Name: a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization
Uploaded: 2021-09-02T13:00:00
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Wir danken den früheren Mitgliedern unseres Labors und Wissenschaftler Serif Senturk für die bisherige Arbeit. Wir danken Danilo Segovia für die kritische Lektüre dieses Manuskripts. Diese Studie war möglich und wurde von Swim Across America und dem National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center-Programm unterstützt.

1.Der DD-Cas9-Vektor
<ol><li>Erhalten Sie den DD-Cas9-Vektor von Addgene (DD-Cas9 mit Füllstoffsequenz und Venus (EDCPV), Plasmid 90085). HINWEIS: Dies ist ein lentivirales DD-Cas9-Plasmid mit einem U6-Promotor, der die Single-Guide-RNA (sgRNA)-Transkription antreibt, während der EFS-Promotor die DD-Cas9-Transkription antreibt. Die DYKDDDDK-Sequenz (Flag-Tag) ist am C-Terminal von Cas9 vorhanden, gefolgt von einem selbstspaltenden 2A-Peptid (P2A), das DD-Cas9 und das modifizierte fluoreszierende Protein Venus (mVe...

<ol>
	<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats+(CRISPRs):+the+hallmark+of+an+ingenious+antiviral+defense+mechanism+in+prokaryotes.">Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes.</a> Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+reversible,+and+tunable+method+to+regulate+protein+function+in+living+cells+using+synthetic+small+molecules.">A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules.</a> Cell. 126, 995-1004 (2006).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+split-Cas9+enzyme+complex.">Rational design of a split-Cas9 enzyme complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).</li><li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lentiviral+Packaging+Mixes+and+Producer+Cell+Lines+for+RNAi+Applications.">Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications.</a> Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).</li><li>Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Protein+Stabilization+In+Vivo+Mediated+by+Shield-1+in+Transgenic+Medaka.">Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka.</a> PLOS One. , (2015).</li><li>Sellmyer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+context+affects+levels+of+a+chemically+dependent+destabilizing+domain.">Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain.</a> PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).</li><li>Iwamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+chemical+method+to+regulate+protein+stability+in+the+mammalian+central+nervous+system.">A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system.</a> Chemistry &amp; Biology. 17 (9), 981-988 (2010).</li><li>Tai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+domains+mediate+reversible+transgene+expression+in+the+brain.">Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain.</a> PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).</li><li>Auffenberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+and+reversible+inhibition+of+neurons+and+circuits+by+small+molecule+induced+potassium+channel+stabilization.">Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization.</a> Scientific Reports. 6, 19293 (2016).</li></ol>

Die CRISPR/Cas9-Technologie hat die Fähigkeit zur funktionellen Abfrage von Genomen revolutioniert2. Die Inaktivierung von Genen führt jedoch häufig zu Zellletalität, funktionellen Defiziten und Entwicklungsdefekten, was den Nutzen solcher Ansätze für die Untersuchung von Genfunktionen einschränkt7. Darüber hinaus kann die konstitutive Expression von Cas9 zu Toxizität und der Erzeugung von Off-Target-Effekten führen6. Es wurden verschiedene...

CRISPR-Cas9, das für"clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9"steht,wurde erstmals im Rahmen von Studien zur bakteriellen adaptiven Immunität1,2entdeckt. Heute ist CRISPR/Cas9 das bekannteste Werkzeug für programmierbare Genbearbeitung und verschiedene Iterationen des Systems wurden entwickelt, um transkriptionelle und epigenetische Modulationen zu ermöglichen3. Diese Technologie ermöglicht die hochpräzise genetische Manipulation nahezu jeder DNA-Sequenz4.
Die wesentlichen Bestandteile jeder CRISPR-Genbearbeitung sind eine anpassbare Guide-RNA-Sequenz und die Cas9-Nuklease5. Der RNA-Guide bindet an die zielprolementarische Sequenz in der DNA und weist die Cas9-Nuklease an, an einem bestimmten Punkt im Genom einen Doppelstrangbruch durchzuführen3,4. Die resultierende Spaltstelle wird dann durch nicht-homologe Endfügung (NHEJ) oder homologiegerichtete Reparatur (HDR) repariert, mit der daraus resultierenden Einführung von Veränderungen in der zielgerichteten DNA-Sequenz5.
CRISPR/Cas9-basierte Genbearbeitung ist einfach zu bedienen und relativ kostengünstig im Vergleich zu früheren Gen-Editing-Techniken und hat sich in einer Vielzahl von Systemen als effizient und robusterwiesen 2,4,5. Das System stellt jedoch einige Einschränkungen dar. Es wurde oft gezeigt, dass die konstitutive Expression von Cas9 zu einer erhöhten Anzahl von Off-Targets und einer hohen Zelltoxizitätführt 4,6,7,8. Darüber hinaus nimmt das konstitutive Targeting von essentiellen und Zellüberlebensgenen durch Cas9 seine Fähigkeit, bestimmte Arten von funktionellen Studien wie kinetische Studien des Zelltods durchzuführen7.
Verschiedene induzierbare oder bedingt gesteuerte CRISPR-Cas9-Tools wurden entwickelt, um diese Probleme zu lösen6, wie Tet-ON und Tet-Off9; standortspezifische Rekombination10; chemisch induzierte Nähe11; inteinabhängiges Spleißen3; und 4-Hydroxytamoxifen Östrogenrezeptor (ER) basierte kerne Lokalisationssysteme12. Im Allgemeinen bieten die meisten dieser Verfahren (Intein-Spleißen und chemisch induzierte Proximity-Split-Systeme) keine reversible Kontrolle, zeigen eine sehr langsame kinetische Reaktion auf die medikamentöse Behandlung (Tet-On/Off-System) oder sind für Hochdurchsatzmanipulationen nicht zugänglich6.
Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir ein neuartiges Toolkit entwickelt, das nicht nur eine schnelle und robuste zeitgesteuerte Genbearbeitung ermöglicht, sondern auch Rückverfolgbarkeit, Abstimmbarkeit und Zugänglichkeit zur Genmanipulation mit hohem Durchsatz gewährleistet. Diese neuartige Technologie kann in Zelllinien, Organoiden und Tiermodellen eingesetzt werden. Unser System basiert auf einer entwickelten Domäne, die, wenn sie mit Cas9 verschmolzen ist, ihren schnellen Abbau induziert. Es kann jedoch schnell mit einem hochselektiven, ungiftigen, zelldurchlässigen kleinen Molekül stabilisiert werden. Genauer gesagt haben wir die humane FKBP12-Mutante "destabilisierende Domäne" (DD) zu Cas9 entwickelt und Cas9 für einen schnellen und konstitutiven Abbau über das Ubiquitin-Proteasom-System markiert, wenn es in Säugetierzellen exprimiert wird13. Der synthetische DD-Ligand Shield-1 kann die DD-Konformation stabilisieren und dadurch den Abbau von proteinen, die mit DD verschmolzen sind (wie Cas9), auf sehr effiziente Weise und mit einer schnellen kinetischen Reaktion verhindern14,15. Bemerkenswert ist, dass Shield-1 mit drei Größenordnungen enger an die Mutante FKBP12 bindet als an sein Wildtyp-Gegenstück14.
Das DD-Cas9/Shield-1-Paar kann verwendet werden, um die systematische Identifizierung und Charakterisierung essentieller Gene in kultivierten Zellen und Tiermodellen zu untersuchen, wie wir zuvor gezeigt haben, indem wir bedingt auf das CypD-Gen abzielen, das eine wichtige Rolle im Stoffwechsel der Mitochondrien spielt; EGFR, ein wichtiger Akteur in der onkogenen Transformation; und Tp53, ein zentrales Gen in der DNA-Schadensreaktion. Neben der zeitlich und bedingt kontrollierten Genbearbeitung besteht ein weiterer Vorteil der Methode darin, dass die Stabilisierung von DD-Cas9 unabhängig von seiner Transkription erfolgt. Diese Eigenschaft ermöglicht die Co-Expression von rückverfolgbaren Markern sowie Rekombinasen, wie der Östrogenrezeptor-abhängigen Rekombinase, CREER,unter dem gleichen Promotor. In dieser Arbeit zeigen wir, wie unsere Methode in vitro erfolgreich eingesetzt werden kann, um beispielsweise das DNA-Replikationsgen RPA3 bedingt anzusprechen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100mM DTT</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X FastDigest buffer</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>B64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 Ligation Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorimetric BCA kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, glutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>EF0654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest BsmBI</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>FD0454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag [M2] mouse mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR &#38; Gel Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibodies</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shield-1</td>
			<td>Cheminpharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 competent bacterial cells</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURVEYOR Mutation Detection Kit</td>
			<td>Transgenomic/IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin [DM1A] mouse mAb</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CP06-100UG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization

Die CRISPR/Cas9-Technologie (CRISPR-) (Clustered Short Palindromic Repeat- 9) ist zu einem weit verbreiteten Laborwerkzeug geworden, um genaue und gezielte Modifikationen im Genom einzuführen. Seine enorme Popularität und schnelle Verbreitung werden auf seine einfache Bedienung und Genauigkeit im Vergleich zu seinen Vorgängern zurückgeführt. Die konstitutive Aktivierung des Systems hat jedoch nur begrenzte Anwendungen. In diesem Artikel beschreiben wir eine neue Methode, die eine zeitliche Kontrolle der CRISPR/Cas9-Aktivität basierend auf der bedingten Stabilisierung des Cas9-Proteins ermöglicht. Die Verschmelzung einer engineered Mutante des Rapamycin-bindenden Proteins FKBP12 mit Cas9 (DD-Cas9) ermöglicht den schnellen Abbau von Cas9, der wiederum durch das Vorhandensein eines synthetischen FKBP12-Liganden (Shield-1) stabilisiert werden kann. Im Gegensatz zu anderen induzierbaren Methoden kann dieses System leicht angepasst werden, um bi-cistronische Systeme zu erzeugen, um DD-Cas9 mit einem anderen Gen von Interesse zu koexprimieren, ohne bedingte Regulation des zweiten Gens. Diese Methode ermöglicht die Generierung rückverfolgbarer Systeme sowie die parallele, unabhängige Manipulation von Allelen, auf die die Cas9-Nuklease abzielt. Die Plattform dieser Methode kann für die systematische Identifizierung und Charakterisierung essentieller Gene und die Abfrage der funktionellen Interaktionen von Genen in in vitro und in vivo Settings genutzt werden.

Um die bedingte Expression von Cas9 zu ermöglichen, entwickelten wir ein duales lentivirales Vektorkonstrukt, bestehend aus einem U6-getriebenen Promotor zur konstitutiven Expression von sgRNA und einem EF-1α-Kernpromotor, um die Expression des DD-Cas9-Fusionsproteins voranzutreiben (Abbildung 1A)19. Als Paradigma zur Veranschaulichung der Robustheit und Effizienz des Systems haben wir die lungenkarzinomale A549-Zelllinie mit dem len...

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A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization

Hier beschreiben wir ein Genom-Editing-Tool, das auf der zeitlichen und bedingten Stabilisierung des geclusterten, regelmäßig interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) assoziierten Proteins 9 (Cas9) unter dem kleinen Molekül Shield-1 basiert. Die Methode kann für kultivierte Zellen und Tiermodelle verwendet werden.

Ein neues Toolkit zur Bewertung von Genfunktionen mit bedingter Cas9-Stabilisierung

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associated protein 9 (CRISPR/Cas9) technology has become a prevalent laboratory ...

Diese Methode ermöglicht eine schnelle, temperaturgesteuerte CRISPR-Cas9-Genbearbeitung unter einem kleinen Molekül, Shield-1. Es bietet auch weniger Off-Target-Effekte, eine geringere Zelltoxizität und auch eine höhere intern kontrollierte Genbearbeitung, wenn man es mit der konstitutiven Aktivierung von Cas9 vergleicht. Der Hauptvorteil dieses Partikels besteht darin, dass es zur Charakterisierung essentieller Gene sowie tumorüberlebender Gene verwendet werden kann.Die Destabilisierung von DD-Cas9 ist unabhängig von seiner Expression, und dies ermöglicht es, das interessierende Gen unter demselben Promotor co-exprimiert zu werden. Diese Methode kann leicht auf In-vivo- und In-vitro-Studien angewendet werden. Shield-1 kann auch durch die Blut-Hirn-Schranke eindringen, was es auch einfach macht, Gene zu untersuchen, die an der Gehirnentwicklung beteiligt sind.Säen Sie gesunde HEK293T-Zellen gleichmäßig mit einer Dichte von ein bis zwei Millionen Zellen pro 10-Zentimeter-Gewebekulturplatte aus, indem Sie 10 Milliliter Glukose-DMEM mit 10% gefiltertem FBS verwenden. Inkubieren Sie die Zellen im Gewebekultur-Inkubator bei 5% Kohlendioxid und 37 Grad Celsius für 20 Stunden. Bestätigen Sie am nächsten Tag, dass die Zellen durch Hellfeldmikroskopie eine Konfluenz von 70% erreicht haben und gleichmäßig über die Platte verteilt sind.Wechseln Sie die Medien eine Stunde vor der Transfektion mit einem Endvolumen von 10 Millilitern. Bereiten Sie zwei Röhrchen mit 500 Mikrolitern warmer Medien vor. Fügen Sie 25 Mikroliter Transfektionsreagenz in die einse Röhre hinzu und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.Zu der anderen Tube eine Mischung aus Plasmiden hinzufügen. Mischen Sie Rohr eins mit Rohr zwei, um eine Transfektionsmischung zu bilden, und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Fügen Sie die Transfektionsmischung tropfenweise zu den HEK293T-Zellen hinzu und inkubieren Sie die Platte im Gewebekulturinkubator.Wechseln Sie das Medium nach 18 Stunden vorsichtig in 10 Milliliter frisches DMEM mit 10% FBS, um das Transfektionsreagenz zu entfernen. Inkubieren Sie die Zellen für die nächsten 48 Stunden. Nach 48 Stunden den Überstand mit einer 10-Milliliter-Spritze sammeln und durch einen 0,45-Mikrometer-Filter leiten.Aliquot den Virusüberstand und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius. Zur Bestimmung des Virustiters säen Sie 5 Millionen HEK293T-Zellen pro Vertiefung in zwei Sechs-Well-Platten. Inkubieren Sie beide Platten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid über Nacht, um 50 bis 60% Konfluenz zu erreichen.Verwenden Sie am nächsten Tag eine der Sechs-Well-Platten, um die Zellen in den sechs Wells zu zählen. Tauen Sie das Virus-Aliquot auf, das zur Durchführung der seriellen Verdünnung verwendet wird, und fügen Sie acht Mikrogramm pro Milliliter Polybrenagenz hinzu, bereiten Sie DMEM mit 10% FBS für die serielle Verdünnung des Virus vor und fügen Sie das Polybren-Reagenz hinzu. Zwei Milliliter zehnfacher serieller Verdünnungen des Lentivirus von 0,1 bis 0,0001 in Polybren enthaltenden Medien vorbereiten.Entfernen Sie medien von der Sechs-Well-Platte und fügen Sie den Wells einen Milliliter virale Verdünnungen hinzu, wobei eine Vertiefung mit Medien allein als Negativkontrolle und eine Vertiefung mit 100% Virus übrig bleibt. Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden. Entfernen Sie am nächsten Tag das Medium mit dem Virus von den Sechs-Well-Platten und wechseln Sie es in zwei Milliliter frisches DMEM mit 10% FBS.Inkubieren Sie die Zellen für 48 bis 72 Stunden und beobachten Sie GFP jeden Tag mit einem Fluoreszenzmikroskop. Nach 48 bis 72 Stunden die Zellen ablösen und in maximalem Puffer wieder aufbringen. Verwenden Sie ein Durchflusszytometer, um den Prozentsatz der GFP-Expression zu bestimmen und den Virustiter mit der im Textmanuskript angegebenen Formel zu berechnen.Platten Sie die Zelllinie von Interesse in einer 10 Zentimeter großen Platte und inkubieren Sie über Nacht, um eine Konfluenz von 50 bis 60% zu erreichen Dann infizieren Sie die Zellen mit 500 bis 2.000 Mikrolitern Viruspartikeln in einem 10 Milliliter Gesamtvolumen des Kulturmediums. Inkubieren Sie die viralen Medien für 24 Stunden. Wechseln Sie am nächsten Tag die viralen Medien in Nährmedien und bestimmen Sie den Prozentsatz der GFP-positiven Zellen mithilfe der Durchflusszytometrie.Wählen Sie GFP-positive Zellen aus, indem Sie BD FACSAria II für die Zellsortierung verwenden. Erweitern Sie positiv ausgewählte Zellen und frieren Sie den Bestand ein. Platten Sie die positiv ausgewählten Zellen und nicht übertragenen Zellen in 12-Well-Platten separat, 24 Stunden nach der Infektion.Warten Sie, bis sich die Zellen anlagern, und wechseln Sie das Medium in Zellkulturmedien mit 200 nanomolaren Shield-1. Ersetzen Sie die Medien in den Platten durch transduzierte und untransduzierte Zellen, so dass zwei Vertiefungen pro Platte mit regulären Medien als Negativkontrolle übrig bleiben. Inkubieren und extrahieren Sie Proteine aus jeder Vertiefung bei Null, zwei, sechs, 12, 24, 48 und 72 Stunden nach Zugabe von Shield-1 zu den Vertiefungen.Entfernen Sie dann das Medium mit Shield-1 aus den restlichen Vertiefungen und wechseln Sie es gegen normale Zellmedien. Sammeln Sie die Proteine aus diesen Vertiefungen zwei, sechs und 12 Stunden nach dem Medienwechsel. Die Induktion des Cas9-Proteins wurde dadurch bestätigt, dass seine Expressionsniveaus zwischen den transduzierten Zellen und dem Vehikel ähnlich waren, ungeachtet des Vorhandenseins oder Fehlens von Shield-1.Zwei Stunden nach der Behandlung mit Shield-1 liegt eine ausreichende Induktion der Cas9-Expression in der transduzierten A549-Zelllinie vor, die innerhalb von sechs bis 12 Stunden nach Demtzug von Shield-1 vernachlässigbar wird. Shield-1-behandelte transduzierte A549-Zellen nahmen nach 48 Stunden an Zahl ab, ohne die Rinella-Probe zu beeinträchtigen, die durch Immunblotting mit einem Antikörper gegen das erschöpfte RPA3-Protein validiert wurde. Gen-Editing-Inversion oder Indel-Mutationen wurden mit Surveyor-Nuklease-Assays bestätigt.Das entworfene Lentivirus-Vektorkonstrukt war ein bicistronisches System, das ein anderes Gen von Interesse unter demselben EF-1a-Promotor trug. Ein modifiziertes fluoreszierendes Protein, P2A, wurde hinzugefügt, um infizierte Zellen zu verfolgen. Die Expression des mVenus-Proteins wurde in den Vehikel- und A549-transduzierten Zellen beobachtet, unabhängig von der DD-Cas9-Expression und der Shield-1-Behandlung.Die effiziente Transduktion der Zelllinie mit dem DD-Cas9-Vektor ist einer der geschwindigkeitsbegrenzenden Schritte, um gesunde HEK293T-Zellen zu haben und ihre niedrige Durchgangszahl zu nutzen. Die Optimierung des Verhältnisses zwischen DD-Cas9 Plasmid, Verpackungsplasmid und Hüllplasmid ist sehr wichtig für eine optimale Transfektion. Aber daneben ist auch die Menge an Shield-1, die benötigt wird, um DD-Cas9-Zielzellen zu stabilisieren, etwas, auf das Sie achten müssen.Das DD-Cas9 mit dem Cre-Plasmid ist ebenfalls erhältlich und kann verwendet werden, um die genetischen Interaktionen in In-vivo-Studien auf basis des Cre-lox-Systems zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping und CRISPR / Cas9 Bearbeitung zur Identifizierung eines Drug Resistance Gen in<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Forschung

Genetik

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Mikroinjektion CRISPR/Cas9 Protein in Channel Catfish, Ictalurus Punctatus, Embryonen für Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Ein Protokoll für die Produktion der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren für CRISPR/Cas9-vermittelte Gen Knockout in teilenden Zellen

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effiziente Produktion und Kennzeichnung der CRISPR/Cas9 generiert gen Knockouts im Modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung zu machen bedingte Mutanten der menschlichen Malaria-Parasiten p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...