Name: a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization
Uploaded: 2021-09-02T13:00:00
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Ringraziamo i precedenti membri del nostro laboratorio e lo scienziato Serif Senturk per il lavoro precedente. Ringraziamo Danilo Segovia per aver letto criticamente questo manoscritto. Questo studio è stato possibile e supportato da Swim Across America e dal programma Cancer Target Discovery and Development Center del National Cancer Institute.

1.Il vettore DD-Cas9
<ol><li>Ottenere il vettore DD-Cas9 da Addgene (DD-Cas9 con sequenza di filler e Venere (EDCPV), Plasmide 90085). NOTA: Questo è un plasmide lentivirale DD-Cas9 con un promotore U6 che guida la trascrizione dell'RNA a guida singola (sgRNA) mentre il promotore EFS guida la trascrizione DD-Cas9. La sequenza DYKDDDDK (flag-tag) è presente al C-terminale di Cas9 seguita da 2A peptide auto-scissione (P2A) che separa DD-Cas9 e la proteina fluorescente modificata Venere (mVenus).</li>
</ol><p class="...

<ol>
	<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats+(CRISPRs):+the+hallmark+of+an+ingenious+antiviral+defense+mechanism+in+prokaryotes.">Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes.</a> Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+with+FKBP-derived+destabilizing+domains.">Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+control+of+protein+stability+and+function+in+living+mice.">Chemical control of protein stability and function in living mice.</a> Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+reversible,+and+tunable+method+to+regulate+protein+function+in+living+cells+using+synthetic+small+molecules.">A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules.</a> Cell. 126, 995-1004 (2006).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification.">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).</li><li>Senturk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+tunable+method+to+temporally+control+gene+editing+based+on+conditional+Cas9+stabilization.">Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization.</a> Nature Communications. 8, 14370 (2017).</li><li>McJunkin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+suppression+of+an+essential+gene+in+adult+mice+using+transgenic+RNA+interference.">Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).</li><li>Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-triggered+Cas9+protein+with+improved+genome-editing+specificity.">Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity.</a> Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).</li><li>Dow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).</li><li>Wright, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+split-Cas9+enzyme+complex.">Rational design of a split-Cas9 enzyme complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).</li><li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lentiviral+Packaging+Mixes+and+Producer+Cell+Lines+for+RNAi+Applications.">Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications.</a> Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).</li><li>Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Protein+Stabilization+In+Vivo+Mediated+by+Shield-1+in+Transgenic+Medaka.">Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka.</a> PLOS One. , (2015).</li><li>Sellmyer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+context+affects+levels+of+a+chemically+dependent+destabilizing+domain.">Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain.</a> PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).</li><li>Iwamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+chemical+method+to+regulate+protein+stability+in+the+mammalian+central+nervous+system.">A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system.</a> Chemistry &amp; Biology. 17 (9), 981-988 (2010).</li><li>Tai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+domains+mediate+reversible+transgene+expression+in+the+brain.">Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain.</a> PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).</li><li>Auffenberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+and+reversible+inhibition+of+neurons+and+circuits+by+small+molecule+induced+potassium+channel+stabilization.">Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization.</a> Scientific Reports. 6, 19293 (2016).</li></ol>

La tecnologia CRISPR/Cas9 ha rivoluzionato la capacità di interrogare funzionalmente i genomi2. Tuttavia, l'inattivazione dei geni spesso si traduce in letalità cellulare, deficit funzionali e difetti dello sviluppo, limitando l'utilità di tali approcci per lo studio delle funzionigeniche 7. Inoltre, l'espressione costitutiva di Cas9 può provocare tossicità e la generazione di effetti fuori bersaglio6. Sono stati sviluppati diversi approcci per ...

CRISPR-Cas9 che sta per"clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9"è stato scoperto per la prima volta come parte di studi sull'immunità adattativa batterica1,2. Oggi, CRISPR / Cas9 è diventato lo strumento più riconosciuto per l'editing genetico programmabile e sono state sviluppate diverse iterazioni del sistema per consentire modulazioni trascrizionali ed epigenetiche3. Questa tecnologia consente la manipolazione genetica altamente precisa di quasi tutte le sequenze di DNA4.
I componenti essenziali di qualsiasi editing genetico CRISPR sono una sequenza di RNA guida personalizzabile e la nucleasi Cas95. La guida dell'RNA si lega alla sequenza bersaglio-complementare nel DNA, dirigendo la nucleasi Cas9 per eseguire una rottura a doppio filamento in un punto specifico del genoma3,4. Il sito di scissione risultante viene quindi riparato mediante end-joining non omologo (NHEJ) o riparazione diretta dall'omologia (HDR), con la conseguente introduzione di cambiamenti nella sequenza di DNA mirata5.
L'editing genetico basato su CRISPR / Cas9 è facile da usare e relativamente economico rispetto alle precedenti tecniche di modifica genetica e ha dimostrato di essere sia efficiente che robusto in una molteplicità di sistemi2,4,5. Tuttavia, il sistema presenta alcune limitazioni. L'espressione costitutiva di Cas9 ha spesso dimostrato di provocare un aumento del numero di off-target e un'elevata tossicità cellulare4,6,7,8. Inoltre, il targeting costitutivo di geni essenziali e di sopravvivenza cellulare da parte di Cas9 toglie la sua capacità di eseguire alcuni tipi di studi funzionali come gli studi cinetici sulla morte cellulare7.
Diversi strumenti CRISPR-Cas9 inducibili o controllati condizionatamente sono stati sviluppati per risolvere questi problemi6, come Tet-ON e Tet-Off9; ricombinazione sito-specifica10; prossimità indotta chimicamente11; giunzione dipendente dall'inteina3; e sistemi di localizzazione nucleare basati sul recettore degli estrogeni 4-idrossitamoxifene (ER)12. In generale, la maggior parte di queste procedure (intein splicing e sistemi di proximity split indotti chimicamente) non offrono un controllo reversibile, presentano una risposta cinetica molto lenta al trattamento farmacologico (sistema Tet-On/Off) o non sono suscettibili di manipolazione ad alto rendimento6.
Per affrontare queste limitazioni abbiamo sviluppato un nuovo toolkit che non solo fornisce un editing genetico rapido e robusto controllato nel tempo, ma garantisce anche tracciabilità, sintonizzazione e suscettibilità alla manipolazione genica ad alto rendimento. Questa nuova tecnologia può essere utilizzata in linee cellulari, organoidi e modelli animali. Il nostro sistema si basa su un dominio ingegnerizzato, quando fuso a Cas9, induce il suo rapido degrado. Tuttavia, può essere rapidamente stabilizzato con una piccola molecola altamente selettiva, non tossica e permeabile alle cellule. Più specificamente, abbiamo progettato il "dominio destabilizzante" (DD) mutante umano FKBP12 in Cas9, contrassegnando Cas9 per una degradazione rapida e costitutiva attraverso il sistema ubiquitina-proteasoma quando espresso in cellule di mammifero13. Il ligando sintetico DD, Shield-1 può stabilizzare la conformazione DD, impedendo così la degradazione delle proteine fuse a DD (come Cas9) in modo molto efficiente e con una risposta cinetica veloce14,15. Da notare, Shield-1 si lega con tre ordini di grandezza più stretto al mutante FKBP12 che alla sua controparte wild-type14.
La coppia DD-Cas9/Shield-1 può essere utilizzata per studiare l'identificazione sistematica e la caratterizzazione di geni essenziali in cellule in coltura e modelli animali come abbiamo precedentemente dimostrato prendendo di mira condizionatamente il gene CypD, che svolge un ruolo importante nel metabolismo dei mitocondri; EGFR, un attore chiave nella trasformazione oncogenica; e Tp53, un gene centrale nella risposta al danno al DNA. Oltre all'editing genetico controllato temporalmente e condizionatamente, un altro vantaggio del metodo è che la stabilizzazione di DD-Cas9 è indipendente dalla sua trascrizione. Questa caratteristica consente la co-espressione, sotto lo stesso promotore, di marcatori tracciabili e ricombinasi, come la ricombinasi dipendente dal recettore degli estrogeni, CREER. In questo lavoro, mostriamo come il nostro metodo può essere utilizzato con successo in vitro, per colpire condizionatamente, ad esempio, il gene di replicazione del DNA, RPA3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100mM DTT</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X FastDigest buffer</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>B64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 Ligation Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorimetric BCA kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, glutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>EF0654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest BsmBI</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>FD0454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag [M2] mouse mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR &#38; Gel Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibodies</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shield-1</td>
			<td>Cheminpharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 competent bacterial cells</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURVEYOR Mutation Detection Kit</td>
			<td>Transgenomic/IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin [DM1A] mouse mAb</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CP06-100UG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization

La tecnologia clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associata alla proteina 9 (CRISPR/Cas9) è diventata uno strumento di laboratorio prevalente per introdurre modifiche accurate e mirate nel genoma. La sua enorme popolarità e la rapida diffusione sono attribuite alla sua facilità d'uso e precisione rispetto ai suoi predecessori. Tuttavia, l'attivazione costitutiva del sistema ha applicazioni limitate. In questo articolo, descriviamo un nuovo metodo che consente il controllo temporale dell'attività CRISPR / Cas9 basato sulla stabilizzazione condizionale della proteina Cas9. La fusione di un mutante ingegnerizzato della proteina legante la rapamicina FKBP12 a Cas9 (DD-Cas9) consente la rapida degradazione di Cas9 che a sua volta può essere stabilizzata dalla presenza di un ligando sintetico FKBP12 (Shield-1). A differenza di altri metodi inducibili, questo sistema può essere adattato facilmente per generare sistemi bi-cistronici per co-esprimere DD-Cas9 con un altro gene di interesse, senza regolazione condizionale del secondo gene. Questo metodo consente la generazione di sistemi tracciabili e la manipolazione parallela e indipendente degli alleli presi di mira dalla nucleasi Cas9. La piattaforma di questo metodo può essere utilizzata per l'identificazione sistematica e la caratterizzazione di geni essenziali e l'interrogazione delle interazioni funzionali dei geni in contesti in vitro e in vivo.

Per consentire l'espressione condizionale di Cas9, abbiamo sviluppato un doppio costrutto vettoriale lentivirale costituito da un promotore guidato da U6 per esprimere costitutivamente sgRNA e un promotore core EF-1α per guidare l'espressione della proteina di fusione DD-Cas9 (Figura 1A)19. Come paradigma per illustrare la robustezza e l'efficienza del sistema, abbiamo trasdotto la linea cellulare A549 carcinomatosa polmonare con il c...

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A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization

Qui, descriviamo uno strumento di modifica del genoma basato sulla stabilizzazione temporale e condizionale della proteina 9 (Cas9) associata a ripetizione palindromica corta (CRISPR)(Cas9) raggruppata regolarmente intervallata sotto la piccola molecola, Shield-1. Il metodo può essere utilizzato per cellule in coltura e modelli animali.

Un nuovo toolkit per la valutazione delle funzioni geniche utilizzando la stabilizzazione condizionale Cas9

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associated protein 9 (CRISPR/Cas9) technology has become a prevalent laboratory ...

Questo metodo fornisce un editing rapido e a temperatura controllata del gene CRISPR-Cas9 sotto una piccola molecola, Shield-1. Offre anche meno effetti off-target, minore tossicità cellulare e anche un maggiore editing genetico controllato internamente quando lo si confronta con l'attivazione costitutiva di Cas9. Il vantaggio principale di questa particella è che può essere utilizzata per la caratterizzazione di geni essenziali, nonché di geni di sopravvivenza tumorale.La destabilizzazione di DD-Cas9 è indipendente dalla sua espressione, e questo permette al gene di interesse di essere co-espresso sotto lo stesso promotore. Questo metodo può essere facilmente applicato a studi in vivo e in vitro. Shield-1 può anche penetrare attraverso la barriera emato-encefalica, il che rende facile anche studiare i geni coinvolti nello sviluppo del cervello.Semina uniformemente cellule HEK293T sane a una densità da uno a due milioni di cellule per piastra di coltura tissutale di 10 centimetri utilizzando 10 millilitri di dmEM di glucosio con FBS filtrato al 10%. Incubare le cellule nell'incubatore di colture tissutali al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius per 20 ore. Il giorno successivo, confermare che le cellule hanno raggiunto il 70% di confluenza con la microscopia a campo luminoso e che sono uniformemente disperse attraverso la piastra.Cambiare il supporto un'ora prima della trasfezione con un volume finale di 10 millilitri. Preparare due tubi con 500 microlitri di media caldi. Aggiungere 25 microlitri di reagente di trasfezione al tubo uno e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.All'altro tubo, aggiungere una miscela di plasmidi. Mescolare il tubo uno con il tubo due per formare una miscela di trasfezione e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Aggiungere la miscela di trasfezione a goccia alle cellule HEK293T e incubare la piastra nell'incubatore di colture tissutali.Dopo 18 ore, cambiare con attenzione il supporto a 10 millilitri di DMEM fresco con il 10% fbs per rimuovere il reagente di trasfezione. Incubare le cellule per le prossime 48 ore. Dopo 48 ore, raccogliere il surnatante con una siringa da 10 millilitro e passarlo attraverso un filtro da 0,45 micrometri.Aliquotare il surnatante del virus e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Per determinare il titolo del virus, seminare 5 milioni di cellule HEK293T per pozzo in due piastre a sei pozzetti. Incubare entrambe le piastre a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica durante la notte per raggiungere il 50-60% di confluenza.Il giorno dopo, usa una delle piastre a sei pozzi per contare le cellule nei sei pozzi. Scongelare l'aliquota del virus che verrà utilizzata per eseguire la diluizione seriale e aggiungere otto microgrammi per millilitro di reagente polibrene, preparare DMEM con 10% FBS per la diluizione seriale del virus e aggiungere il reagente polibrene. Preparare due millilitri di diluizioni seriali dieci volte del lentivirus da 0,1 a 0,0001 in mezzi contenenti polibrene.Rimuovere i media dalla piastra a sei pozzetti e aggiungere un millilitro di diluizioni virali ai pozzetti, lasciando un pozzo con il solo supporto come controllo negativo e uno bene con il virus al 100%. Incubare le cellule per 24 ore. Il giorno successivo, rimuovere il supporto con il virus dalle piastre a sei pozzi e cambiarlo in due millilitri di DMEM fresco con il 10% di FBS.Incubare le cellule per 48-72 ore, osservando GFP con un microscopio fluorescente ogni giorno. Dopo 48-72 ore, staccare le cellule e risuscivarle nel massimo tampone. Utilizzare un citometro a flusso per determinare la percentuale di espressione di GFP e calcolare il titolo del virus utilizzando la formula fornita nel manoscritto di testo.Placcare la linea cellulare di interesse in una piastra di 10 centimetri e incubare durante la notte per raggiungere la confluenza dal 50 al 60%, quindi infettare le cellule con 500-2.000 microlitri di particelle virali in un volume totale di 10 millilitri di terreno di coltura. Incubare il mezzo virale per 24 ore. Il giorno successivo, cambia il mezzo virale in mezzo di coltura e determina la percentuale di cellule GFP positive usando la citometria a flusso.Selezionare le celle GFP positive utilizzando BD FACSAria II per l'ordinamento delle celle. Espandere le celle selezionate positivamente e congelare il brodo. Placcare separatamente le cellule selezionate positivamente e le cellule non trasdotte in piastre a 12 fori, 24 ore dopo l'infezione.Attendere che le cellule si attacchino e cambino il supporto in un supporto di coltura cellulare contenente 200 shield-1 nanomolari. Sostituire il mezzo nelle piastre con cellule trasdotte e non trasdotte, lasciando due pozzetti per piastra con mezzi regolari come controllo negativo. Incubare ed estrarre proteine da ciascun pozzo a zero, due, sei, 12, 24, 48 e 72 ore dopo l'aggiunta di Shield-1 ai pozzi.Quindi rimuovere il supporto con Shield-1 dal resto dei pozzi e cambiarlo con il normale supporto cellulare. Raccogli le proteine da quei pozzi a due, sei e 12 ore dopo aver cambiato il mezzo. L'induzione della proteina Cas9 è stata confermata dal fatto che i suoi livelli di espressione sono simili tra le cellule trasdotte e il veicolo, nonostante la presenza o l'assenza di Shield-1.C'è sufficiente induzione dell'espressione di Cas9 nella linea cellulare A549 trasdotta due ore dopo il trattamento con Shield-1, che diventa trascurabile entro sei-12 ore dopo il ritiro di Shield-1. Le cellule A549 trasdotte trattate con Shield-1 sono diminuite di numero dopo 48 ore senza influenzare il campione di Rinella, che è stato convalidato mediante immunoblotting utilizzando un anticorpo contro la proteina RPA3 impoverita. L'inversione dell'editing genetico o le mutazioni indel sono state confermate utilizzando saggi di nucleasi topografica.Il costrutto vettoriale di lentivirus progettato era un sistema bicistronico con un altro gene di interesse sotto lo stesso promotore EF-1a. Una proteina fluorescente modificata, P2A, è stata aggiunta per rintracciare le cellule infette. L'espressione della proteina mVenus è stata osservata nelle cellule trasdotte del veicolo e dell'A549, indipendentemente dall'espressione di DD-Cas9 e dal trattamento con Shield-1.La trasduzione efficiente della linea cellulare con il vettore DD-Cas9 è uno dei passaggi limitanti della velocità, per avere cellule HEK293T sane e utilizzare il loro basso numero di passaggio è cruciale. L'ottimizzazione del rapporto tra plasmide DD-Cas9, plasmide di imballaggio e plasmide di involucro è molto importante per una trasfezione ottimale. Ma oltre ad esso, anche la quantità di Shield-1 necessaria per stabilizzare le cellule bersaglio DD-Cas9 è qualcosa a cui devi stare attento.È disponibile anche il DD-Cas9 con il plasmide Cre e può essere utilizzato per studiare le interazioni genetiche in studi in vivo basati sul sistema Cre-lox.

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

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Ricerca

Genetica

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