Name: a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization
Uploaded: 2021-09-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization at JoVE.com

Vi takker tidligere medlemmer av vårt laboratorium og forsker Serif Senturk for tidligere arbeid. Vi takker Danilo Segovia for at han kritisk leste dette manuskriptet. Denne studien var mulig og støttet av Swim Across America og National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center-programmet.

1.DD-Cas9 vektoren
<ol><li>Få DD-Cas9 vektor fra Addgene (DD-Cas9 med filler sekvens og Venus (EDCPV), Plasmid 90085). MERK: Dette er en lentiviral DD-Cas9-plasmid med en U6-promotor som driver transkripsjonen av enkeltguiden RNA (sgRNA), mens EFS-promotoren driver DD-Cas9-transkripsjonen. DYKDDDDK-sekvensen (flagg-tag) er til stede på C-terminalen i Cas9 etterfulgt av 2A selvklebende peptid (P2A) som skiller DD-Cas9 og modifisert fluorescerende protein Venus (mVenus).</li>
</ol>2. Liten guid...

<ol>
	<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats+(CRISPRs):+the+hallmark+of+an+ingenious+antiviral+defense+mechanism+in+prokaryotes.">Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes.</a> Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CRISPR-Cas9+genome+engineering:+lessons+learned+from+RNA+interference.">Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference.</a> Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).</li><li>Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Inducible+CRISPR/Cas+Systems.">Drug Inducible CRISPR/Cas Systems.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).</li><li>Wade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Silencing+Using+the+CRISPR-Cas9+System:+A+Review+of+the+Benefits+and+Challenges.">High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).</li><li>Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-switchable+substrates+for+a+ubiquitin-proteasome+system.">Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+efficient+inducible+CRISPR/Cas9+platform+with+improved+specificity+for+multiple+gene+targeting.">An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting.</a> Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).</li><li>Oakes, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+engineering+hotspots+identifies+an+allosteric+CRISPR-Cas9+switch.">Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch.</a> Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+protein+tagging+in+cells+with+split+fluorescent+protein.">Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein.</a> Nature Communications. 7, 11046 (2016).</li><li>Roper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+and+organoid+transplantation+models+of+colorectal+cancer+and+metastasis.">In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis.</a> Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).</li><li>Chu, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+with+FKBP-derived+destabilizing+domains.">Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+control+of+protein+stability+and+function+in+living+mice.">Chemical control of protein stability and function in living mice.</a> Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+reversible,+and+tunable+method+to+regulate+protein+function+in+living+cells+using+synthetic+small+molecules.">A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules.</a> Cell. 126, 995-1004 (2006).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing.">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+CRISPR/Cas9-induced+mutant+screening.">A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening.</a> Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).</li><li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification.">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).</li><li>Senturk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+tunable+method+to+temporally+control+gene+editing+based+on+conditional+Cas9+stabilization.">Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization.</a> Nature Communications. 8, 14370 (2017).</li><li>McJunkin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+suppression+of+an+essential+gene+in+adult+mice+using+transgenic+RNA+interference.">Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).</li><li>Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-triggered+Cas9+protein+with+improved+genome-editing+specificity.">Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity.</a> Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).</li><li>Dow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).</li><li>Wright, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+split-Cas9+enzyme+complex.">Rational design of a split-Cas9 enzyme complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).</li><li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lentiviral+Packaging+Mixes+and+Producer+Cell+Lines+for+RNAi+Applications.">Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications.</a> Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).</li><li>Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Protein+Stabilization+In+Vivo+Mediated+by+Shield-1+in+Transgenic+Medaka.">Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka.</a> PLOS One. , (2015).</li><li>Sellmyer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+context+affects+levels+of+a+chemically+dependent+destabilizing+domain.">Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain.</a> PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).</li><li>Iwamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+chemical+method+to+regulate+protein+stability+in+the+mammalian+central+nervous+system.">A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system.</a> Chemistry &amp; Biology. 17 (9), 981-988 (2010).</li><li>Tai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+domains+mediate+reversible+transgene+expression+in+the+brain.">Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain.</a> PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).</li><li>Auffenberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+and+reversible+inhibition+of+neurons+and+circuits+by+small+molecule+induced+potassium+channel+stabilization.">Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization.</a> Scientific Reports. 6, 19293 (2016).</li></ol>

CRISPR/Cas9-teknologien har revolusjonert evnen til funksjonelt å forhøre genomer2. Inaktivering av gener resulterer imidlertid ofte i celledødelighet, funksjonelle underskudd og utviklingsfeil, noe som begrenser nytten av slike tilnærminger for å studere genfunksjoner7. I tillegg kan konstituerende uttrykk for Cas9 føre til toksisitet og generering av off-target effekter6. Ulike tilnærminger er utviklet for å kontrollere CRISPR-Cas9-baserte ...

CRISPR-Cas9 som står for"clustered regular interspaced short palindromic repeats-associated protein 9" ble først oppdaget som en del av studier på bakteriell adaptiv immunitet1,2. I dag har CRISPR/Cas9 blitt det mest anerkjente verktøyet for programmerbar genredigering, og forskjellige iterasjoner av systemet er utviklet for å tillate transkripsjons- og epigenetiske moduler3. Denne teknologien muliggjør den svært presise genetiske manipuleringen av nesten hvilken som helst sekvens av DNA4.
De viktigste komponentene i enhver CRISPR genredigering er en tilpassbar guide RNA-sekvens og Cas9-kjernen5. RNA-guiden binder seg til den mål-komplementære sekvensen i DNA-et, og leder Cas9-kjernen til å utføre en dobbeltstrengspause på et bestemt punkt i genomet3,4. Det resulterende spaltingsstedet repareres deretter ved ikke-homolog ende-sammenføyning (NHEJ) eller homologi-rettet reparasjon (HDR), med den påfølgende innføringen av endringer i den målrettede DNA-sekvensen5.
CRISPR/Cas9-basert genredigering er enkel å bruke, og relativt billig sammenlignet med tidligere genredigeringsteknikker, og det har vist seg å være både effektivt og robust i et mangfold av systemer2,4,5. Likevel presenterer systemet noen begrensninger. Det konstituerende uttrykket for Cas9 har ofte vist seg å resultere i et økt antall off-targets og høy celletoksisitet4,6,7,8. I tillegg tar den konstituerende målrettingen av essensielle og celleoverlevelsesgener av Cas9 bort fra sin evne til å utføre visse typer funksjonelle studier som kinetiske studier av celledød7.
Ulike inducible eller betinget kontrollerte CRISPR-Cas9-verktøy er utviklet for å løse disse problemene6, for eksempel Tet-ON og Tet-Off9; områdespesifikk rekombinasjon10; kjemisk indusert nærhet11; intein avhengig skjøting3; og 4-Hydroxytamoxifen østrogenreseptor (ER) baserte kjernefysiske lokaliseringssystemer12. Generelt tilbyr de fleste av disse prosedyrene (intein skjøting og kjemisk indusert nærhet splitt systemer) ikke reversibel kontroll, presentere en svært langsom kinetisk respons på narkotikabehandling (Tet-On / Off system), eller er ikke egnet til høy-gjennomstrømning manipulasjon6.
For å løse disse begrensningene utviklet vi et nytt verktøysett som ikke bare gir rask og robust temporalkontrollert genredigering, men som også sikrer sporbarhet, tunability og egnethet til genmanipulering med høy gjennomstrømning. Denne nye teknologien kan brukes i cellelinjer, organoider og dyremodeller. Systemet vårt er basert på et konstruert domene, når det smeltes sammen til Cas9, induserer det sin raske nedbrytning. Det kan imidlertid raskt stabiliseres med et svært selektivt, ikke-giftig, cellegjennomtrengelig lite molekyl. Mer spesifikt konstruerte vi det menneskelige FKBP12 mutant "destabiliserende domenet" (DD) til Cas9, og markerte Cas9 for rask og konstituerende nedbrytning via allestedsnærværende proteasomsystemet når det uttrykkes i pattedyrceller13. DD syntetisk ligand, Shield-1 kan stabilisere DD-konformasjon, og dermed forhindre nedbrytning av proteiner smeltet til DD (som Cas9) på en svært effektiv måte, og med en rask kinetisk respons14,15. Vær oppmerksom på at Shield-1 binder seg med tre størrelsesordener strammere til mutanten FKBP12 enn til den ville motparten14.
DD-Cas9/Shield-1-paret kan brukes til å studere systematisk identifisering og karakterisering av essensielle gener i dyrkede celler og dyremodeller som vi tidligere viste ved betinget målretting av CypD-genet, som spiller en viktig rolle i metabolismen av mitokondrier; EGFR, en nøkkelspiller i onkogen transformasjon; og Tp53, et sentralt gen i DNA-skaderespons. I tillegg til temporally og betinget kontrollert genredigering, er en annen fordel med metoden at stabiliseringen av DD-Cas9 er uavhengig av transkripsjonen. Denne funksjonen muliggjør samuttrykk, under samme promotor, av sporbare markører samt rekombinasjoner, for eksempel østrogenreseptoravhengig rekombininase, CREER. I dette arbeidet viser vi hvordan vår metode kan brukes in vitro, til betinget mål for eksempel DNA-replikasjonsgen, RPA3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100mM DTT</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X FastDigest buffer</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>B64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 Ligation Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorimetric BCA kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, glutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>EF0654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest BsmBI</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>FD0454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag [M2] mouse mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR &#38; Gel Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibodies</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shield-1</td>
			<td>Cheminpharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 competent bacterial cells</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURVEYOR Mutation Detection Kit</td>
			<td>Transgenomic/IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin [DM1A] mouse mAb</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CP06-100UG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization

Den klyngede regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjons- (CRISPR-) assosierte protein 9 (CRISPR / Cas9) -teknologien har blitt et utbredt laboratorieverktøy for å introdusere nøyaktige og målrettede modifikasjoner i genomet. Den enorme populariteten og den raske spredningen tilskrives enkel bruk og nøyaktighet sammenlignet med forgjengerne. Likevel har den konstituerende aktiveringen av systemet begrensede applikasjoner. I dette dokumentet beskriver vi en ny metode som tillater tidsmessig kontroll av CRISPR/Cas9-aktivitet basert på betinget stabilisering av Cas9-proteinet. Fusing en konstruert mutant av rapamycin-bindende protein FKBP12 til Cas9 (DD-Cas9) muliggjør rask nedbrytning av Cas9 som igjen kan stabiliseres ved tilstedeværelsen av en FKBP12 syntetisk ligand (Shield-1). I motsetning til andre inducible metoder, kan dette systemet enkelt tilpasses for å generere bi-cistronic systemer for å co-uttrykke DD-Cas9 med et annet gen av interesse, uten betinget regulering av det andre genet. Denne metoden muliggjør generering av sporbare systemer samt parallell, uavhengig manipulering av alleler målrettet av Cas9-kjernease. Plattformen til denne metoden kan brukes til systematisk identifisering og karakterisering av essensielle gener og forhør av funksjonelle interaksjoner av gener i in vitro- og in vivo-innstillinger.

For å muliggjøre det betingede uttrykket til Cas9 utviklet vi en dobbel lentiviral vektorkonstruksjon bestående av en U6-drevet promotor for å uttrykke sgRNA, og en EF-1α kjernepromotor for å drive uttrykket av DD-Cas9 fusjonsproteinet (Figur 1A)19. Som et paradigme for å illustrere systemets robusthet og effektivitet, transduserte vi lungekarsinomisk A549-cellelinje med lentiviral konstruksjon. Nivåene av Cas9 i nærvær eller...

Watch this Scientific Journal Video about A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization at JoVE.com

A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization

Her beskriver vi et genomredigeringsverktøy basert på den tidsmessige og betingede stabiliseringen av klyngert regelmessig interspaced kort palindromisk repetisjon- (CRISPR-) assosiert protein 9 (Cas9) under det lille molekylet, Shield-1. Metoden kan brukes til dyrkede celler og dyremodeller.

Et nytt verktøysett for evaluering av genfunksjoner ved hjelp av betinget cas9-stabilisering

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associated protein 9 (CRISPR/Cas9) technology has become a prevalent laboratory ...

Denne metoden gir rask, temperaturkontrollert CRISPR-Cas9 genredigering under et lite molekyl, Shield-1. Det gir også mindre off-target effekter, lavere celle toksisitet, og også høyere internt kontrollert genredigering når du sammenligner det med konstituerende aktivering av Cas9. Den største fordelen med denne partikkelen er at den kan brukes til karakterisering av essensielle gener, samt tumoroverlevelsesgener.Destabilisering av DD-Cas9 er uavhengig av uttrykket, og dette gjør at genet av interesse kan uttrykkes samtidig under samme promotør. Denne metoden kan enkelt brukes på in vivo- og in vitro-studier. Shield-1 kan også trenge gjennom blod-hjerne barriere, noe som gjør det enkelt også å studere gener som er involvert i hjerneutvikling.Jevnt frø sunne HEK293T celler med en tetthet på en til to millioner celler per 10 centimeter vev kultur plate ved å bruke 10 milliliter glukose DMEM med 10% filtrert FBS. Inkuber cellene i vevskulturinkubatoren ved 5% karbondioksid og 37 grader Celsius i 20 timer. Neste dag bekrefter du at cellene nådde 70% samløp ved brightfield mikroskopi og at de er jevnt spredt over platen.Bytt medium en time før transfeksjonen med et endelig volum på 10 milliliter. Forbered to rør med 500 mikroliter varme medier. Tilsett 25 mikroliter transfeksjonsreagens til rør en, og inkuber ved romtemperatur i fem minutter.Til det andre røret, legg til en blanding av plasmider. Bland rør en med rør to for å danne en transfeksjonsblanding, og inkuber ved romtemperatur i 20 minutter. Tilsett transfeksjonsblandingen dråpevis til HEK293T-cellene og inkuber platen i vevskulturinkubatoren.Etter 18 timer, bytt forsiktig mediet til 10 milliliter fersk DMEM med 10% FBS for å fjerne transfeksjonsreagensen. Inkuber cellene i de neste 48 timene. Etter 48 timer samler du supernatanten med en 10 milliliter sprøyte og sender den gjennom et 0,45 mikrometer filter.Aliquot viruset supernatant og lagre det på minus 80 grader Celsius. For å bestemme virustitren, frø 5 millioner HEK293T celler per brønn i to seks-brønns plater. Inkuber begge platene ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid over natten for å nå 50 til 60% samløp.Neste dag bruker du en av seksbrønnsplatene til å telle cellene i de seks brønnene. Tine viruset aliquot som vil bli brukt til å utføre seriell fortynning og legge til åtte mikrogram per milliliter polybrene reagens, forberede DMEM med 10% FBS for seriell fortynning av viruset, og legge polybrene reagens. Forbered to milliliter av tifoldige serielle fortynninger av lentiviruset fra 0,1 til 0,0001 i polybrenholdige medier.Fjern medier fra seksbrønnsplaten og tilsett en milliliter virale fortynninger til brønnene, slik at en brønn med media alene er en negativ kontroll og en brønn med 100% virus. Inkuber cellene i 24 timer. Neste dag fjerner du mediene med viruset fra seksbrønnsplatene og endrer det til to milliliter fersk DMEM med 10% FBS.Inkuber cellene i 48 til 72 timer, og observer GFP med et fluorescerende mikroskop hver dag. Etter 48 til 72 timer løsner du cellene og bruker dem på nytt i maksimal buffer. Bruk et strømningscytometer til å bestemme prosentandelen av GFP-uttrykk og beregne virustitren ved hjelp av formelen som er angitt i tekstmanuskriptet.Plate cellelinjen av interesse i en 10 centimeter plate og inkuber over natten for å nå samløp på 50 til 60%Deretter infisere cellene med 500 til 2000 mikroliter av viruspartikler i et 10 milliliter totalt volum av kulturmedium. Inkubere viralmediene i 24 timer. På neste dag, endre virale medier til kulturmedier, og bestemme prosentandelen av GFP positive celler ved hjelp av flow cytometri.Velg positive GFP-celler ved hjelp av BD FACSAria II for cellesortering. Utvid positivt merkede celler og frys lageret. Plate de positivt merkede cellene og utransdusert celler i 12-brønns plater separat, 24 timer etter infeksjon.Vent til cellene fester og endrer mediet til cellekulturmedier som inneholder 200 nanomolar Shield-1. Bytt ut mediet i platene med transinduserte og utransduserte celler, og la to brønner per plate med vanlige medier som en negativ kontroll. Inkuber og trekk ut proteiner fra hver brønn ved null, to, seks, 12, 24, 48 og 72 timer etter å ha lagt Shield-1 til brønnene.Fjern deretter mediet med Shield-1 fra resten av brønnene og endre det for vanlige cellemedier. Samle proteinene fra disse brønnene på to, seks og 12 timer etter at du har endret media. Induksjonen av Cas9-protein ble bekreftet av at uttrykksnivåene var like blant de transinduserte cellene og kjøretøyet, til tross for tilstedeværelsen eller fraværet av Shield-1.Det er tilstrekkelig induksjon av Cas9-uttrykk i den transinduserte A549-cellelinjen to timer etter behandling med Shield-1, som blir ubetydelig innen seks til 12 timer etter tilbaketrekking av Shield-1. Shield-1 behandlet transduced A549 celler redusert i antall etter 48 timer uten å påvirke Rinella prøven, som ble validert ved immunoblotting ved hjelp av et antistoff mot utarmet RPA3 protein. Genredigeringsinversjon eller indelmutasjoner ble bekreftet ved hjelp av surveyorkjerneanalyser.Lentivirusvektorkonstruksjonen designet var et bicistronic-system som bærer et annet gen av interesse under samme EF-1a-promotor. Et modifisert fluorescerende protein, P2A, ble tilsatt for å spore infiserte celler. Uttrykket av mVenus-proteinet ble observert i kjøretøyet og A549 transinduserte celler, uavhengig av DD-Cas9-uttrykk og Shield-1-behandling.Den effektive transduksjonen av cellelinjen med DD-Cas9-vektoren er et av de hastighetsbegrensende trinnene, for å ha sunne HEK293T-celler og bruke deres lave passasjenummer er avgjørende. Optimaliseringen av forholdet mellom DD-Cas9 plasmid, emballasjeplasmid og konvoluttplasmid er svært viktig for optimal transfeksjon. Men ved siden av det er også mengden Shield-1 som trengs for å stabilisere DD-Cas9-målceller noe du må være forsiktig med.DD-Cas9 med Cre plasmid er også tilgjengelig, og den kan brukes til å studere genetiske interaksjoner i in vivo-studier basert på Cre-lox-systemet.

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL-kartlegging og CRISPR / Cas9 redigering for å identifisere et stoffresistensgen i<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En Standard metode for å undersøke stedet genetisk virkning som en funksjon av punkt mutasjon reparasjon katalysert av CRISPR/Cas9 og SsODN i menneskeceller

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection CRISPR/Cas9 protein i kanalen Gråsteinbit, Ictalurus punctatus, embryo for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

En protokoll for produksjon av Integrase dårlig Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-mediert Gene Knockout i dele celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effektiv produksjon og identifikasjon av CRISPR/Cas9-generert Gene Knockouts i modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Svært effektiv Gene avbrudd i Murine og menneskelig blodkreft stamfar celler av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Bruke musen Oocytes å vurdere menneskelige gen funksjon under meiose jeg

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

En rask og lettvint rørledning for generering Genomic punkt mutanter i C. elegans bruker CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene redigering gjør betinget mutanter av menneskelig malariaparasitten P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...