cas9, gevolgd door 2A zelf-splijtend peptide (P2A) dat DD-Cas9 en gemodificeerd fluorescerend eiwit Venus (mVenus) scheidt.</li>
</ol><p class="jo...

<ol>
	<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats+(CRISPRs):+the+hallmark+of+an+ingenious+antiviral+defense+mechanism+in+prokaryotes.">Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes.</a> Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CRISPR-Cas9+genome+engineering:+lessons+learned+from+RNA+interference.">Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference.</a> Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).</li><li>Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Inducible+CRISPR/Cas+Systems.">Drug Inducible CRISPR/Cas Systems.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).</li><li>Wade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Silencing+Using+the+CRISPR-Cas9+System:+A+Review+of+the+Benefits+and+Challenges.">High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).</li><li>Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-switchable+substrates+for+a+ubiquitin-proteasome+system.">Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+efficient+inducible+CRISPR/Cas9+platform+with+improved+specificity+for+multiple+gene+targeting.">An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting.</a> Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).</li><li>Oakes, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+engineering+hotspots+identifies+an+allosteric+CRISPR-Cas9+switch.">Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch.</a> Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+protein+tagging+in+cells+with+split+fluorescent+protein.">Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein.</a> Nature Communications. 7, 11046 (2016).</li><li>Roper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+and+organoid+transplantation+models+of+colorectal+cancer+and+metastasis.">In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis.</a> Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).</li><li>Chu, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+with+FKBP-derived+destabilizing+domains.">Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+control+of+protein+stability+and+function+in+living+mice.">Chemical control of protein stability and function in living mice.</a> Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+reversible,+and+tunable+method+to+regulate+protein+function+in+living+cells+using+synthetic+small+molecules.">A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules.</a> Cell. 126, 995-1004 (2006).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing.">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+CRISPR/Cas9-induced+mutant+screening.">A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening.</a> Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).</li><li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification.">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).</li><li>Senturk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+tunable+method+to+temporally+control+gene+editing+based+on+conditional+Cas9+stabilization.">Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization.</a> Nature Communications. 8, 14370 (2017).</li><li>McJunkin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+suppression+of+an+essential+gene+in+adult+mice+using+transgenic+RNA+interference.">Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).</li><li>Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-triggered+Cas9+protein+with+improved+genome-editing+specificity.">Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity.</a> Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).</li><li>Dow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).</li><li>Wright, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+split-Cas9+enzyme+complex.">Rational design of a split-Cas9 enzyme complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).</li><li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lentiviral+Packaging+Mixes+and+Producer+Cell+Lines+for+RNAi+Applications.">Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications.</a> Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).</li><li>Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Protein+Stabilization+In+Vivo+Mediated+by+Shield-1+in+Transgenic+Medaka.">Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka.</a> PLOS One. , (2015).</li><li>Sellmyer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+context+affects+levels+of+a+chemically+dependent+destabilizing+domain.">Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain.</a> PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).</li><li>Iwamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+chemical+method+to+regulate+protein+stability+in+the+mammalian+central+nervous+system.">A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system.</a> Chemistry &amp; Biology. 17 (9), 981-988 (2010).</li><li>Tai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+domains+mediate+reversible+transgene+expression+in+the+brain.">Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain.</a> PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).</li><li>Auffenberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+and+reversible+inhibition+of+neurons+and+circuits+by+small+molecule+induced+potassium+channel+stabilization.">Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization.</a> Scientific Reports. 6, 19293 (2016).</li></ol>

De CRISPR/Cas9-technologie heeft een revolutie teweeggebracht in het vermogen om genomen functioneel te ondervragen2. De inactivatie van genen resulteert echter vaak in celdoodheid, functionele tekorten en ontwikkelingsstoornissen, waardoor het nut van dergelijke benaderingen voor het bestuderen van genfuncties wordt beperkt7. Bovendien kan constitutieve expressie van Cas9 leiden tot toxiciteit en het genereren van off-target effecten6. Er zijn versc...

CRISPR-Cas9 , wat staat voor "geclusterd regelmatig interspaced kort palindromisch repeats-geassocieerd eiwit 9" werd voor het eerst ontdekt als onderdeel van studies naar bacteriële adaptieve immuniteit1,2. Tegenwoordig is CRISPR/Cas9 het meest erkende hulpmiddel geworden voor programmeerbare genbewerking en zijn verschillende iteraties van het systeem ontwikkeld om transcriptie- en epigenetische modulaties mogelijk te maken3. Deze technologie maakt de zeer nauwkeurige genetische manipulatie van bijna elke opeenvolging van DNA4 mogelijk.
De essentiële componenten van elke CRISPR-genbewerking zijn een aanpasbare guide RNA-sequentie en de Cas9 nuclease5. De RNA-gids bindt zich aan de doel-complementaire sequentie in het DNA, waardoor de Cas9-nuclease wordt aangedreven om een dubbelstrengsbreuk uit te voeren op een specifiek punt in het genoom3,4. De resulterende decolletésite wordt vervolgens gerepareerd door niet-homologe end-joining (NHEJ) of homologie-gerichte reparatie (HDR), met de daaruit voortvloeiende introductie van veranderingen in de beoogde DNA-sequentie5.
Crispr/Cas9 gebaseerde genbewerking is eenvoudig te gebruiken, en relatief goedkoop in vergelijking met eerdere genbewerkingstechnieken en het is bewezen zowel efficiënt als robuust te zijn in een veelheid van systemen2,4,5. Toch vertoont het systeem enkele beperkingen. Het is vaak aangetoond dat de constitutieve expressie van Cas9 leidt tot een verhoogd aantal off-targets en hoge celtoxiciteit4,6,7,8. Bovendien neemt de constitutieve targeting van essentiële en celoverlevingsgenen door Cas9 afstand van zijn vermogen om bepaalde soorten functionele studies uit te voeren, zoals kinetische studies naar celdood7.
Er zijn verschillende onopleidbare of voorwaardelijk gecontroleerde CRISPR-Cas9-instrumenten ontwikkeld om deze problemen aan te pakken6, zoals Tet-ON en Tet-Off9; locatiespecifieke recombinatie10; chemisch geïnduceerde nabijheid11; inteïneafhankelijke splicing3; en 4-Hydroxytamoxifen Oestrogeen Receptor (ER) gebaseerde nucleaire lokalisatie systemen12. Over het algemeen bieden de meeste van deze procedures (inteine splicing en chemisch geïnduceerde proximity split-systemen) geen omkeerbare controle, vertonen ze een zeer trage kinetische respons op medicamenteuze behandeling (Tet-On/Off-systeem) of zijn ze niet vatbaar voor manipulatie met hoge doorvoer6.
Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een nieuwe toolkit ontwikkeld die niet alleen snelle en robuuste temporele-gecontroleerde genbewerking biedt, maar ook zorgt voor traceerbaarheid, afstemming en ontvankelijkheid voor genmanipulatie met hoge doorvoer. Deze nieuwe technologie kan worden gebruikt in cellijnen, organoïden en diermodellen. Ons systeem is gebaseerd op een ontworpen domein, wanneer het is gesmolten met Cas9, veroorzaakt het zijn snelle afbraak. Het kan echter snel worden gestabiliseerd met een zeer selectief, niet-toxisch, celdoorlatend klein molecuul. Meer specifiek hebben we de menselijke FKBP12 mutant "destabiliserend domein" (DD) naar Cas9 ontworpen, waarbij Cas9 werd gemarkeerd voor snelle en constitutieve afbraak via het ubiquitin-proteasoomsysteem wanneer uitgedrukt in zoogdiercellen13. De DD synthetische ligand, Shield-1 kan DD-conformatie stabiliseren, waardoor de afbraak van eiwitten die zijn gesmolten tot DD (zoals Cas9) op een zeer efficiënte manier wordt voorkomen, en met een snelle kinetische respons14,15. Van belang, Shield-1 bindt met drie ordes van grootte strakker aan de mutant FKBP12 dan aan zijn wild-type tegenhanger14.
Het DD-Cas9/Shield-1-paar kan worden gebruikt om de systematische identificatie en karakterisering van essentiële genen in gekweekte cellen en diermodellen te bestuderen, zoals we eerder hebben laten zien door ons voorwaardelijk te richten op het CypD-gen, dat een belangrijke rol speelt in het metabolisme van mitochondriën; EGFR, een belangrijke speler in oncogene transformatie; en Tp53, een centraal gen in dna-schaderespons. Naast tijdelijk en voorwaardelijk gecontroleerde genbewerking is een ander voordeel van de methode dat de stabilisatie van DD-Cas9 onafhankelijk is van de transcriptie ervan. Deze functie maakt co-expressie, onder dezelfde promotor, van traceerbare markers en recombinases mogelijk, zoals de oestrogeenreceptorafhankelijke recombinase, CREER. In dit werk laten we zien hoe onze methode succesvol in vitro kan worden gebruikt, om bijvoorbeeld dna-replicatiegen RPA3 voorwaardelijk te targeten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100mM DTT</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X FastDigest buffer</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>B64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 Ligation Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorimetric BCA kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, glutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>EF0654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest BsmBI</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>FD0454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag [M2] mouse mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR &#38; Gel Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibodies</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shield-1</td>
			<td>Cheminpharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 competent bacterial cells</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURVEYOR Mutation Detection Kit</td>
			<td>Transgenomic/IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin [DM1A] mouse mAb</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CP06-100UG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization

De geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische repeat- (CRISPR-) geassocieerde eiwit 9 (CRISPR/Cas9) technologie is uitgegroeid tot een veel voorkomend laboratoriuminstrument om nauwkeurige en gerichte modificaties in het genoom te introduceren. De enorme populariteit en snelle verspreiding worden toegeschreven aan het eenvoudige gebruik en de nauwkeurigheid in vergelijking met zijn voorgangers. Toch heeft de constitutieve activering van het systeem beperkte toepassingen. In dit artikel beschrijven we een nieuwe methode die temporele controle van CRISPR/Cas9-activiteit mogelijk maakt op basis van voorwaardelijke stabilisatie van het Cas9-eiwit. Het samensmelten van een gemanipuleerde mutant van het rapamycinebindende eiwit FKBP12 tot Cas9 (DD-Cas9) maakt de snelle afbraak van Cas9 mogelijk die op zijn beurt kan worden gestabiliseerd door de aanwezigheid van een FKBP12 synthetische ligand (Shield-1). In tegenstelling tot andere induceerbare methoden kan dit systeem eenvoudig worden aangepast om bi-cistronic-systemen te genereren om DD-Cas9 samen met een ander interessant gen uit te drukken, zonder voorwaardelijke regulering van het tweede gen. Deze methode maakt het genereren van traceerbare systemen mogelijk, evenals de parallelle, onafhankelijke manipulatie van allelen waarop Cas9 nuclease is gericht. Het platform van deze methode kan worden gebruikt voor de systematische identificatie en karakterisering van essentiële genen en de ondervraging van de functionele interacties van genen in in vitro en in vivo omgevingen.

Om de voorwaardelijke expressie van Cas9 mogelijk te maken, ontwikkelden we een dubbele lentivirale vectorconstructie bestaande uit een U6-aangedreven promotor om sgRNA constitutief uit te drukken, en een EF-1α-kernpromotor om de expressie van het DD-Cas9-fusie-eiwit te stimuleren (Figuur 1A)19. Als een paradigma om de robuustheid en efficiëntie van het systeem te illustreren, transduceerde we de longcarcinomateuze A549-cellijn met d...

Watch this Scientific Journal Video about A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization at JoVE.com

A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization

Hier beschrijven we een genoombewerkingstool op basis van de temporele en voorwaardelijke stabilisatie van geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische repeat- (CRISPR-) geassocieerd eiwit 9 (Cas9) onder het kleine molecuul, Shield-1. De methode kan worden gebruikt voor gekweekte cellen en diermodellen.

Een nieuwe toolkit voor het evalueren van genfuncties met behulp van voorwaardelijke Cas9-stabilisatie

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associated protein 9 (CRISPR/Cas9) technology has become a prevalent laboratory ...

Deze methode biedt snelle, temperatuurgecontroleerde CRISPR-Cas9 genbewerking onder een klein molecuul, Shield-1. Het biedt ook minder off-target effecten, lagere celtoxiciteit, en ook hogere intern gecontroleerde genbewerking bij het vergelijken met constitutieve activering van Cas9. Het belangrijkste voordeel van dit deeltje is dat het kan worden gebruikt voor karakterisering van essentiële genen, evenals tumoroverlevingsgenen.Destabilisatie van DD-Cas9 is onafhankelijk van de expressie ervan, en dit maakt het mogelijk om het gen van belang mede-uitgedrukt onder dezelfde promotor. Deze methode kan eenvoudig worden toegepast op in vivo en in vitro studies. Shield-1 kan ook doordringen door de bloed - hersenbarrière, waardoor het ook gemakkelijk is om genen te bestuderen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van de hersenen.Gelijkmatig zaai gezonde HEK293T cellen met een dichtheid van één tot twee miljoen cellen per 10 centimeter weefselkweekplaat met behulp van 10 milliliter glucose DMEM met 10% gefilterde FBS. Incubeer de cellen in de weefselkweek incubator bij 5%kooldioxide en 37 graden Celsius gedurende 20 uur. Bevestig de volgende dag dat de cellen 70% samenvloeiing bereikten door brightfield-microscopie en dat ze gelijkmatig over de plaat zijn verspreid.Verander de media een uur voor de transfectie met een eindvolume van 10 milliliter. Bereid twee buizen voor met 500 microliter warme media. Voeg 25 microliter transfectiereagens toe aan buis één en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Voeg aan de andere buis een mengsel van plasmiden toe. Meng buis één met buis twee om een transfectiemengsel te vormen en incubeer gedurende 20 minuten op kamertemperatuur. Voeg het transfectiemengsel druppelgewijs toe aan de HEK293T-cellen en incubeer de plaat in de weefselkweek-incubator.Verander na 18 uur het medium voorzichtig in 10 milliliter verse DMEM met 10%FBS om het transfectiereagens te verwijderen. Incubeer de cellen de komende 48 uur. Verzamel na 48 uur het supernatant met een spuit van 10 milliliter en passeer het door een filter van 0,45 micrometer.Aliquot het virus supernatant en bewaar het op min 80 graden Celsius. Voor het bepalen van virustiter, zaad 5 miljoen HEK293T cellen per put in twee zes-put platen. Incubeer beide platen bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide 's nachts om 50 tot 60% samenvloeiing te bereiken.Gebruik de volgende dag een van de zesputplaten om de cellen in de zes putten te tellen. Ontdooi het virus aliquot dat zal worden gebruikt om de seriële verdunning uit te voeren en voeg acht microgram per milliliter polybreenreagens toe, bereid DMEM met 10% FBS voor seriële verdunning van het virus en voeg het polybreenreagens toe. Bereid twee milliliter tienvoudige seriële verdunningen van het lentivirus van 0,1 tot 0,0001 in polybreen bevattende media.Verwijder media van de zes-put plaat en voeg een milliliter virale verdunningen toe aan de putten, waardoor een put met media alleen als een negatieve controle en een goed met 100% virus. Incubeer de cellen gedurende 24 uur. Verwijder de volgende dag de media met het virus van de zes-put platen en verander het in twee milliliter verse DMEM met 10%FBS.Incubeer de cellen gedurende 48 tot 72 uur en observeer GFP elke dag met een fluorescerende microscoop. Maak na 48 tot 72 uur de cellen los en resuspend ze in maximale buffer. Gebruik een flowcytometer om het percentage GFP-expressie te bepalen en de virustiter te berekenen met behulp van de formule in het teksthandschrift.Plaat de cellijn van belang in een plaat van 10 centimeter en incubeer 's nachts om samenvloeiing van 50 tot 60% te bereiken En infecteer vervolgens de cellen met 500 tot 2.000 microliter virusdeeltjes in een totaal volume van 10 milliliter kweekmedium. Incubeer de virale media gedurende 24 uur. Verander de volgende dag de virale media in kweekmedia en bepaal het percentage GFP-positieve cellen met behulp van flowcytometrie.Selecteer GFP-positieve cellen met BD FACSAria II voor celsortering. Vouw positief geselecteerde cellen uit en vries de voorraad in. Plaat de positief geselecteerde cellen en onverzonde cellen in 12-put platen afzonderlijk, 24 uur na infectie.Wacht tot de cellen zich hechten en verander de media in celkweekmedia met 200 nanomolar Shield-1. Vervang de media in de platen door getransduceerde en niet-vertaalde cellen, waardoor twee putten per plaat met gewone media als negatieve controle achterblijven. Incubeer en extract eiwitten uit elke put op nul, twee, zes, 12, 24, 48 en 72 uur na het toevoegen van Shield-1 aan de putten.Verwijder vervolgens de media met Shield-1 uit de rest van de putten en vervang deze voor gewone celmedia. Verzamel de eiwitten uit die putten op twee, zes en 12 uur na het veranderen van de media. De inductie van Cas9-eiwit werd bevestigd doordat de expressieniveaus vergelijkbaar waren tussen de transduceerde cellen en het voertuig, ondanks de aan- of afwezigheid van Shield-1.Er is voldoende inductie van Cas9-expressie in de getransduceerde A549-cellijn twee uur na behandeling met Shield-1, die verwaarloosbaar wordt binnen zes tot 12 uur na intrekking van Shield-1. Shield-1 behandelde getransduceerde A549-cellen daalden in aantal na 48 uur zonder het Rinella-monster aan te tasten, dat werd gevalideerd door immunoblotting met behulp van een antilichaam tegen het uitgeputte RPA3-eiwit. Genbewerkingsinversie- of indelmutaties werden bevestigd met behulp van nucleasetesten van landmeters.De lentivirus vector construct ontworpen was een bicistronic systeem met een ander gen van belang onder dezelfde EF-1a promotor. Een gemodificeerd fluorescerend eiwit, P2A, werd toegevoegd om geïnfecteerde cellen op te sporen. De expressie van het mVenus-eiwit werd waargenomen in het voertuig en de A549-transduceerde cellen, onafhankelijk van DD-Cas9-expressie en Shield-1-behandeling.De efficiënte transductie van de cellijn met DD-Cas9 vector is een van de snelheidsbeperkende stappen, voor het hebben van gezonde HEK293T-cellen en het gebruik van hun lage passagenummer is cruciaal. De optimalisatie van de verhouding tussen DD-Cas9 plasmide, verpakking plasmide en envelop plasmide is erg belangrijk voor een optimale transfectie. Maar daarnaast is ook de hoeveelheid Shield-1 die nodig is om DD-Cas9 doelcellen te stabiliseren iets waar je voorzichtig mee moet zijn.De DD-Cas9 met de Cre plasmide is ook beschikbaar, en het kan worden gebruikt om de genetische interacties te bestuderen in in vivo studies op basis van cre-lox systeem.

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping en CRISPR / Cas9 Editing om een ​​Drug Resistance Gene te identificeren<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection van CRISPR/Cas9 eiwit in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embryo's voor Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Een Protocol voor de productie van Integrase-deficiënte lentivirale vectoren voor CRISPR/Cas9-gemedieerde Gene knock-out in cellen verdelen

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerd Gene uitsparingen in de modelsysteem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Met behulp van de muis eicellen te beoordelen van menselijke genfunctie tijdens de meiose I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene bewerken te maken voorwaardelijke mutanten van menselijke malariaparasiet P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...