Name: a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization
Uploaded: 2021-09-02T13:00:00
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Nous remercions les anciens membres de notre laboratoire et le scientifique Serif Senturk pour leurs travaux antérieurs. Nous remercions Danilo Segovia d’avoir lu ce manuscrit de manière critique. Cette étude a été possible et soutenue par Swim Across America et le programme Cancer Target Discovery and Development Center du National Cancer Institute.

1.Le vecteur DD-Cas9
<ol><li>Obtenir le vecteur DD-Cas9 à partir d’Addgene (DD-Cas9 avec séquence de remplissage et Vénus (EDCPV), Plasmide 90085). REMARQUE: Il s’agit d’un plasmide lentiviral DD-Cas9 avec un promoteur U6 qui pilote la transcription de l’ARN guide unique (sgRNA) tandis que le promoteur EFS pilote la transcription DD-Cas9. La séquence DYKDDDDK (flag-tag) est présente au terminal C de Cas9 suivie du peptide auto-clivant 2A (P2A) qui sépare DD-Cas9 et la protéine fluorescente modifiée V...

<ol>
	<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats+(CRISPRs):+the+hallmark+of+an+ingenious+antiviral+defense+mechanism+in+prokaryotes.">Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes.</a> Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CRISPR-Cas9+genome+engineering:+lessons+learned+from+RNA+interference.">Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference.</a> Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).</li><li>Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Inducible+CRISPR/Cas+Systems.">Drug Inducible CRISPR/Cas Systems.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).</li><li>Wade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Silencing+Using+the+CRISPR-Cas9+System:+A+Review+of+the+Benefits+and+Challenges.">High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).</li><li>Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-switchable+substrates+for+a+ubiquitin-proteasome+system.">Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+efficient+inducible+CRISPR/Cas9+platform+with+improved+specificity+for+multiple+gene+targeting.">An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting.</a> Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).</li><li>Oakes, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+engineering+hotspots+identifies+an+allosteric+CRISPR-Cas9+switch.">Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch.</a> Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+protein+tagging+in+cells+with+split+fluorescent+protein.">Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein.</a> Nature Communications. 7, 11046 (2016).</li><li>Roper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+and+organoid+transplantation+models+of+colorectal+cancer+and+metastasis.">In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis.</a> Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).</li><li>Chu, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+with+FKBP-derived+destabilizing+domains.">Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+control+of+protein+stability+and+function+in+living+mice.">Chemical control of protein stability and function in living mice.</a> Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+reversible,+and+tunable+method+to+regulate+protein+function+in+living+cells+using+synthetic+small+molecules.">A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules.</a> Cell. 126, 995-1004 (2006).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing.">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+CRISPR/Cas9-induced+mutant+screening.">A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening.</a> Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).</li><li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification.">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).</li><li>Senturk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+tunable+method+to+temporally+control+gene+editing+based+on+conditional+Cas9+stabilization.">Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization.</a> Nature Communications. 8, 14370 (2017).</li><li>McJunkin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+suppression+of+an+essential+gene+in+adult+mice+using+transgenic+RNA+interference.">Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).</li><li>Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-triggered+Cas9+protein+with+improved+genome-editing+specificity.">Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity.</a> Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).</li><li>Dow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).</li><li>Wright, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+split-Cas9+enzyme+complex.">Rational design of a split-Cas9 enzyme complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).</li><li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lentiviral+Packaging+Mixes+and+Producer+Cell+Lines+for+RNAi+Applications.">Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications.</a> Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).</li><li>Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Protein+Stabilization+In+Vivo+Mediated+by+Shield-1+in+Transgenic+Medaka.">Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka.</a> PLOS One. , (2015).</li><li>Sellmyer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+context+affects+levels+of+a+chemically+dependent+destabilizing+domain.">Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain.</a> PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).</li><li>Iwamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+chemical+method+to+regulate+protein+stability+in+the+mammalian+central+nervous+system.">A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system.</a> Chemistry &amp; Biology. 17 (9), 981-988 (2010).</li><li>Tai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+domains+mediate+reversible+transgene+expression+in+the+brain.">Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain.</a> PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).</li><li>Auffenberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+and+reversible+inhibition+of+neurons+and+circuits+by+small+molecule+induced+potassium+channel+stabilization.">Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization.</a> Scientific Reports. 6, 19293 (2016).</li></ol>

La technologie CRISPR/Cas9 a révolutionné la capacité d’interroger fonctionnellement les génomes2. Cependant, l’inactivation des gènes entraîne souvent une létalité cellulaire, des déficits fonctionnels et des défauts de développement, ce qui limite l’utilité de telles approches pour l’étude des fonctions des gènes7. De plus, l’expression constitutive de Cas9 peut entraîner une toxicité et la génération d’effets hors cible6</s...

CRISPR-Cas9 qui signifie «clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9» a été découvert pour la première fois dans le cadre d’études sur l’immunité adaptative bactérienne1,2. Aujourd’hui, CRISPR/Cas9 est devenu l’outil le plus reconnu pour l’édition programmable de gènes et différentes itérations du système ont été développées pour permettre des modulations transcriptionnelles et épigénétiques3. Cette technologie permet la manipulation génétique très précise de presque toutes les séquences d’ADN4.
Les composants essentiels de toute édition de gène CRISPR sont une séquence d’ARN guide personnalisable et la nucléase Cas95. Le guide de l’ARN se lie à la séquence cible-complémentaire dans l’ADN, dirigeant la nucléase Cas9 pour effectuer une rupture double brin à un point spécifique du génome3,4. Le site de clivage résultant est ensuite réparé par jonction finale non homologue (NHEJ) ou réparation dirigée par homologie (HDR), avec l’introduction conséquente de changements dans la séquence d’ADN ciblée5.
L’édition de gènes basée sur CRISPR / Cas9 est facile à utiliser et relativement peu coûteuse par rapport aux techniques d’édition de gènes précédentes et il a été prouvé qu’elle était à la fois efficace et robuste dans une multiplicité de systèmes2,4,5. Pourtant, le système présente certaines limites. Il a souvent été démontré que l’expression constitutive de Cas9 entraîne une augmentation du nombre de hors-cibles et une toxicité cellulaire élevée4,6,7,8. De plus, le ciblage constitutif des gènes essentiels et de survie cellulaire par Cas9 enlève de sa capacité à effectuer certains types d’études fonctionnelles telles que les études cinétiques de la mort cellulaire7.
Différents outils CRISPR-Cas9 inductibles ou contrôlés conditionnellement ont été développés pour résoudre ces problèmes6,tels que Tet-ON et Tet-Off9; recombinaison spécifique au site10; proximité induite chimiquement11; épissage dépendant de l’intein3; et les systèmes de localisation nucléaire à base de récepteurs d’œstrogènes (ER) à base de 4-hydroxytamoxifènes12. En général, la plupart de ces procédures (épissage des intégrines et systèmes de séparation de proximité induits chimiquement) n’offrent pas de contrôle réversible, présentent une réponse cinétique très lente au traitement médicamenteux (système Tet-On/Off) ou ne se prêtent pas à une manipulation à haut débit6.
Pour remédier à ces limitations, nous avons développé une nouvelle boîte à outils qui fournit non seulement une édition de gènes rapide et robuste contrôlée dans le temps, mais assure également la traçabilité, l’accordabilité et l’adaptabilité à la manipulation de gènes à haut débit. Cette nouvelle technologie peut être utilisée dans les lignées cellulaires, les organoïdes et les modèles animaux. Notre système est basé sur un domaine d’ingénierie, lorsqu’il est fusionné à Cas9, il induit sa dégradation rapide. Cependant, il peut être rapidement stabilisé avec une petite molécule hautement sélective, non toxique et perméable aux cellules. Plus précisément, nous avons conçu le mutant humain FKBP12 « domaine déstabilisant » (DD) à Cas9, marquant Cas9 pour une dégradation rapide et constitutive via le système ubiquitine-protéasome lorsqu’il est exprimé dans des cellules de mammifères13. Le ligand synthétique DD, Shield-1 peut stabiliser la conformation DD, empêchant ainsi la dégradation des protéines fusionnées en DD (telles que Cas9) de manière très efficace, et avec une réponse cinétique rapide14,15. Il est à noter que Shield-1 se lie avec trois ordres de grandeur plus étroitement au mutant FKBP12 qu’à son homologue de type sauvage14.
La paire DD-Cas9/Shield-1 peut être utilisée pour étudier l’identification et la caractérisation systématiques des gènes essentiels dans les cellules cultivées et les modèles animaux, comme nous l’avons montré précédemment en ciblant conditionnellement le gène CypD, qui joue un rôle important dans le métabolisme des mitochondries; EGFR, acteur clé de la transformation oncogénique ; et Tp53, un gène central dans la réponse aux dommages à l’ADN. En plus de l’édition de gènes contrôlée temporellement et conditionnellement, un autre avantage de la méthode est que la stabilisation de DD-Cas9 est indépendante de sa transcription. Cette caractéristique permet la co-expression, sous le même promoteur, de marqueurs traçables ainsi que de recombinases, telles que la recombinase dépendante des récepteurs d’œstrogènes, CREER. Dans ce travail, nous montrons comment notre méthode peut être utilisée avec succès in vitro, pour cibler conditionnellement par exemple, le gène de réplication de l’ADN, RPA3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100mM DTT</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X FastDigest buffer</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>B64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 Ligation Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorimetric BCA kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, glutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>EF0654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest BsmBI</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>FD0454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag [M2] mouse mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR &#38; Gel Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibodies</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shield-1</td>
			<td>Cheminpharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 competent bacterial cells</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURVEYOR Mutation Detection Kit</td>
			<td>Transgenomic/IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin [DM1A] mouse mAb</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CP06-100UG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization

La technologie CRISPR/Cas9 (CRISPR/Cas9) associée à la répétition palindromique courte et régulièrement intercalée en grappes est devenue un outil de laboratoire répandu pour introduire des modifications précises et ciblées dans le génome. Son énorme popularité et sa propagation rapide sont attribuées à sa facilité d’utilisation et à sa précision par rapport à ses prédécesseurs. Pourtant, l’activation constitutive du système a des applications limitées. Dans cet article, nous décrivons une nouvelle méthode qui permet un contrôle temporel de l’activité CRISPR/Cas9 basé sur la stabilisation conditionnelle de la protéine Cas9. La fusion d’un mutant artificiel de la protéine de liaison à la rapamycine FKBP12 en Cas9 (DD-Cas9) permet la dégradation rapide de Cas9 qui à son tour peut être stabilisée par la présence d’un ligand synthétique FKBP12 (Shield-1). Contrairement à d’autres méthodes inductibles, ce système peut être facilement adapté pour générer des systèmes bi-cistroniques afin de co-exprimer DD-Cas9 avec un autre gène d’intérêt, sans régulation conditionnelle du second gène. Cette méthode permet la génération de systèmes traçables ainsi que la manipulation parallèle et indépendante d’allèles ciblés par la nucléase Cas9. La plate-forme de cette méthode peut être utilisée pour l’identification et la caractérisation systématiques de gènes essentiels et l’interrogation des interactions fonctionnelles des gènes in vitro et in vivo.

Pour permettre l’expression conditionnelle de Cas9, nous avons développé une construction de vecteur lentiviral dual composée d’un promoteur piloté par U6 pour exprimer constitutivement l’ARNg, et d’un promoteur de noyau EF-1α pour conduire l’expression de la protéine de fusion DD-Cas9(Figure 1A)19. Comme paradigme pour illustrer la robustesse et l’efficacité du système, nous avons transduint la lignée cellulaire A...

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A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization

Nous décrivons ici un outil d’édition du génome basé sur la stabilisation temporelle et conditionnelle de la protéine 9 (Cas9) associée à la répétition palindromique courte (CRISPR-) groupée régulièrement espacée sous la petite molécule Shield-1. La méthode peut être utilisée pour des cellules cultivées et des modèles animaux.

Une nouvelle boîte à outils pour évaluer les fonctions des gènes à l’aide de la stabilisation cas9 conditionnelle

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associated protein 9 (CRISPR/Cas9) technology has become a prevalent laboratory ...

Cette méthode fournit une édition rapide et à température contrôlée du gène CRISPR-Cas9 sous une petite molécule, Shield-1. Il offre également moins d’effets hors cible, une toxicité cellulaire plus faible et une édition de gènes contrôlée en interne plus élevée lorsqu’on la compare à l’activation constitutive de Cas9. Le principal avantage de cette particule est qu’elle peut être utilisée pour la caractérisation de gènes essentiels, ainsi que de gènes de survie tumorale.La déstabilisation de DD-Cas9 est indépendante de son expression, ce qui permet au gène d’intérêt d’être co-exprimé sous le même promoteur. Cette méthode peut être facilement appliquée à des études in vivo et in vitro. Shield-1 peut également pénétrer à travers la barrière hémato-encéphalique, ce qui facilite également l’étude des gènes impliqués dans le développement du cerveau.Ensemencez uniformément des cellules HEK293T saines à une densité d’un à deux millions de cellules par plaque de culture tissulaire de 10 centimètres en utilisant 10 millilitres de glucose DMEM avec 10% de FBS filtré. Incuber les cellules dans l’incubateur de culture tissulaire à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius pendant 20 heures. Le lendemain, confirmez que les cellules ont atteint 70% de confluence par microscopie à fond clair et qu’elles sont uniformément dispersées sur la plaque.Changez de support une heure avant la transfection avec un volume final de 10 millilitres. Préparez deux tubes avec 500 microlitres de milieu chaud. Ajouter 25 microlitres de réactif de transfection au premier tube et incuber à température ambiante pendant cinq minutes.À l’autre tube, ajoutez un mélange de plasmides. Mélanger le tube un avec le tube deux pour former un mélange de transfection et incuber à température ambiante pendant 20 minutes. Ajouter le mélange de transfection goutte à goutte aux cellules HEK293T et incuber la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire.Après 18 heures, changez soigneusement le support à 10 millilitres de DMEM frais avec 10% FBS pour retirer le réactif de transfection. Incuber les cellules pendant les 48 heures suivantes. Après 48 heures, prélever le surnageant avec une seringue de 10 millilitres et le faire passer à travers un filtre de 0,45 micromètre.Aliquotez le surnageant du virus et stockez-le à moins 80 degrés Celsius. Pour déterminer le titre du virus, ensemencez 5 millions de cellules HEK293T par puits dans deux plaques de six puits. Incuber les deux plaques à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant la nuit pour atteindre 50 à 60% de confluence.Le lendemain, utilisez l’une des plaques de six puits pour compter les cellules dans les six puits. Décongeler l’aliquote du virus qui sera utilisée pour effectuer la dilution en série et ajouter huit microgrammes par millilitre de réactif polybrène, préparer le DMEM avec 10% FBS pour la dilution en série du virus et ajouter le réactif polybrène. Préparer deux millilitres de dilutions en série décuplées du lentivirus de 0,1 à 0,0001 dans des milieux contenant du polybrene.Retirer le milieu de la plaque de six puits et ajouter un millilitre de dilutions virales aux puits, en laissant un puits avec un milieu seul comme témoin négatif et un puits avec 100% de virus. Incuber les cellules pendant 24 heures. Le lendemain, retirez le support avec le virus des plaques à six puits et changez-le en deux millilitres de DMEM frais avec 10% FBS.Incuber les cellules pendant 48 à 72 heures, en observant la GFP avec un microscope fluorescent tous les jours. Après 48 à 72 heures, détachez les cellules et ressuspendez-les dans un tampon maximal. Utilisez un cytomètre en flux pour déterminer le pourcentage d’expression de GFP et calculez le titre du virus à l’aide de la formule donnée dans le manuscrit textuel.Plaquez la lignée cellulaire d’intérêt dans une plaque de 10 centimètres et incubez pendant la nuit pour atteindre une confluence de 50 à 60%Ensuite, infectez les cellules avec 500 à 2 000 microlitres de particules virales dans un volume total de 10 millilitres de milieu de culture. Incuber le milieu viral pendant 24 heures. Le lendemain, changez le milieu viral en milieu de culture et déterminez le pourcentage de cellules GFP positives en utilisant la cytométrie en flux.Sélectionnez les cellules GFP positives à l’aide de BD FACSAria II pour le tri des cellules. Développez les cellules sélectionnées positivement et congelez le stock. Plaquez les cellules sélectionnées positivement et les cellules non transduisons dans des plaques de 12 puits séparément, 24 heures après l’infection.Attendez que les cellules se fixent et changent le milieu en milieu de culture cellulaire contenant 200 nanomolaires Shield-1. Remplacez le support dans les plaques par des cellules transduies et non transduites, en laissant deux puits par plaque avec des supports réguliers comme contrôle négatif. Incuber et extraire les protéines de chaque puits à zéro, deux, six, 12, 24, 48 et 72 heures après avoir ajouté Shield-1 aux puits.Ensuite, retirez le média avec Shield-1 du reste des puits et remplacez-le par un milieu cellulaire ordinaire. Recueillez les protéines de ces puits deux, six et 12 heures après avoir changé le média. L’induction de la protéine Cas9 a été confirmée par des niveaux d’expression similaires entre les cellules transduies et le véhicule, malgré la présence ou l’absence de Shield-1.Il y a une induction suffisante de l’expression de Cas9 dans la lignée cellulaire A549 transduite deux heures après le traitement par Shield-1, qui devient négligeable dans les six à 12 heures suivant le retrait de Shield-1. Le nombre de cellules A549 transduisons par Shield-1 a diminué après 48 heures sans affecter l’échantillon de Rinella, ce qui a été validé par immunoblotting à l’aide d’un anticorps contre la protéine RPA3 appauvrie. L’inversion de l’édition de gènes ou les mutations de l’indel ont été confirmées à l’aide de tests de nucléases d’arpenteur.La construction du vecteur lentivirus conçue était un système bicistronique portant un autre gène d’intérêt sous le même promoteur EF-1a. Une protéine fluorescente modifiée, P2A, a été ajoutée pour tracer les cellules infectées. L’expression de la protéine mVenus a été observée dans le véhicule et les cellules transduies A549, indépendamment de l’expression DD-Cas9 et du traitement Shield-1.La transduction efficace de la lignée cellulaire avec le vecteur DD-Cas9 est l’une des étapes limitant le débit, pour avoir des cellules HEK293T saines et utiliser leur faible nombre de passage est crucial. L’optimisation du rapport entre le plasmide DD-Cas9, le plasmide d’emballage et le plasmide d’enveloppe est très importante pour une transfection optimale. Mais à côté, la quantité de Shield-1 nécessaire pour stabiliser les cellules cibles DD-Cas9 est également quelque chose dont vous devez faire attention.Le DD-Cas9 avec le plasmide Cre est également disponible, et il peut être utilisé pour étudier les interactions génétiques dans des études in vivo basées sur le système Cre-lox.

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

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Mapping QTL et édition CRISPR / Cas9 pour identifier un gène de résistance aux médicaments<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Recherche

Génétique

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Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

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Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

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