Name: a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization
Uploaded: 2021-09-02T13:00:00
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우리는 전작에 대한 우리의 실험실과 과학자 세리프 Senturk의 이전 구성원에게 감사드립니다. 우리는 비판적으로이 원고를 읽고 다닐로 세고비아 감사합니다. 이 연구는 가능하 고 미국 전역 수영과 국립 암 연구소 암 대상 발견 및 개발 센터 프로그램에 의해 지원.

1. DD-Cas9 벡터
<ol><li>Addgene (필러 서열 및 금성 (EDCPV), 플라스미드 90085와 DD-Cas9 벡터를 가져옵니다. 참고: 이것은 EFS 프로모터가 DD-Cas9 전사를 운전하는 동안 단일 가이드 RNA (sgRNA) 전사를 구동하는 U6 프로모터와 렌티바이러스 DD-Cas9 플라스미드입니다. DYKDDDDK 서열(flag-tag)은 Cas9의 C 단말에 존재하며, DD-Cas9및 변형형 형광 단백질 비너스(mVenus)를 분리하는 2A 자가 절단 펩티드(P2A)가 그 뒤를 잇고 있?...

<ol>
	<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats+(CRISPRs):+the+hallmark+of+an+ingenious+antiviral+defense+mechanism+in+prokaryotes.">Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes.</a> Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CRISPR-Cas9+genome+engineering:+lessons+learned+from+RNA+interference.">Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference.</a> Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).</li><li>Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Inducible+CRISPR/Cas+Systems.">Drug Inducible CRISPR/Cas Systems.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).</li><li>Wade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Silencing+Using+the+CRISPR-Cas9+System:+A+Review+of+the+Benefits+and+Challenges.">High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).</li><li>Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-switchable+substrates+for+a+ubiquitin-proteasome+system.">Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+efficient+inducible+CRISPR/Cas9+platform+with+improved+specificity+for+multiple+gene+targeting.">An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting.</a> Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).</li><li>Oakes, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+engineering+hotspots+identifies+an+allosteric+CRISPR-Cas9+switch.">Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch.</a> Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+protein+tagging+in+cells+with+split+fluorescent+protein.">Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein.</a> Nature Communications. 7, 11046 (2016).</li><li>Roper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+and+organoid+transplantation+models+of+colorectal+cancer+and+metastasis.">In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis.</a> Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).</li><li>Chu, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+with+FKBP-derived+destabilizing+domains.">Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+control+of+protein+stability+and+function+in+living+mice.">Chemical control of protein stability and function in living mice.</a> Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+reversible,+and+tunable+method+to+regulate+protein+function+in+living+cells+using+synthetic+small+molecules.">A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules.</a> Cell. 126, 995-1004 (2006).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing.">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+CRISPR/Cas9-induced+mutant+screening.">A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening.</a> Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).</li><li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification.">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).</li><li>Senturk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+tunable+method+to+temporally+control+gene+editing+based+on+conditional+Cas9+stabilization.">Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization.</a> Nature Communications. 8, 14370 (2017).</li><li>McJunkin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+suppression+of+an+essential+gene+in+adult+mice+using+transgenic+RNA+interference.">Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).</li><li>Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-triggered+Cas9+protein+with+improved+genome-editing+specificity.">Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity.</a> Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).</li><li>Dow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).</li><li>Wright, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+split-Cas9+enzyme+complex.">Rational design of a split-Cas9 enzyme complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).</li><li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lentiviral+Packaging+Mixes+and+Producer+Cell+Lines+for+RNAi+Applications.">Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications.</a> Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).</li><li>Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Protein+Stabilization+In+Vivo+Mediated+by+Shield-1+in+Transgenic+Medaka.">Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka.</a> PLOS One. , (2015).</li><li>Sellmyer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+context+affects+levels+of+a+chemically+dependent+destabilizing+domain.">Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain.</a> PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).</li><li>Iwamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+chemical+method+to+regulate+protein+stability+in+the+mammalian+central+nervous+system.">A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system.</a> Chemistry &amp; Biology. 17 (9), 981-988 (2010).</li><li>Tai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+domains+mediate+reversible+transgene+expression+in+the+brain.">Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain.</a> PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).</li><li>Auffenberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+and+reversible+inhibition+of+neurons+and+circuits+by+small+molecule+induced+potassium+channel+stabilization.">Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization.</a> Scientific Reports. 6, 19293 (2016).</li></ol>

CRISPR/Cas9 기술은 게놈2를기능적으로 심문하는 기능에 혁명을 일으켰습니다. 그러나, 유전자의 불활성화는 종종 세포 치사성, 기능적 적자 및 발달 결함을 초래하여 유전자 기능을 연구하기 위한 이러한 접근법의 유용성을 제한한다7. 또한, Cas9의 구성 발현은 독성 및 오프 타겟 효과6의생성을 초래할 수 있다. CRISPR-Cas9 기반 게놈 편집 기술<sup cl...

CRISPR-Cas9는"정기적으로 간격이 짧은 palindromic 반복 관련 단백질 9"을의미하는 CRISPR-Cas9는 세균 적응 면역1,2에대한 연구의 일환으로 처음 발견되었다. 오늘날 CRISPR/Cas9는 프로그래밍 가능한 유전자 편집을 위한 가장 인정받는 도구가 되었으며 시스템의 상이한 반복은 전사 및 후성 유전학 변조3을허용하도록 개발되었다. 이 기술은 DNA 4의 거의 모든 순서의 매우 정밀한 유전 조작을 가능하게합니다.
CRISPR 유전자 편집의 필수 성분은 사용자 지정 가능한 가이드 RNA 서열 및 Cas9 nuclease5이다. RNA 가이드는 DNA내의 표적-보완 서열에 결합하여 Cas9 뉴클레아아아제에게 게놈3,4의특정 지점에서 이중 가닥 브레이크를 수행하도록 지시한다. 그 결과 골짜기 부위는 비동종 최종 결합(NHEJ) 또는 상동성 지향 수리(HDR)에 의해 수리되며, 결과적으로 표적 DNA 서열5의변화가 도입된다.
CRISPR/Cas9 계 유전자 편집은 사용하기 쉽고, 이전 유전자 편집 기술에 비해 상대적으로 저렴하며, 시스템2,4,5의복합성에서 효율적이고 견고하다는 것이 입증되었다. 그러나 시스템은 몇 가지 제한을 제시합니다. Cas9의 구성 발현은 종종 오프 타겟의 증가 수와 높은 세포 독성4,6,7,8의증가를 초래하는 것으로 나타났다. 추가적으로, Cas9에 의하여 필수 및 세포 생존 유전자의 구성 적인 표적은 세포 사멸의 운동 연구 결과와 같은 기능적인 연구의 특정 모형을 능력을 멀리취합니다 7.
Tet-ON 및 Tet-Off9와같은 이러한문제를해결하기 위해 다른 유도성 또는 조건부 제어 CRISPR-Cas9 도구가 개발되었습니다. 사이트별 재조합10; 화학적으로 유도된근접성 11; 인테인 종속 접합3; 및 4-하이드록시타목시펜 에스트로겐 수용체(ER) 기반 핵 국소화시스템(12). 일반적으로, 이러한 절차의 대부분(인테인 접합 및 화학적으로 유도된 근접 분할 시스템)은 가역적 제어를 제공하지 않으며, 약물 치료에 매우 느린 운동 반응을 제시하거나(Tet-On/Off 시스템), 또는 고처리량 조작6에의존하지 않는다.
이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 빠르고 강력한 측두식 유전자 편집을 제공 할뿐만 아니라 추적성, 튜닝성 및 높은 처리량 유전자 조작에 대한 편의성을 보장하는 새로운 툴킷을 개발했습니다. 이 새로운 기술은 세포주, 오르가노이드 및 동물 모델에서 사용할 수 있습니다. 우리의 시스템은 Cas9에 융합 될 때 엔지니어링 된 도메인을 기반으로, 그것은 그것의 급속한 저하를 유도. 그러나, 고도로 선택적, 비독성, 세포 투과성 소분자로 빠르게 안정화될 수 있다. 보다 구체적으로, 인간 FKBP12 돌연변이 "불안정 도메인"(DD)을 Cas9로 설계하여, 포유류세포(13)에서발현될 때 유비퀴틴-프로테솜 시스템을 통해 신속하고 구성적인 분해를 위해 Cas9를 표시하였다. DD 합성 리간드, 쉴드-1은 DD 변형을 안정화시켜 DD(Cas9 와 같은)에 융합된 단백질의 분해를 매우 효율적인 방식으로, 그리고 빠른 운동반응(14,15)으로방지할 수 있다. 참고로 Shield-1은 야생형 대응14보다돌연변이 FKBP12에 3배 더 단단하게 결합합니다.
DD-Cas9/Shield-1 쌍은 이전에 미토콘드리아대사에 중요한 역할을 하는 CypD 유전자를 조건부 대상으로 한 것으로 이전에 보여준 바와 같이 배양 세포 및 동물 모델에서 필수 유전자의 체계적인 식별 및 특성화를 연구하는 데 사용될 수 있습니다. EGFR, 온코겐 변환의 핵심 플레이어; 및 Tp53, DNA 손상 반응에 있는 중앙 유전자. 시간적 및 조건부 제어 유전자 편집 외에도 DD-Cas9의 안정화가 전사와 무관하다는 것이 방법의 또 다른 장점이 있습니다. 이 기능은 에스트로겐 수용체 의존성 재조합, CRE ER과 같은 추적 가능한 마커뿐만 아니라 재조합의 동시 발현을 가능하게한다. 이 작품에서, 우리는 우리의 방법이 성공적으로 시험관 내에서 사용될 수있는 방법을 보여줍니다, 예를 들어 조건부 대상, DNA 복제 유전자, RPA3.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>100mM DTT</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X FastDigest buffer</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>B64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 Ligation Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorimetric BCA kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, glutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>EF0654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest BsmBI</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>FD0454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag [M2] mouse mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR &#38; Gel Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibodies</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shield-1</td>
			<td>Cheminpharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 competent bacterial cells</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURVEYOR Mutation Detection Kit</td>
			<td>Transgenomic/IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin [DM1A] mouse mAb</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CP06-100UG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization

클러스터된 짧은 palindromic 반복-(CRISPR-) 관련 단백질 9 (CRISPR/Cas9) 기술은 게놈에 있는 정확하고 표적으로 한 수정을 소개하는 널리 퍼진 실험실 공구가 되었습니다. 그것의 엄청난 인기와 급속한 확산은 그것의 전임자에 비해 그것의 쉬운 사용 및 정확성에 기인한다. 그러나 시스템의 구성 활성화는 제한된 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 이 논문에서는 Cas9 단백질의 조건부 안정화에 기초하여 CRISPR/Cas9 활성을 측두식할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 라파마이신 결합 단백질 FKBP12의 엔지니어링 된 돌연변이를 Cas9 (DD-Cas9)에 융합하면 FKBP12 합성 리간드 (Shield-1)의 존재에 의해 안정화 될 수있는 Cas9의 급속한 분해를 가능하게합니다. 다른 유도 가능한 방법과 는 달리, 이 시스템은 두 번째 유전자의 조건부 조절 없이 다른 관심사 유전자와 DD-Cas9를 공동 발현하기 위해 바이 시트론 시스템을 생성하도록 쉽게 적응할 수 있다. 이 방법은 Cas9 뉴클레아아아제에 의해 표적화된 항선의 병렬, 독립적인 조작뿐만 아니라 추적 가능한 시스템의 생성을 가능하게 한다. 이 방법의 플랫폼은 필수 유전자의 체계적인 식별 및 특성화 및 시험관 내 및 생체 내 환경에서 유전자의 기능적 상호 작용의 심문을 위해 사용될 수 있다.

Cas9의 조건부 발현을 가능하게 하기 위해, DD-Cas9 융합단백질(도 1A)19의발현을 구동하기 위해 U6 구동 프로모터로 구성된 이중 렌티바이러스 벡터 구조를 개발하였다. 시스템의 견고성과 효율성을 보여주는 패러다임으로서 폐 암종 A549 세포주와 렌티바이러스 구조를 변형시켰습니다. 리간드 쉴드-1의 존재 또는 부재에서 Cas9의 수준은...

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A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization

여기서, 우리는 소분자, Shield-1 하에서 정기적으로 간격이 있는 짧은 palindromic 반복-(CRISPR-) 관련 단백질 9 (Cas9)의 시간적 및 조건부 안정화에 기초하여 게놈 편집 도구를 기술합니다. 이 방법은 배양 된 세포 및 동물 모델에 사용될 수있다.

조건부 Cas9 안정화를 사용하여 유전자 기능을 평가하기 위한 새로운 툴킷

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associated protein 9 (CRISPR/Cas9) technology has become a prevalent laboratory ...

이 방법은 작은 분자, Shield-1하에서 빠른 온도 조절 CRISPR-Cas9 유전자 편집을 제공합니다. 또한 Cas9의 구성 활성화와 비교할 때 더 적은 오프 타겟 효과, 낮은 세포 독성, 또한 더 높은 내부적으로 통제 된 유전자 편집을 제공합니다. 이 입자의 주요 장점은 종양 생존 유전자뿐만 아니라 필수 유전자의 특성화에 사용될 수 있다는 것입니다.DD-Cas9의 불안정화는 발현과 무관하며, 이를 통해 관심 유전자가 동일한 프로모터하에서 공동 발현될 수 있습니다. 이 방법은 생체 내 및 시험관 내 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다. 쉴드-1은 또한 혈액 두뇌 장벽을 통해 침투할 수 있습니다, 이는 또한 두뇌 발달에 관련시키는 유전자를 공부하기 쉽게 만드는.10% 여과된 FBS를 가진 포도당 DMEM의 10 밀리리터를 사용하여 10센티미터 조직 배양 판당 1~2백만 개의 세포밀도로 건강한 HEK293T 세포를 균등하게 종자하였다. 조직 배양 인큐베이터에서 세포를 20시간 동안 이산화탄소 5% 및 섭씨 37도로 배양합니다. 다음 날, 세포가 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 70 %의 합류에 도달하고 그(것)들이 접시를 통해 고르게 분산된다는 것을 확인합니다.10 밀리리터의 최종 볼륨으로 트랜스퍼션 1시간 전에 미디어를 변경합니다. 따뜻한 매체의 500 마이크로 리터와 두 개의 튜브를 준비합니다. 25 마이크로리터의 트랜스페트 시약을 튜브 1에 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.다른 튜브에 플라스미드를 혼합하여 넣습니다. 튜브 2와 튜브를 혼합하여 형질 혼합물을 형성하고 실온에서 20 분 동안 배양하십시오. HEK293T 세포에 속하면 배설 혼합물을 추가하고 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양한다.18시간 후, 10%의 FBS로 미디어를 10밀리리터의 신선한 DMEM으로 조심스럽게 변경하여 트랜스페트 시약을 제거합니다. 다음 48 시간 동안 세포를 배양합니다. 48시간 후, 10밀리리터 주사기로 상수체를 수집하고 0.45 마이크로미터 필터를 통과합니다.Aliquot 바이러스 상체를 인용 하 고 영하 80 섭씨에 저장. 바이러스 티터를 결정하기 위해, 씨앗 5 백만 HEK293T 세포 는 두 개의 6 웰 플레이트로 잘 당. 두 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 하룻밤 사이에 배양하여 50~60%의 인플루엔자에 도달합니다.다음 날, 6 웰 플레이트 중 하나를 사용하여 6 개의 우물에서 세포를 계산하십시오. 직렬 희석을 수행하고 폴리브레인 시약의 밀리리터 당 8 마이크로 그램을 추가하는 데 사용되는 바이러스 알리코트해, 바이러스의 직렬 희석을 위해 10 %의 FBS로 DMEM을 준비하고 폴리 브레인 시약을 추가합니다. 미디어를 포함하는 폴리브레네에서 렌티 바이러스의 10배 연속 희석제 2밀리리터를 0.1에서 0.0001로 준비합니다.6웰 플레이트에서 미디어를 제거하고 우물에 바이러스 희석1 밀리리터를 추가하여 부정적인 제어로 미디어를 잘 만들고 100 % 바이러스가 잘 결합됩니다. 세포를 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 6 웰 플레이트에서 바이러스로 미디어를 제거하고 10 %의 FBS와 신선한 DMEM의 두 밀리리터로 변경합니다.세포를 48~72시간 동안 배양하여 매일 형광 현미경으로 GFP를 관찰합니다. 48~72시간 후에는 세포를 분리하고 최대 버퍼로 다시 일시 중지합니다. 흐름 사이토미터를 사용하여 GFP 식의 백분율을 결정하고 텍스트 원고에 제공된 수식을 사용하여 바이러스 티터를 계산합니다.10센티미터 플레이트에 관심 있는 세포줄을 플레이트하고 하룻밤 동안 배양하여 50~60%의 합류에 도달한 다음, 10밀리리터의 배양 배지에서 바이러스 입자의 500~2, 000 마이크로리터로 세포를 감염시킵니다. 바이러스 성 미디어를 24 시간 동안 배양하십시오. 다음 날, 바이러스 성 매체를 배양 매체로 변경하고 유동 세포 측정을 사용하여 GFP 양성 세포의 비율을 결정합니다.세포 정렬을 위해 BD FACSAria II를 사용하여 GFP 양성 셀을 선택합니다. 긍정적으로 선택된 셀을 확장하고 재고를 동결합니다. 12웰 플레이트에서 양적으로 선택된 세포와 추론되지 않은 세포를 감염 후 24시간 별도로 플레이트한다.세포가 200 나노 몰러 쉴드-1을 포함하는 세포 배양 매체로 미디어를 연결하고 변경할 때까지 기다립니다. 플레이트의 미디어를 변환및 변환되지 않은 셀로 교체하여 플레이트당 두 개의 우물을 음수 제어로 일반 미디어로 남깁니다. 우물에 Shield-1을 추가한 후 0, 2, 6, 12, 24, 48 및 72시간 동안 각 우물에서 단백질을 배양하고 추출합니다.그런 다음 나머지 우물에서 Shield-1로 미디어를 제거하고 일반 세포 매체를 변경합니다. 미디어를 변경한 후 2시간, 6시간, 12시간 후에 해당 우물에서 단백질을 수집합니다. Cas9 단백질의 유도는 Shield-1의 존재 또는 부재에도 불구하고 유도된 세포 및 차량 사이에서 유사한 발현 수준에 의해 확인되었다.쉴드-1을 통해 치료 후 2시간 후에 트랜스유도된 A549 세포주에서 Cas9 발현의 충분한 유도가 있으며, 이는 Shield-1의 철수 후 6~12시간 이내에 무시할 수 있게 된다. Shield-1 은 고갈된 RPA3 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역 블로팅을 사용하여 검증된 리넬라 샘플에 영향을 미치지 않고 48시간 후에 A549 세포를 배설하였다. 유전자 편집 반전 또는 인델 돌연변이는 측량체 핵세아제 어세약를 사용하여 확인되었다.설계된 렌즈바이러스 벡터 구조는 동일한 EF-1a 프로모터하에서 다른 관심 유전자를 베어링하는 이두근 시스템이었습니다. 변형된 형광 단백질인 P2A가 감염된 세포를 추적하기 위해 첨가되었습니다. mVenus 단백질의 발현은 DD-Cas9 발현 및 쉴드-1 처리와 무관한 차량 및 A549 트랜스듀싱 된 세포에서 관찰되었다.DD-Cas9 벡터를 갖는 세포주의 효율적인 트랜스포메이션은 건강한 HEK293T 세포를 갖는 데, 낮은 통로 수를 사용하기 위한 속도 제한 단계 중 하나입니다. DD-Cas9 플라스미드, 패키징 플라스미드 및 봉투 플라스미드 사이의 비율의 최적화는 최적의 트랜스펙트에 매우 중요합니다. 그러나 그 옆에, 또한 DD-Cas9 표적 세포를 안정화하는 데 필요한 쉴드-1의 양은 조심해야 할 것입니다.Cre-plasmid와 DD-Cas9도 사용할 수 있습니다., 그리고 그것은 Cre-lox 시스템에 따라 생체 내 연구에서 유전 상호 작용을 연구 하는 데 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

약물 저항 유전자를 확인하기위한 QTL 매핑 및 CRISPR / Cas9 편집<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

연구

유전학

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

CRISPR/Cas9 단백질의 유전자 편집에 대 한 채널 메기, Ictalurus punctatus, 배아로 microinjection

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

CRISPR/Cas9-중재 유전자 녹아웃 셀 분할에 대 한 Integrase 불충분 한 Lentiviral 벡터의 생산을 위한 프로토콜

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 유전자 인간 말라리아 기생충의 조건부 돌연변이 게 P. falciparum 에 편집

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...