Name: a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization
Uploaded: 2021-09-02T13:00:00
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Agradecemos aos membros anteriores do nosso laboratório e cientista Serif Senturk pelo trabalho anterior. Agradecemos a Danilo Segovia pela leitura crítica deste manuscrito. Este estudo foi possível e apoiado pela Swim Across America e pelo programa National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center.

1.O vetor DD-Cas9
<ol><li>Obtenha vetor DD-Cas9 de Addgene (DD-Cas9 com sequência de enchimento e Vênus (EDCPV), Plasmid 90085). NOTA: Este é um plasmídeo lentiviral DD-Cas9 com um promotor U6 que conduz a transcrição do RNA de guia único (sgRNA), enquanto o promotor do EFS conduz a transcrição DD-Cas9. A sequência DYKDDDDK (sinalização) está presente no terminal C de Cas9, seguida por 2A peptídeo auto-cleaving (P2A) que separa DD-Cas9 e proteína fluorescente modificada Vênus (mVenus).</li>
</ol><p c...

<ol>
	<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats+(CRISPRs):+the+hallmark+of+an+ingenious+antiviral+defense+mechanism+in+prokaryotes.">Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes.</a> Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CRISPR-Cas9+genome+engineering:+lessons+learned+from+RNA+interference.">Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference.</a> Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).</li><li>Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Inducible+CRISPR/Cas+Systems.">Drug Inducible CRISPR/Cas Systems.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).</li><li>Wade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Silencing+Using+the+CRISPR-Cas9+System:+A+Review+of+the+Benefits+and+Challenges.">High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).</li><li>Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-switchable+substrates+for+a+ubiquitin-proteasome+system.">Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+efficient+inducible+CRISPR/Cas9+platform+with+improved+specificity+for+multiple+gene+targeting.">An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting.</a> Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).</li><li>Oakes, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+engineering+hotspots+identifies+an+allosteric+CRISPR-Cas9+switch.">Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch.</a> Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+protein+tagging+in+cells+with+split+fluorescent+protein.">Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein.</a> Nature Communications. 7, 11046 (2016).</li><li>Roper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+and+organoid+transplantation+models+of+colorectal+cancer+and+metastasis.">In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis.</a> Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).</li><li>Chu, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+with+FKBP-derived+destabilizing+domains.">Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+control+of+protein+stability+and+function+in+living+mice.">Chemical control of protein stability and function in living mice.</a> Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+reversible,+and+tunable+method+to+regulate+protein+function+in+living+cells+using+synthetic+small+molecules.">A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules.</a> Cell. 126, 995-1004 (2006).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing.">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+CRISPR/Cas9-induced+mutant+screening.">A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening.</a> Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).</li><li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification.">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).</li><li>Senturk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+tunable+method+to+temporally+control+gene+editing+based+on+conditional+Cas9+stabilization.">Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization.</a> Nature Communications. 8, 14370 (2017).</li><li>McJunkin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+suppression+of+an+essential+gene+in+adult+mice+using+transgenic+RNA+interference.">Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).</li><li>Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-triggered+Cas9+protein+with+improved+genome-editing+specificity.">Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity.</a> Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).</li><li>Dow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).</li><li>Wright, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+split-Cas9+enzyme+complex.">Rational design of a split-Cas9 enzyme complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).</li><li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lentiviral+Packaging+Mixes+and+Producer+Cell+Lines+for+RNAi+Applications.">Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications.</a> Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).</li><li>Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Protein+Stabilization+In+Vivo+Mediated+by+Shield-1+in+Transgenic+Medaka.">Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka.</a> PLOS One. , (2015).</li><li>Sellmyer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+context+affects+levels+of+a+chemically+dependent+destabilizing+domain.">Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain.</a> PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).</li><li>Iwamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+chemical+method+to+regulate+protein+stability+in+the+mammalian+central+nervous+system.">A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system.</a> Chemistry &amp; Biology. 17 (9), 981-988 (2010).</li><li>Tai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+domains+mediate+reversible+transgene+expression+in+the+brain.">Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain.</a> PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).</li><li>Auffenberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+and+reversible+inhibition+of+neurons+and+circuits+by+small+molecule+induced+potassium+channel+stabilization.">Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization.</a> Scientific Reports. 6, 19293 (2016).</li></ol>

A tecnologia CRISPR/Cas9 revolucionou a capacidade de interrogar funcionalmente genomas2. No entanto, a inativação de genes muitas vezes resulta em letalidade celular, déficits funcionais e defeitos de desenvolvimento, limitando a utilidade de tais abordagens para o estudo das funções genéticas7. Além disso, a expressão constitutiva do Cas9 pode resultar em toxicidade e na geração de efeitos fora do alvo6. Diferentes abordagens foram desenv...

CRISPR-Cas9 que significa "agrupada regularmente interespaçada proteína palindômica associada a repetições 9" foi descoberta pela primeira vez como parte de estudos sobre imunidade adaptativa bacteriana1,2. Hoje, o CRISPR/Cas9 tornou-se a ferramenta mais reconhecida para edição de genes programáveis e diferentes iterações do sistema foram desenvolvidas para permitir modulações transcricionais e epigenéticas3. Esta tecnologia permite a manipulação genética altamente precisa de quase qualquer sequência de DNA4.
Os componentes essenciais de qualquer edição de genes CRISPR são uma sequência de RNA guia personalizável e a nuclease Cas95. O guia RNA se liga à sequência alvo-complementar no DNA, direcionando a nuclease Cas9 para realizar uma quebra de dois fios em um ponto específico no genoma3,4. O local de decote resultante é então reparado por nhej (nhej) ou reparo direcionado por esmologia (HDR), com a consequente introdução de alterações na sequência de DNA direcionada5.
A edição de genes baseada em CRISPR/Cas9 é fácil de usar e relativamente barata em comparação com técnicas anteriores de edição de genes e tem sido comprovadamente eficiente e robusta em uma multiplicidade de sistemas2,4,5. No entanto, o sistema apresenta algumas limitações. A expressão constitutiva de Cas9 tem sido frequentemente demonstrada como resultado de um aumento do número de fora dos alvos e alta toxicidade celular4,6,7,8. Além disso, o direcionamento constitutivo de genes essenciais e de sobrevivência celular por Cas9 tira sua capacidade de realizar certos tipos de estudos funcionais, como estudos cinéticos de morte celular7.
Diferentes ferramentas CRISPR-Cas9 controladas condicionalmente ou controladas condicionalmente foram desenvolvidas para resolver essas questões6, como Tet-ON e Tet-Off9; recombinação específica do local10; proximidade quimicamente induzida11; emenda dependente da inteínia3; e 4-Receptor de Estrogênio baseado em Hidroxitamoxifen (ER) sistemas de localização nuclear12. Em geral, a maioria desses procedimentos (splicing de intein e sistemas de divisão de proximidade quimicamente induzidos) não oferecem controle reversível, apresentam uma resposta cinética muito lenta ao tratamento medicamentoso (sistema Tet-On/Off), ou não são favoráveis à manipulação de alta produtividade6.
Para lidar com essas limitações, desenvolvemos um novo kit de ferramentas que não só fornece edição de genes controlados temporais e rápidos, mas também garante rastreabilidade, sintonia e comodidade à manipulação de genes de alto throughput. Esta nova tecnologia pode ser usada em linhas celulares, organoides e modelos animais. Nosso sistema é baseado em um domínio projetado, quando fundido ao Cas9, induz sua rápida degradação. No entanto, pode ser rapidamente estabilizado com uma molécula pequena altamente seletiva, não tóxica e permeável celular. Mais especificamente, projetamos o mutante FKBP12 humano "domínio desestabilizador" (DD) para Cas9, marcando Cas9 para degradação rápida e constitutiva através do sistema ubiquitin-proteasome quando expresso em células mamíferas13. O ligante sintético DD, Shield-1 pode estabilizar a conformação DD, evitando assim a degradação de proteínas fundidas ao DD (como Cas9) de forma muito eficiente, e com uma resposta cinética rápida14,15. Note-se que o Shield-1 liga-se com três ordens de magnitude mais apertadas ao mutante FKBP12 do que à sua contraparte do tipo selvagem14.
O par DD-Cas9/Shield-1 pode ser usado para estudar a identificação sistemática e caracterização de genes essenciais em células cultivadas e modelos animais, como mostramos anteriormente mirando o gene CypD, que desempenha um papel importante no metabolismo das mitocôndrias; EGFR, um player-chave na transformação oncogênica; e Tp53, um gene central na resposta a danos de DNA. Além da edição de genes temporal e condicionalmente controlada, outra vantagem do método é que a estabilização do DD-Cas9 é independente de sua transcrição. Esse recurso permite a co-expressão, sob o mesmo promotor, de marcadores rastreáveis, bem como recombinases, como a recombinase dependente do receptor de estrogênio, CREER. Neste trabalho, mostramos como nosso método pode ser usado com sucesso in vitro, para atingir condicionalmente, por exemplo, o gene de replicação de DNA, RPA3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100mM DTT</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X FastDigest buffer</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>B64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 Ligation Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorimetric BCA kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, glutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>EF0654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest BsmBI</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>FD0454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag [M2] mouse mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR &#38; Gel Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibodies</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shield-1</td>
			<td>Cheminpharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 competent bacterial cells</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURVEYOR Mutation Detection Kit</td>
			<td>Transgenomic/IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin [DM1A] mouse mAb</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CP06-100UG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization

A tecnologia de retecção palindômica curta interespaçada (CRISPR-) (CRISPR-) se tornou uma ferramenta de laboratório predominante para introduzir modificações precisas e direcionadas no genoma. Sua enorme popularidade e rápida disseminação são atribuídas ao seu fácil uso e precisão em comparação com seus antecessores. No entanto, a ativação constitutiva do sistema tem aplicações limitadas. Neste artigo, descrevemos um novo método que permite o controle temporal da atividade CRISPR/Cas9 com base na estabilização condicional da proteína Cas9. Fundir um mutante projetado da proteína de ligação de rapamicina FKBP12 a Cas9 (DD-Cas9) permite a rápida degradação do Cas9 que, por sua vez, pode ser estabilizado pela presença de um ligante sintético FKBP12 (Shield-1). Ao contrário de outros métodos induíveis, este sistema pode ser adaptado facilmente para gerar sistemas bi-cistronic para co-expressar DD-Cas9 com outro gene de interesse, sem regulação condicional do segundo gene. Este método permite a geração de sistemas rastreáveis, bem como a manipulação paralela e independente de alelos visados pela nuclease Cas9. A plataforma deste método pode ser utilizada para a identificação sistemática e caracterização de genes essenciais e o interrogatório das interações funcionais de genes em ambientes in vitro e in vivo.

Para permitir a expressão condicional do Cas9, desenvolvemos uma construção vetorial lentiviral dupla composta por um promotor orientado pelo U6 para expressar constitutivamente o sgRNA, e um promotor central EF-1α para conduzir a expressão da proteína de fusão DD-Cas9(Figura 1A)19. Como paradigma para ilustrar a robustez e eficiência do sistema, transduzímos a linha celular carcinomatosa pulmonar A549 com a construção lenti...

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A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization

Aqui, descrevemos uma ferramenta de edição de genomas baseada na estabilização temporal e condicional da re repetição palindômica curta interespaçada regularmente interespaçada ( CRISPR-) (Cas9) sob a pequena molécula, Shield-1. O método pode ser usado para células cultivadas e modelos animais.

Um novo kit de ferramentas para avaliar funções genéticas usando estabilização condicional cas9

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associated protein 9 (CRISPR/Cas9) technology has become a prevalent laboratory ...

Este método fornece edição rápida e controlada por temperatura do gene CRISPR-Cas9 sob uma pequena molécula, Shield-1. Ele também oferece menos efeitos fora do alvo, menor toxicidade celular, e também maior edição de genes controlados internamente ao compará-lo com a ativação constitutiva do Cas9. A principal vantagem dessa partícula é que ela pode ser usada para caracterização de genes essenciais, bem como genes de sobrevivência tumoral.A desestabilização do DD-Cas9 é independente de sua expressão, e isso permite que o gene de interesse seja co-expresso sob o mesmo promotor. Este método pode ser facilmente aplicado a estudos in vivo e in vitro. O Escudo-1 também pode penetrar através da barreira hemencefálica, o que torna mais fácil também estudar genes que estão envolvidos no desenvolvimento cerebral.Células HEK293T saudáveis de sementes uniformemente a uma densidade de um a dois milhões de células por placa de cultura tecidual de 10 centímetros usando 10 mililitros de DMEM de glicose com FBS 10% filtrados. Incubar as células da incubadora de cultura tecidual a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius por 20 horas. No dia seguinte, confirme que as células atingiram 70% de confluência por microscopia de campo brilhante e que estão uniformemente dispersas pela placa.Mude a mídia uma hora antes da transfecção com um volume final de 10 mililitros. Prepare dois tubos com 500 microliters de mídia quente. Adicione 25 microliters de reagente de transfecção ao tubo um e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos.Ao outro tubo, adicione uma mistura de plasmídeos. Misture o tubo um com o tubo dois para formar uma mistura de transfecção e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos. Adicione a mistura de transfecção dropwise às células HEK293T e incubar a placa na incubadora de cultura tecidual.Após 18 horas, mude cuidadosamente a mídia para 10 mililitros de DMEM fresco com 10% de FBS para remover o reagente de transfecção. Incubar as células pelas próximas 48 horas. Após 48 horas, colete o supernascer com uma seringa de 10 mililitros e passe-a através de um filtro de 0,45 micrômetros.Aliquot o vírus supernante e armazene-o a menos 80 graus Celsius. Para determinar o titulação do vírus, sementes 5 milhões de células HEK293T por poço em duas placas de seis poços. Incubar ambas as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite para atingir 50 a 60% de confluência.No dia seguinte, use uma das placas de seis poços para contar as células nos seis poços. Descongele a alíquota do vírus que será usada para realizar a diluição serial e adicione oito microgramas por mililitro de reagente de polibreno, prepare o DMEM com 10% de FBS para diluição serial do vírus e adicione o reagente de polibreno. Prepare dois mililitros de diluições seriais dez vezes do lentivírus de 0,1 a 0,0001 em polibrene contendo mídia.Remova a mídia da placa de seis poços e adicione um mililitro de diluições virais aos poços, deixando um bem com a mídia sozinho como um controle negativo e um poço com 100% de vírus. Incubar as células por 24 horas. No dia seguinte, remova a mídia com o vírus das placas de seis poços e mude-a para dois mililitros de DMEM frescos com 10% de FBS.Incubar as células por 48 a 72 horas, observando gfp com um microscópio fluorescente todos os dias. Após 48 a 72 horas, desprende as células e resuspensá-las no tampão máximo. Use um citômetro de fluxo para determinar a porcentagem de expressão GFP e calcular o titulador do vírus usando a fórmula dada no manuscrito do texto.Plaque a linha celular de interesse em uma placa de 10 centímetros e incuba durante a noite para alcançar a confluência de 50 a 60% Em seguida, infecte as células com 500 a 2.000 microliters de partículas de vírus em um volume total de 10 mililitros de meio de cultura. Incubar a mídia viral por 24 horas. No dia seguinte, mude a mídia viral para a mídia cultural e determine a porcentagem de células positivas de GFP usando citometria de fluxo.Selecione células positivas GFP usando BD FACSAria II para classificação celular. Expanda células selecionadas positivamente e congele o estoque. Aplaque as células positivamente selecionadas e células não traduzidas em placas de 12 poços separadamente, 24 horas após a infecção.Aguarde até que as células se conectem e alterem a mídia para a mídia de cultura celular contendo 200 escudos nanomolar-1. Substitua a mídia nas placas por células transduzidas e não traduzidas, deixando dois poços por placa com mídia regular como um controle negativo. Incubar e extrair proteínas de cada poço a zero, dois, seis, 12, 24, 48 e 72 horas depois de adicionar Shield-1 aos poços.Em seguida, remova a mídia com shield-1 do resto dos poços e mude-a para mídia celular regular. Colete as proteínas desses poços em dois, seis e 12 horas depois de mudar a mídia. A indução da proteína Cas9 foi confirmada por seus níveis de expressão serem semelhantes entre as células transduzidas e o veículo, apesar da presença ou ausência de Shield-1.Há indução suficiente da expressão Cas9 na linha celular A549 transduzida duas horas após o tratamento com Shield-1, que se torna insignificante dentro de seis a 12 horas após a retirada do Shield-1. As células A549 tratadas do Escudo-1 diminuíram em número após 48 horas sem afetar a amostra de Rinella, que foi validada por imunoblotação usando um anticorpo contra a proteína RPA3 empobrecida. A inversão de edição de genes ou mutações indel foram confirmadas usando ensaios nuclease do agrimensor.A construção vetorial de lentivírus projetada foi um sistema bicistronic com outro gene de interesse sob o mesmo promotor EF-1a. Uma proteína fluorescente modificada, P2A, foi adicionada para rastrear células infectadas. A expressão da proteína mVenus foi observada no veículo e células transduzidas A549, independente da expressão DD-Cas9 e do tratamento Shield-1.A transdução eficiente da linha celular com vetor DD-Cas9 é uma das etapas limitantes da taxa, por ter células HEK293T saudáveis e usar seu número de passagem baixa é crucial. A otimização da razão entre plasmídeo DD-Cas9, plasmídeo de embalagem e plasmídeo envelope é muito importante para a transfecção ideal. Mas ao lado dele, também a quantidade de Shield-1 que é necessária para estabilizar células-alvo DD-Cas9 é algo que você precisa ter cuidado.O DD-Cas9 com o plasmídeo Cre também está disponível, e pode ser usado para estudar as interações genéticas em estudos in vivo baseados no sistema Cre-lox.

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Mapeamento QTL e edição CRISPR / Cas9 para identificar um gene de resistência a medicamentos em<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Genética

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjeção de proteína CRISPR/Cas9 em bagre do canal, Ictalurus punctatus, embriões para Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Um protocolo para a produção de Lentivirus vetores Integrase deficiente CRISPR/Cas9-mediada Gene nocaute em dividir células

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Produção eficiente e identificação de CRISPR/Cas9 gerado pelo Gene nocautes no sistema modelo Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Uma rápida e superficial Pipeline para gerar Genomic ponto mutantes em c. elegans usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene edição para fazer condicional mutantes de humano parasita da malária por p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...