Name: a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization
Uploaded: 2021-09-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization at JoVE.com

אנו מודים לחברים קודמים במעבדה שלנו ולמדען שלנו, סריף סנטרק, על עבודה קודמת. אנו מודים לדנילו סגוביה שקרא את כתב היד הזה בביקורתיות. מחקר זה היה אפשרי ונתמך על ידי לשחות ברחבי אמריקה ואת המכון הלאומי לסרטן היעד גילוי ופיתוח תוכנית.

1.וקטור DD-Cas9
<ol><li>להשיג וקטור DD-Cas9 מ Addgene (DD-Cas9 עם רצף מילוי ונוגה (EDCPV), Plasmid 90085). הערה: זהו פלסמיד DD-Cas9 lentiviral עם מקדם U6 שמניע את תמלול ה- RNA המדריך היחיד (sgRNA) בעוד מקדם EFS מניע את תמלול DD-Cas9. רצף DYKDDDDK (תג דגל) נמצא בטרמינל C של Cas9 ואחריו פפטיד 2A עם מחשוף עצמי (P2A) המפריד בין DD-Cas9 לבין חלבון פלואורסצנטי...

<ol>
	<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats+(CRISPRs):+the+hallmark+of+an+ingenious+antiviral+defense+mechanism+in+prokaryotes.">Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes.</a> Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CRISPR-Cas9+genome+engineering:+lessons+learned+from+RNA+interference.">Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference.</a> Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).</li><li>Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Inducible+CRISPR/Cas+Systems.">Drug Inducible CRISPR/Cas Systems.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).</li><li>Wade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Silencing+Using+the+CRISPR-Cas9+System:+A+Review+of+the+Benefits+and+Challenges.">High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).</li><li>Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-switchable+substrates+for+a+ubiquitin-proteasome+system.">Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+efficient+inducible+CRISPR/Cas9+platform+with+improved+specificity+for+multiple+gene+targeting.">An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting.</a> Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).</li><li>Oakes, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+engineering+hotspots+identifies+an+allosteric+CRISPR-Cas9+switch.">Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch.</a> Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+protein+tagging+in+cells+with+split+fluorescent+protein.">Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein.</a> Nature Communications. 7, 11046 (2016).</li><li>Roper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+and+organoid+transplantation+models+of+colorectal+cancer+and+metastasis.">In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis.</a> Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).</li><li>Chu, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+with+FKBP-derived+destabilizing+domains.">Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+control+of+protein+stability+and+function+in+living+mice.">Chemical control of protein stability and function in living mice.</a> Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+reversible,+and+tunable+method+to+regulate+protein+function+in+living+cells+using+synthetic+small+molecules.">A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules.</a> Cell. 126, 995-1004 (2006).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing.">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+CRISPR/Cas9-induced+mutant+screening.">A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening.</a> Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).</li><li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification.">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).</li><li>Senturk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+tunable+method+to+temporally+control+gene+editing+based+on+conditional+Cas9+stabilization.">Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization.</a> Nature Communications. 8, 14370 (2017).</li><li>McJunkin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+suppression+of+an+essential+gene+in+adult+mice+using+transgenic+RNA+interference.">Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).</li><li>Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-triggered+Cas9+protein+with+improved+genome-editing+specificity.">Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity.</a> Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).</li><li>Dow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).</li><li>Wright, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+split-Cas9+enzyme+complex.">Rational design of a split-Cas9 enzyme complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).</li><li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lentiviral+Packaging+Mixes+and+Producer+Cell+Lines+for+RNAi+Applications.">Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications.</a> Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).</li><li>Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Protein+Stabilization+In+Vivo+Mediated+by+Shield-1+in+Transgenic+Medaka.">Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka.</a> PLOS One. , (2015).</li><li>Sellmyer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+context+affects+levels+of+a+chemically+dependent+destabilizing+domain.">Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain.</a> PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).</li><li>Iwamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+chemical+method+to+regulate+protein+stability+in+the+mammalian+central+nervous+system.">A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system.</a> Chemistry &amp; Biology. 17 (9), 981-988 (2010).</li><li>Tai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+domains+mediate+reversible+transgene+expression+in+the+brain.">Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain.</a> PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).</li><li>Auffenberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+and+reversible+inhibition+of+neurons+and+circuits+by+small+molecule+induced+potassium+channel+stabilization.">Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization.</a> Scientific Reports. 6, 19293 (2016).</li></ol>

טכנולוגיית CRISPR/Cas9 חוללה מהפכה ביכולת לחקור באופן פונקציונלי גנומים2. עם זאת, חוסר הפעילות של גנים לעתים קרובות גורם קטלניות התא, ליקויים תפקודיים, פגמים התפתחותיים, הגבלת התועלת של גישות כאלה לחקרפונקציות גנים 7. בנוסף, ביטוי ממהווה את Cas9 עלול לגרום לרעילות וליציר...

CRISPR-Cas9 אשר מייצג "מקובצים באופן קבוע interspaced קצר פלינדרומי חוזר חלבון הקשורים 9" התגלה לראשונה כחלק ממחקרים עלחסינותאדפטיבית חיידקית 1,2. כיום, CRISPR/ Cas9 הפך לכלי המוכר ביותר לעריכת גנים הניתנת לתכנות ואיטרציות שונות של המערכת פותחו כדי לאפשר אפנון תמלול ואפיגנטי3. טכנולוגיה זו מאפשרת מניפולציה גנטית מדויקת ביותר של כמעט כל רצף של DNA4.
הרכיבים החיוניים של כל עריכת גנים CRISPR הם רצף RNA מדריך להתאמה אישית ואת נוקלאז Cas95. מדריך הרנ"א נקשר לרצף המשלים את המטרה בדנ"א, ומכוון את גרעין Cas9 לבצע שבירה כפולה בנקודה מסוימת בגנום3,4. אתר המחשוף המתקבל מתוקן לאחר מכן על ידי צירוף קצה לא הומולוגי (NHEJ) או תיקון מונחה ההומולוגיה (HDR), עם כניסתם של שינויים ברצף ה- DNA הממוקד5.
עריכת גנים מבוססת CRISPR/Cas9 היא קלה לשימוש, וזולה יחסית לטכניקות קודמות לעריכתגניםוהיא הוכחה כיעילה וחזקה בריבוי מערכות 2,4,5. עם זאת, המערכת מציגה כמה מגבלות. הביטוי המכונן של Cas9 הוכח לעתים קרובות כתוצאה של מספר מוגבר של מטרות מחוץ למטרות ורעילות תאים גבוהה4,6,7,8. בנוסף, מיקוד המכונן של גנים חיוניים והישרדות תאים על ידי Cas9 לוקח את יכולתו לבצע סוגים מסוימים של מחקרים פונקציונליים כגון מחקרים קינטיים של מוות תאים7.
כלי CRISPR-Cas9 שונים, שאינם ניתנים לערעור או מבוקרים מותנית, פותחו כדי לטפל בבעיות6, כגון Tet-ON ו-Tet-Off9; רקומבינציה ספציפית לאתר10; קרבה כימית11; intein תלוי splicing3; ו 4-Hydroxytamoxifen אסטרוגן קולטן (ER) מבוסס מערכות לוקליזציה גרעינית12. באופן כללי, רוב ההליכים האלה (חיבור intein ומערכות פיצול קרבה המושרה כימית) אינם מציעים שליטה הפיכה, מציגים תגובה קינטית איטית מאוד לטיפול תרופתי (מערכת Tet-On/Off), או אינם מקובלים על מניפולציה בתפוקה גבוהה6.
כדי להתמודד עם מגבלות אלה פיתחנו ערכת כלים חדשנית שלא רק מספקת עריכת גנים מהירה וחזקה הנשלטת על ידי הזמן, אלא גם מבטיחה עקיבות, יכולת טונה וזמינות למניפולציה גנטית בתפוקה גבוהה. טכנולוגיה חדשנית זו יכולה לשמש קווי תאים, organoids, ומודלים בעלי חיים. המערכת שלנו מבוססת על תחום מהונדס, כאשר מותך Cas9, זה גרים השפלה מהירה שלה. עם זאת, ניתן לייצב אותו במהירות עם מולקולה קטנה סלקטיבית מאוד, לא רעילה, חדירת לתא. ליתר דיוק, הנדסנו את המוטציה האנושית FKBP12 "תחום מערער" (DD) ל- Cas9, מסמנת את Cas9 להשפלה מהירה ומהורכבת באמצעות מערכת אוביקוויטין-פרוטאזום כאשר היא באה לידי ביטוי בתאי יונקים13. ליגנד סינתטי DD, Shield-1 יכול לייצב את התאמת DD, ובכך למנוע את השפלה של חלבונים הותכו DD (כגון Cas9) בצורה יעילה מאוד, ועם תגובה קינטית מהירה14,15. שימו לב, מגן-1 נקשר עם שלושה סדרי גודל הדוקים יותר ל- FKBP12 המוטנטי מאשר למקבילו הפראי14.
ניתן להשתמש בזוג DD-Cas9/Shield-1 כדי לחקור את הזיהוי והאפיון השיטתיים של גנים חיוניים בתאים מתורבתים ומודלים של בעלי חיים כפי שהראנו בעבר על ידי מיקוד מותנה בגן CypD, הממלא תפקיד חשוב בחילוף החומרים של המיטוכונדריה; EGFR, שחקן מפתח בטרנספורמציה אונקוגנית; ו Tp53, גן מרכזי בתגובת נזק DNA. בנוסף לעריכת גנים מבוקרת זמנית ומותנית, יתרון נוסף של השיטה הוא שהתייצבות DD-Cas9 אינה תלויה בתעתיק שלה. תכונה זו מאפשרת ביטוי משותף, תחת אותו מקדם, של סמנים למעקב, כמו גם רקומבינסות, כגון רקומבינאז תלוי קולטן אסטרוגן, CREER. בעבודה זו, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בשיטה שלנו בהצלחה במבחנה, כדי למקד באופן מותנה למשל, גן שכפול DNA, RPA3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100mM DTT</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X FastDigest buffer</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>B64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 Ligation Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorimetric BCA kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, glutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>EF0654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest BsmBI</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>FD0454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag [M2] mouse mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR &#38; Gel Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibodies</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shield-1</td>
			<td>Cheminpharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 competent bacterial cells</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURVEYOR Mutation Detection Kit</td>
			<td>Transgenomic/IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin [DM1A] mouse mAb</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CP06-100UG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization

טכנולוגיית החלבון 9 (CRISPR/Cas9) המשויכת באופן קבוע לתחביבים קצרים הפכה לכלי מעבדה נפוץ כדי להציג שינויים מדויקים וממוקדים בגנום. הפופולריות העצומה שלה והתפשטות מהירה מיוחסים לשימושו הקל ודיוק בהשוואה לקודמיו. עם זאת, ההפעלה המכוננת של המערכת מוגבלת. במאמר זה, אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת שליטה זמנית של פעילות CRISPR/Cas9 המבוססת על ייצוב מותנה של חלבון Cas9. היתוך מוטציה מהונדסת של חלבון מחייב rapamycin FKBP12 ל- Cas9 (DD-Cas9) מאפשר השפלה מהירה של Cas9 כי בתורו ניתן לייצב על ידי נוכחות של ליגנד סינתטי FKBP12 (מגן-1). שלא כמו שיטות לא מובלות אחרות, ניתן להתאים מערכת זו בקלות כדי ליצור מערכות דו-ציסטרוניות לבטא DD-Cas9 עם גן אחר של עניין, ללא ויסות מותנה של הגן השני. שיטה זו מאפשרת ייצור מערכות הניתנות למעקב, כמו גם מניפולציה מקבילה ועצמאית של אללים הממוקדים על ידי נוקלאז Cas9. הפלטפורמה של שיטה זו יכולה לשמש לזיהוי ואפיון שיטתיים של גנים חיוניים וחקירת האינטראקציות התפקודיות של הגנים בהגדרות במבחנה וב- vivo.

כדי לאפשר את הביטוי המותנה של Cas9, פיתחנו מבנה וקטורי עדשותי כפול המורכב ממקדם מונחה U6 לבטא באופן מרכיב sgRNA, ומקדם ליבה EF-1α כדי להניע את הביטוי של חלבון ההיתוך DD-Cas9 (איור 1A)19. כפרדיגמה להמחשת החוסן והיעילות של המערכת, הטרנסנו את קו התאים A549 הקרצי?...

Watch this Scientific Journal Video about A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization at JoVE.com

A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization

כאן, אנו מתארים כלי לעריכת גנום המבוסס על ייצוב זמני ומותנה של מקובצים באופן קבוע בין-חללים קצרים פלינדרומיים חוזרים- (CRISPR-) חלבון הקשורים 9 (Cas9) תחת המולקולה הקטנה, Shield-1. השיטה יכולה לשמש לתאים בתרבית ומודלים של בעלי חיים.

ערכת כלים חדשה להערכת פונקציות גנים באמצעות ייצוב מותנה של Cas9

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associated protein 9 (CRISPR/Cas9) technology has become a prevalent laboratory ...

שיטה זו מספקת עריכת גנים CRISPR-Cas9 מהירה ומבוקרת בטמפרטורה תחת מולקולה קטנה, Shield-1. הוא גם מציע פחות אפקטים מחוץ למטרה, רעילות תאים נמוכה יותר, וגם עריכת גנים מבוקרת פנימית גבוהה יותר כאשר משווים אותו להפעלה מכוננת של Cas9. היתרון העיקרי של חלקיק זה הוא כי זה יכול לשמש לאפיון של גנים חיוניים, כמו גם גנים הישרדות הגידול.חוסר היציבות של DD-Cas9 אינו תלוי בביטויו, וזה מאפשר לגן העניין להתבטא במשותף תחת אותו מקדם. שיטה זו יכולה להיות מיושמת בקלות במחקרי in vivo ו אין ויטרו. מגן-1 יכול גם לחדור דרך מחסום הדם - מוח, מה שמקל גם על חקר גנים המעורבים בהתפתחות המוח.זרע באופן שווה תאי HEK293T בריאים בצפיפות של אחד עד שני מיליון תאים לכל צלחת תרבית רקמות 10 ס"מ באמצעות 10 מיליליטר של DMEM גלוקוז עם 10% FBS מסונן. לדגור על התאים באינקובטור תרבית הרקמות ב-5% פחמן דו-חמצני ו-37 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות. למחרת, לאשר כי התאים הגיעו 70% השפעה על ידי מיקרוסקופיה Brightfield וכי הם מפוזרים באופן שווה על פני הצלחת.שנה מדיה שעה לפני ההדבקה בנפח סופי של 10 מיליליטר. הכן שני צינורות עם 500 מיקרוליטרים של מדיה חמה. הוסף 25 מיקרוליטרים של ריאגנט transfection לצינור אחד, ודגר בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.לצינור השני, מוסיפים תערובת של פלסמידים. מערבבים צינור אחד עם צינור שני כדי ליצור תערובת transfection, ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. מוסיפים את תערובת הטרנספקטים טיפה לתרבות HEK293T ודגר את הצלחת באינקובטור תרבית הרקמות.לאחר 18 שעות, בזהירות לשנות את המדיה ל 10 מיליליטר של DMEM טרי עם 10% FBS כדי להסיר את ריאגנט transfection. לדגור על התאים במשך 48 השעות הבאות. לאחר 48 שעות, לאסוף את supernatant עם מזרק 10 מיליליטר ולהעביר אותו דרך מסנן 0.45 מיקרומטר.Aliquot הווירוס supernatant ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס. לקביעת טיטר וירוס, זרע 5 מיליון HEK293T תאים לכל באר לתוך שתי לוחות שש באר. לדגור על שני הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני בן לילה כדי להגיע 50 עד 60% השפעה.למחרת, השתמש באחת מלוחות ששת הבארות כדי לספור את התאים בשש הבארות. להפשיר את aliquot הווירוס שישמש לביצוע דילול סדרתי ולהוסיף שמונה מיקרוגרם למיליליטר של ריאגנט polybrene, להכין DMEM עם 10%FBS עבור דילול סדרתי של הנגיף, ולהוסיף ריאגנט polybrene. הכן שני מיליליטר של דילול סדרתי פי עשרה של lentivirus מ 0.1 ל 0.0001 בפוליברן המכיל מדיה.הסר מדיה מן הצלחת שש טוב ולהוסיף מיליליטר אחד של דילול ויראלי לבארות, משאיר אחד היטב עם מדיה לבד כמו שליטה שלילית אחד היטב עם 100% וירוס. לדגור על התאים במשך 24 שעות. למחרת, להסיר את התקשורת עם הנגיף מן שש בארות צלחות ולשנות אותו לשני מיליליטר של DMEM טרי עם 10% FBS.לדגור על התאים במשך 48 עד 72 שעות, התבוננות GFP עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי כל יום. לאחר 48 עד 72 שעות, לנתק את התאים ו resuspend אותם במאגר המרבי. השתמש בציטומטר זרימה כדי לקבוע את אחוז ביטוי GFP ולחשב את טיטר הווירוס באמצעות הנוסחה שניתנה בכתב היד של הטקסט.צלחת קו התא של עניין צלחת 10 ס"מ ודגרה לילה כדי להגיע למפגש של 50 עד 60%ואז להדביק את התאים עם 500 עד 2, 000 microliters של חלקיקי וירוס בנפח כולל של 10 מיליליטר של מדיום תרבות. לדגור על התקשורת הוויראלית במשך 24 שעות. למחרת, שנה את המדיה הוויראלית למדיית תרבות, וקבע את אחוז התאים החיוביים של GFP באמצעות ציטומטריית זרימה.בחר תאים חיוביים של GFP באמצעות BD FACSAria II למיון תאים. הרחב תאים שנבחרו באופן חיובי והקפיא את המלאי. צלחת התאים שנבחרו באופן חיובי ותאים untransduced ב 12-well לוחות בנפרד, 24 שעות לאחר ההדבקה.המתן עד התאים לצרף ולשנות את המדיה למדיה תרבית התא המכיל 200 מגן ננומולר-1. החלף את המדיה בלוחות בתאים שהועברו ובלתי מועברים, והשאר שתי בארות לכל צלחת עם מדיה רגילה כשליטה שלילית. לדגור ולהפיק חלבונים מכל באר באפס, שתיים, שש, 12, 24, 48 ו-72 שעות לאחר הוספת מגן-1 לבארות.לאחר מכן הסר את המדיה עם Shield-1 משאר הבארות ושנה אותה למדיה סלולרית רגילה. לאסוף את החלבונים מאותן בארות בשעתיים, שש ו -12 שעות לאחר שינוי התקשורת. האינדוקציה של חלבון Cas9 אושרה על ידי רמות הביטוי שלה להיות דומה בין התאים transduced והרכב, למרות נוכחות או היעדר מגן-1.יש אינדוקציה מספקת של ביטוי Cas9 בקו התא A549 transduced שעתיים לאחר הטיפול עם Shield-1, אשר הופך זניח בתוך שש עד 12 שעות לאחר הנסיגה של Shield-1. תאי A549 שטופלו ב-Shield-1 ירדו במספרם לאחר 48 שעות מבלי להשפיע על דגימת רינלה, שאומתה על ידי אימונובלובלטינג באמצעות נוגדן נגד חלבון RPA3 המדולדל. היפוך עריכת גנים או מוטציות indel אושרו באמצעות נוקלאז מודד.המבנה הווקטורי lentivirus שתוכנן היה מערכת bicistronic נושאת גן אחר של עניין תחת אותו מקדם EF-1a. חלבון פלואורסצנטי שונה, P2A, נוסף כדי לעקוב אחר תאים נגועים. הביטוי של חלבון mVenus נצפה ברכב ותאי A549 transduced, ללא תלות ביטוי DD-Cas9 וטיפול מגן-1.התמרה יעילה של קו התא עם וקטור DD-Cas9 היא אחד השלבים הגבלת קצב, עבור תאי HEK293T בריאים ושימוש במספר המעבר הנמוך שלהם הוא קריטי. אופטימיזציה של היחס בין DD-Cas9 plasmid, פלסמיד אריזה, ו plasmid מעטפה חשוב מאוד עבור transfection אופטימלי. אבל לצד זה, גם את כמות Shield-1 כי הוא נחוץ כדי לייצב את תאי היעד DD-Cas9 הוא משהו שאתה צריך להיות זהיר.DD-Cas9 עם Cre plasmid זמין גם, והוא יכול לשמש כדי ללמוד את האינטראקציות הגנטיות במחקרים vivo המבוססים על מערכת Cre-lox.

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

מיפוי QTL ו CRISPR / Cas9 עריכה לזהות ג &#39;ין ההתנגדות התרופה ב<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

פרוטוקול עבור הייצור של וקטורים Lentiviral חשוכת-Integrase עבור CRISPR/Cas9-מתווכת נוקאאוט גנטי חלוקת תאים

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי להפוך מותנה מוטציות של בני אדם טפיל המלריה falciparum פ

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...