Name: a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization
Uploaded: 2021-09-02T13:00:00
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Agradecemos a los miembros anteriores de nuestro laboratorio y al científico Serif Senturk por su trabajo anterior. Agradecemos a Danilo Segovia por leer críticamente este manuscrito. Este estudio fue posible y apoyado por Swim Across America y el programa Cancer Target Discovery and Development Center del Instituto Nacional del Cáncer.

1.El vector DD-Cas9
<ol><li>Obtener el vector DD-Cas9 de Addgene (DD-Cas9 con secuencia de relleno y Venus (EDCPV), Plásmido 90085). NOTA: Este es un plásmido lentiviral DD-Cas9 con un promotor U6 que impulsa la transcripción de ARN de guía única (sgRNA), mientras que el promotor EFS impulsa la transcripción DD-Cas9. La secuencia DYKDDDDK (flag-tag) está presente en el terminal C de Cas9 seguida de péptido autoescindido 2A (P2A) que separa DD-Cas9 y la proteína fluorescente modificada Venus (mVenus).</li>
<...

<ol>
	<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats+(CRISPRs):+the+hallmark+of+an+ingenious+antiviral+defense+mechanism+in+prokaryotes.">Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes.</a> Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CRISPR-Cas9+genome+engineering:+lessons+learned+from+RNA+interference.">Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference.</a> Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).</li><li>Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Inducible+CRISPR/Cas+Systems.">Drug Inducible CRISPR/Cas Systems.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).</li><li>Wade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Silencing+Using+the+CRISPR-Cas9+System:+A+Review+of+the+Benefits+and+Challenges.">High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).</li><li>Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-switchable+substrates+for+a+ubiquitin-proteasome+system.">Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+efficient+inducible+CRISPR/Cas9+platform+with+improved+specificity+for+multiple+gene+targeting.">An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting.</a> Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).</li><li>Oakes, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+engineering+hotspots+identifies+an+allosteric+CRISPR-Cas9+switch.">Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch.</a> Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+protein+tagging+in+cells+with+split+fluorescent+protein.">Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein.</a> Nature Communications. 7, 11046 (2016).</li><li>Roper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+and+organoid+transplantation+models+of+colorectal+cancer+and+metastasis.">In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis.</a> Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).</li><li>Chu, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+with+FKBP-derived+destabilizing+domains.">Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+control+of+protein+stability+and+function+in+living+mice.">Chemical control of protein stability and function in living mice.</a> Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+reversible,+and+tunable+method+to+regulate+protein+function+in+living+cells+using+synthetic+small+molecules.">A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules.</a> Cell. 126, 995-1004 (2006).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing.">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+CRISPR/Cas9-induced+mutant+screening.">A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening.</a> Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).</li><li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification.">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).</li><li>Senturk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+tunable+method+to+temporally+control+gene+editing+based+on+conditional+Cas9+stabilization.">Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization.</a> Nature Communications. 8, 14370 (2017).</li><li>McJunkin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+suppression+of+an+essential+gene+in+adult+mice+using+transgenic+RNA+interference.">Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).</li><li>Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-triggered+Cas9+protein+with+improved+genome-editing+specificity.">Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity.</a> Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).</li><li>Dow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).</li><li>Wright, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+split-Cas9+enzyme+complex.">Rational design of a split-Cas9 enzyme complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).</li><li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lentiviral+Packaging+Mixes+and+Producer+Cell+Lines+for+RNAi+Applications.">Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications.</a> Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).</li><li>Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Protein+Stabilization+In+Vivo+Mediated+by+Shield-1+in+Transgenic+Medaka.">Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka.</a> PLOS One. , (2015).</li><li>Sellmyer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+context+affects+levels+of+a+chemically+dependent+destabilizing+domain.">Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain.</a> PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).</li><li>Iwamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+chemical+method+to+regulate+protein+stability+in+the+mammalian+central+nervous+system.">A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system.</a> Chemistry &amp; Biology. 17 (9), 981-988 (2010).</li><li>Tai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+domains+mediate+reversible+transgene+expression+in+the+brain.">Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain.</a> PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).</li><li>Auffenberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+and+reversible+inhibition+of+neurons+and+circuits+by+small+molecule+induced+potassium+channel+stabilization.">Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization.</a> Scientific Reports. 6, 19293 (2016).</li></ol>

La tecnología CRISPR/Cas9 ha revolucionado la capacidad de interrogar funcionalmente genomas2. Sin embargo, la inactivación de genes a menudo resulta en letalidad celular, déficits funcionales y defectos de desarrollo, lo que limita la utilidad de tales enfoques para estudiar las funcionesde los genes 7. Además, la expresión constitutiva de Cas9 puede dar lugar a toxicidad y a la generación de efectos fuera del objetivo6. Se han desarrollado di...

CRISPR-Cas9 que significa " proteína asociada arepeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas asociadas" fue descubierta por primera vez como parte de estudios sobre la inmunidad adaptativa bacteriana1,2. Hoy en día, CRISPR/Cas9 se ha convertido en la herramienta más reconocida para la edición de genes programables y se han desarrollado diferentes iteraciones del sistema para permitir modulaciones transcripcionales y epigenéticas3. Esta tecnología permite la manipulación genética de alta precisión de casi cualquier secuencia de ADN4.
Los componentes esenciales de cualquier edición de genes CRISPR son una secuencia de ARN guía personalizable y la nucleasa Cas95. La guía de ARN se une a la secuencia diana-complementaria en el ADN, dirigiendo a la nucleasa Cas9 para realizar una rotura de doble hebra en un punto específico del genoma3,4. El sitio de escisión resultante se repara mediante unión final no homóloga (NHEJ) o reparación dirigida por homología (HDR), con la consiguiente introducción de cambios en la secuencia de ADN objetivo5.
La edición de genes basada en CRISPR / Cas9 es fácil de usar y relativamente económica en comparación con las técnicas de edición de genes anteriores y se ha demostrado que es eficiente y robusta en una multiplicidad de sistemas2,4,5. Sin embargo, el sistema presenta algunas limitaciones. A menudo se ha demostrado que la expresión constitutiva de Cas9 da lugar a un mayor número de objetivos no objetivos y una alta toxicidad celular4,6,7,8. Además, la focalización constitutiva de genes esenciales y de supervivencia celular por parte de Cas9 le quita capacidad para realizar ciertos tipos de estudios funcionales como los estudios cinéticos de muerte celular7.
Se han desarrollado diferentes herramientas CRISPR-Cas9 inducibles o controladas condicionalmente para abordar esos problemas6, como Tet-ON y Tet-Off9; recombinación específica del sitio10; proximidad inducida químicamente11; empalme dependiente de inteína3; y sistemas de localización nuclear basados en el receptor de estrógeno (ER) 4-hidroxitamoxifeno12. En general, la mayoría de estos procedimientos (empalme de inteína y sistemas de división de proximidad inducidos químicamente) no ofrecen un control reversible, presentan una respuesta cinética muy lenta al tratamiento farmacológico (sistema Tet-On/Off) o no son susceptibles de manipulación de alto rendimiento6.
Para abordar estas limitaciones, desarrollamos un nuevo conjunto de herramientas que no solo proporciona una edición de genes controlada temporalmente rápida y robusta, sino que también garantiza la trazabilidad, la capacidad de ajuste y la capacidad de manipulación de genes de alto rendimiento. Esta novedosa tecnología se puede utilizar en líneas celulares, organoides y modelos animales. Nuestro sistema se basa en un dominio de ingeniería, cuando se fusiona con Cas9, induce su rápida degradación. Sin embargo, se puede estabilizar rápidamente con una molécula pequeña altamente selectiva, no tóxica y permeable a las células. Más específicamente, diseñamos el mutante humano FKBP12 "dominio desestabilizador" (DD) a Cas9, marcando Cas9 para una degradación rápida y constitutiva a través del sistema ubiquitina-proteasoma cuando se expresa en células de mamíferos13. El ligando sintético DD, Shield-1 puede estabilizar la conformación DD, evitando así la degradación de proteínas fusionadas a DD (como Cas9) de una manera muy eficiente, y con una respuesta cinética rápida14,15. Cabe destacar que Shield-1 se une con tres órdenes de magnitud más al mutante FKBP12 que a su contraparte de tipo salvaje14.
El par DD-Cas9/Shield-1 se puede utilizar para estudiar la identificación sistemática y caracterización de genes esenciales en células cultivadas y modelos animales, como mostramos anteriormente al dirigirse condicionalmente al gen CypD, que desempeña un papel importante en el metabolismo de las mitocondrias; EGFR, un actor clave en la transformación oncogénica; y Tp53, un gen central en la respuesta al daño del ADN. Además de la edición de genes controlada temporal y condicionalmente, otra ventaja del método es que la estabilización de DD-Cas9 es independiente de su transcripción. Esta característica permite la coexpresión, bajo el mismo promotor, de marcadores trazables así como recombinasas, como la recombinasa dependiente del receptor de estrógenos, CREER. En este trabajo, mostramos cómo nuestro método puede ser utilizado con éxito in vitro, para apuntar condicionalmente, por ejemplo, al gen de replicación del ADN, RPA3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100mM DTT</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X FastDigest buffer</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>B64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 Ligation Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorimetric BCA kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, glutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>EF0654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest BsmBI</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>FD0454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag [M2] mouse mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR &#38; Gel Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibodies</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shield-1</td>
			<td>Cheminpharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 competent bacterial cells</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURVEYOR Mutation Detection Kit</td>
			<td>Transgenomic/IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin [DM1A] mouse mAb</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CP06-100UG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization

La tecnología de proteína 9 asociada a la repetición palindrómica corta (CRISPR/Cas9) agrupada regularmente interespaciada se ha convertido en una herramienta de laboratorio prevalente para introducir modificaciones precisas y específicas en el genoma. Su enorme popularidad y rápida difusión se atribuyen a su fácil uso y precisión en comparación con sus predecesores. Sin embargo, la activación constitutiva del sistema tiene aplicaciones limitadas. En este artículo, describimos un nuevo método que permite el control temporal de la actividad CRISPR/Cas9 basado en la estabilización condicional de la proteína Cas9. La fusión de un mutante diseñado de la proteína de unión a rapamicina FKBP12 a Cas9 (DD-Cas9) permite la rápida degradación de Cas9 que a su vez puede estabilizarse mediante la presencia de un ligando sintético FKBP12 (Shield-1). A diferencia de otros métodos inducibles, este sistema se puede adaptar fácilmente para generar sistemas bi-cistrónicos para co-expresar DD-Cas9 con otro gen de interés, sin regulación condicional del segundo gen. Este método permite la generación de sistemas trazables, así como la manipulación paralela e independiente de alelos dirigidos por la nucleasa Cas9. La plataforma de este método se puede utilizar para la identificación y caracterización sistemática de genes esenciales y el interrogatorio de las interacciones funcionales de genes en entornos in vitro e in vivo.

Para permitir la expresión condicional de Cas9, desarrollamos una construcción de vector lentiviral dual que consiste en un promotor impulsado por U6 para expresar constitutivamente sgRNA, y un promotor de núcleo EF-1α para impulsar la expresión de la proteína de fusión DD-Cas9 (Figura 1A)19. Como paradigma para ilustrar la robustez y eficiencia del sistema, transducimos la línea celular carcinomatosa de pulmón A549 con el con...

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A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization

Aquí, describimos una herramienta de edición del genoma basada en la estabilización temporal y condicional de la proteína 9 asociada a la repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada (CRISPR) (Cas9) bajo la pequeña molécula, Shield-1. El método se puede utilizar para células cultivadas y modelos animales.

Un nuevo kit de herramientas para evaluar las funciones genéticas utilizando la estabilización condicional cas9

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associated protein 9 (CRISPR/Cas9) technology has become a prevalent laboratory ...

Este método proporciona una edición rápida y controlada de genes CRISPR-Cas9 bajo una molécula pequeña, Shield-1. También ofrece menos efectos fuera del objetivo, menor toxicidad celular y también una mayor edición de genes controlada internamente cuando se compara con la activación constitutiva de Cas9. La principal ventaja de esta partícula es que se puede utilizar para la caracterización de genes esenciales, así como genes de supervivencia tumoral.La desestabilización de DD-Cas9 es independiente de su expresión, y esto permite que el gen de interés se coexprese bajo el mismo promotor. Este método se puede aplicar fácilmente a estudios in vivo e in vitro. Shield-1 también puede penetrar a través de la barrera hematoencefálica, lo que facilita también el estudio de genes que están involucrados en el desarrollo del cerebro.Sembrar uniformemente células HEK293T sanas a una densidad de uno a dos millones de células por placa de cultivo de tejido de 10 centímetros mediante el uso de 10 mililitros de glucosa DMEM con FBS filtrado al 10%. Incubar las células en la incubadora de cultivo de tejidos al 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados durante 20 horas. Al día siguiente, confirme que las células alcanzaron el 70% de confluencia por microscopía de campo brillante y que están dispersas uniformemente a través de la placa.Cambie el medio una hora antes de la transfección con un volumen final de 10 mililitros. Preparar dos tubos con 500 microlitros de medios calientes. Agregue 25 microlitros de reactivo de transfección al tubo uno e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos.Al otro tubo, agregue una mezcla de plásmidos. Mezcle el tubo uno con el tubo dos para formar una mezcla de transfección e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos. Agregue la mezcla de transfección gota a gota a las células HEK293T e incube la placa en la incubadora de cultivo de tejidos.Después de 18 horas, cambie cuidadosamente el medio a 10 mililitros de DMEM fresco con 10% FBS para eliminar el reactivo de transfección. Incubar las células durante las próximas 48 horas. Después de 48 horas, recoja el sobrenadante con una jeringa de 10 mililitros y páselo a través de un filtro de 0,45 micrómetros.Alícuota el sobrenadante del virus y guárdalo a menos 80 grados centígrados. Para determinar el título del virus, seque 5 millones de células HEK293T por pozo en dos placas de seis pozos. Incubar ambas placas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante la noche para alcanzar una confluencia del 50 al 60%.Al día siguiente, use una de las placas de seis pozos para contar las células en los seis pozos. Descongele la alícuota del virus que se utilizará para realizar la dilución en serie y agregue ocho microgramos por mililitro de reactivo de polibreno, prepare DMEM con 10% FBS para la dilución en serie del virus y agregue el reactivo de polibreno. Preparar dos mililitros de diluciones seriadas diez veces mayores del lentivirus de 0,1 a 0,0001 en medios que contengan polibreno.Retire los medios de la placa de seis pozos y agregue un mililitro de diluciones virales a los pozos, dejando un pozo con medios solos como control negativo y un pozo con 100% de virus. Incubar las células durante 24 horas. Al día siguiente, retire el medio con el virus de las placas de seis pozos y cámbielo a dos mililitros de DMEM fresco con 10% FBS.Incubar las células durante 48 a 72 horas, observando GFP con un microscopio fluorescente todos los días. Después de 48 a 72 horas, separe las células y vuelva a suuspend en un búfer máximo. Utilice un citómetro de flujo para determinar el porcentaje de expresión de GFP y calcular el título del virus utilizando la fórmula dada en el manuscrito de texto.Placa la línea celular de interés en una placa de 10 centímetros e incubar durante la noche para alcanzar una confluencia del 50 al 60%Luego infectar las células con 500 a 2, 000 microlitros de partículas de virus en un volumen total de 10 mililitros de medio de cultivo. Incubar los medios virales durante 24 horas. Al día siguiente, cambie los medios virales a medios de cultivo y determine el porcentaje de células GFP positivas mediante citometría de flujo.Seleccione las celdas positivas GFP utilizando BD FACSAria II para la clasificación de celdas. Expanda las celdas seleccionadas positivamente y congele el stock. Placa las células seleccionadas positivamente y las células no transducidas en placas de 12 pozos por separado, 24 horas después de la infección.Espere hasta que las células se adhieran y cambie el medio a un medio de cultivo celular que contenga 200 nanomolares Shield-1. Reemplace el medio en las placas con células transducidas y no transducidas, dejando dos pozos por placa con medios regulares como control negativo. Incubar y extraer proteínas de cada pozo a cero, dos, seis, 12, 24, 48 y 72 horas después de agregar Shield-1 a los pozos.Luego retire el medio con Shield-1 del resto de los pozos y cámbielo por medios celulares normales. Recolecte las proteínas de esos pozos a las dos, seis y 12 horas después de cambiar los medios. La inducción de la proteína Cas9 se confirmó por sus niveles de expresión similares entre las células transducidas y el vehículo, a pesar de la presencia o ausencia de Shield-1.Hay suficiente inducción de la expresión de Cas9 en la línea celular transducida A549 dos horas después del tratamiento con Shield-1, que se vuelve insignificante dentro de las seis a 12 horas posteriores a la retirada de Shield-1. Las células A549 transducidas tratadas con Shield-1 disminuyeron en número después de 48 horas sin afectar la muestra de Rinella, que fue validada por inmunoblotting utilizando un anticuerpo contra la proteína RPA3 agotada. La inversión de edición de genes o mutaciones indel se confirmaron mediante ensayos de nucleasa topógrafo.El constructo vectorial de lentivirus diseñado fue un sistema bicistrónico que llevaba otro gen de interés bajo el mismo promotor EF-1a. Se agregó una proteína fluorescente modificada, P2A, para rastrear las células infectadas. La expresión de la proteína mVenus se observó en el vehículo y en las células transducidas A549, independientemente de la expresión de DD-Cas9 y del tratamiento Shield-1.La transducción eficiente de la línea celular con el vector DD-Cas9 es uno de los pasos limitantes de velocidad, para tener células HEK293T sanas y usar su bajo número de pasaje es crucial. La optimización de la relación entre el plásmido DD-Cas9, el plásmido de empaque y el plásmido de envoltura es muy importante para una transfección óptima. Pero además de eso, también la cantidad de Shield-1 que se necesita para estabilizar las células objetivo DD-Cas9 es algo con lo que debe tener cuidado.El DD-Cas9 con el plásmido Cre también está disponible, y se puede utilizar para estudiar las interacciones genéticas en estudios in vivo basados en el sistema Cre-lox.

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping y CRISPR / Cas9 Edición para identificar un gen de resistencia a fármacos en<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Investigación

Genética

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Una metodología estándar para examinar in situ mutagenicidad en función de la mutación de punto reparación catalizada por CRISPR/Cas9 y SsODN en células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Un protocolo para la producción de vectores lentivirales integrasa deficientes para CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout en dividir las células

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Producción eficiente y genera identificación de CRISPR/Cas9 Gene Knockouts en el sistema modelo Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Uso de ovocitos de ratón para evaluar la función humana del Gene durante la Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Un rápido y fácil tubería para generar genómica punto mutantes de C. elegans utilizando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene edición para hacer condicionales mutantes de humano parásito de la Malaria por p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...