Name: a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization
Uploaded: 2021-09-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization at JoVE.com

Vi tackar tidigare medlemmar i vårt laboratorium och forskare Serif Senturk för tidigare arbete. Vi tackar Danilo Segovia för att han kritiskt har läst detta manuskript. Denna studie var möjlig och stöddes av Swim Across America och National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center program.

1.DD-Cas9 vektorn
<ol><li>Få DD-Cas9 vektor från Addgene (DD-Cas9 med fyllmedel sekvens och Venus (EDCPV), Plasmid 90085). OBS: Detta är en lentiviral DD-Cas9-plasmid med en U6-promotor som driver transkriptionen av en guide RNA (sgRNA) medan EFS-promotorn driver DD-Cas9-transkriptionen. DYKDDDDK-sekvensen (flagg-tagg) finns vid C-terminalen i Cas9 följt av 2A självklappande peptid (P2A) som separerar DD-Cas9 och modifierat fluorescerande protein Venus (mVenus).</li>
</ol>2. Liten guide RN...

<ol>
	<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats+(CRISPRs):+the+hallmark+of+an+ingenious+antiviral+defense+mechanism+in+prokaryotes.">Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes.</a> Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CRISPR-Cas9+genome+engineering:+lessons+learned+from+RNA+interference.">Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference.</a> Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).</li><li>Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Inducible+CRISPR/Cas+Systems.">Drug Inducible CRISPR/Cas Systems.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).</li><li>Wade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Silencing+Using+the+CRISPR-Cas9+System:+A+Review+of+the+Benefits+and+Challenges.">High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).</li><li>Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-switchable+substrates+for+a+ubiquitin-proteasome+system.">Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+efficient+inducible+CRISPR/Cas9+platform+with+improved+specificity+for+multiple+gene+targeting.">An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting.</a> Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).</li><li>Oakes, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+engineering+hotspots+identifies+an+allosteric+CRISPR-Cas9+switch.">Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch.</a> Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+protein+tagging+in+cells+with+split+fluorescent+protein.">Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein.</a> Nature Communications. 7, 11046 (2016).</li><li>Roper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+and+organoid+transplantation+models+of+colorectal+cancer+and+metastasis.">In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis.</a> Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).</li><li>Chu, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+with+FKBP-derived+destabilizing+domains.">Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+control+of+protein+stability+and+function+in+living+mice.">Chemical control of protein stability and function in living mice.</a> Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+reversible,+and+tunable+method+to+regulate+protein+function+in+living+cells+using+synthetic+small+molecules.">A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules.</a> Cell. 126, 995-1004 (2006).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing.">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+CRISPR/Cas9-induced+mutant+screening.">A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening.</a> Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).</li><li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification.">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).</li><li>Senturk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+tunable+method+to+temporally+control+gene+editing+based+on+conditional+Cas9+stabilization.">Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization.</a> Nature Communications. 8, 14370 (2017).</li><li>McJunkin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+suppression+of+an+essential+gene+in+adult+mice+using+transgenic+RNA+interference.">Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).</li><li>Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-triggered+Cas9+protein+with+improved+genome-editing+specificity.">Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity.</a> Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).</li><li>Dow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).</li><li>Wright, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+split-Cas9+enzyme+complex.">Rational design of a split-Cas9 enzyme complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).</li><li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lentiviral+Packaging+Mixes+and+Producer+Cell+Lines+for+RNAi+Applications.">Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications.</a> Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).</li><li>Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Protein+Stabilization+In+Vivo+Mediated+by+Shield-1+in+Transgenic+Medaka.">Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka.</a> PLOS One. , (2015).</li><li>Sellmyer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+context+affects+levels+of+a+chemically+dependent+destabilizing+domain.">Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain.</a> PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).</li><li>Iwamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+chemical+method+to+regulate+protein+stability+in+the+mammalian+central+nervous+system.">A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system.</a> Chemistry &amp; Biology. 17 (9), 981-988 (2010).</li><li>Tai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+domains+mediate+reversible+transgene+expression+in+the+brain.">Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain.</a> PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).</li><li>Auffenberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+and+reversible+inhibition+of+neurons+and+circuits+by+small+molecule+induced+potassium+channel+stabilization.">Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization.</a> Scientific Reports. 6, 19293 (2016).</li></ol>

CRISPR/Cas9-tekniken har revolutionerat förmågan att funktionellt förhöra genom2. Inaktivering av gener resulterar dock ofta i cellletalitet, funktionella underskott och utvecklingsdefekter, vilket begränsar nyttan av sådana metoder för att studera genfunktioner7. Dessutom kan konstituerande uttryck för Cas9 leda till toxicitet och generering av effekter utanför målet6. Olika metoder har utvecklats för att tidsbestyra CRISPR-Cas9-baserade ...

CRISPR-Cas9 som står för "klustrad regelbundet interspaced kort palindromisk upprepa-associerad protein 9" upptäcktes först som en del av studier på bakteriell adaptiv immunitet1,2. Idag har CRISPR/Cas9 blivit det mest erkända verktyget för programmerbar genredigering och olika iterationer av systemet har utvecklats för att möjliggöra transkriptionella och epigenetiskamodulering 3. Denna teknik möjliggör den mycket exakta genetiska manipuleringen av nästan alla sekvenser av DNA4.
De väsentliga komponenterna i någon CRISPR-genredigering är en anpassningsbar guide RNA-sekvens och Cas9-kärnan5. RNA-guiden binder till den mål-kompletterande sekvensen i DNA, som styr Cas9-kärnan för att utföra en dubbelsträngsbrytning vid en specifik punkt igenomet 3,4. Den resulterande klyvningsplatsen repareras sedan genom icke-homolog end-joining (NHEJ) eller homology-riktad reparation (HDR), med följden införande av förändringar i den riktade DNA-sekvensen5.
CRISPR/ Cas9-baserad genredigering är lätt att använda, och relativt billig jämfört med tidigare genredigeringstekniker och det har visat sig vara både effektivt och robust i en multiplicitet av system2,4,5. Ändå innebär systemet vissa begränsningar. Det konstituerande uttrycket för Cas9 har ofta visat sig resultera i ett ökat antal off-targets och högcelltoxicitet 4,6,7,8. Dessutom tar cas9:s konstituerande inriktning av essentiella och cellöverlevnadsgener bort från dess förmåga att utföra vissa typer av funktionella studier såsom kinetiska studier av celldöd7.
Olika inducerbara eller villkorligt kontrollerade CRISPR-Cas9-verktyg har utvecklats för att ta itu meddessa problem 6, såsom Tet-ON och Tet-Off9; Platsspecifik rekombination10. Kemiskt inducerad närhet11. inteinberoendeskarvning 3; och 4-Hydroxytamoxifen östrogenreceptor (ER) baserade nukleära lokaliseringssystem12. I allmänhet erbjuder de flesta av dessa förfaranden (intein spliting och kemiskt inducerade närhetsdelningssystem) inte reversibel kontroll, presenterar ett mycket långsamt kinetiskt svar på läkemedelsbehandling (Tet-On/Off-system), eller är inte mottagliga för hög genomströmningsmanipulation6.
För att hantera dessa begränsningar utvecklade vi en ny verktygslåda som inte bara ger snabb och robust tidsstyrd genredigering utan också säkerställer spårbarhet, tunabilitet och mottaglighet för genmanipulation med hög genomströmning. Denna nya teknik kan användas i cellinjer, organoider och djurmodeller. Vårt system är baserat på en konstruerad domän, när den smälts till Cas9 inducerar den sin snabba nedbrytning. Det kan dock snabbt stabiliseras med en mycket selektiv, giftfri, cellpermeabel liten molekyl. Mer specifikt konstruerade vi den mänskliga FKBP12 mutanta "destabiliserande domänen" (DD) till Cas9, vilket markerar Cas9 för snabb och konstituerande nedbrytning via ubiquitin-proteasomsystemet när det uttrycks i däggdjursceller13. DD syntetisk ligand, Shield-1 kan stabilisera DD-konformation, vilket förhindrar nedbrytning av proteiner som smälts till DD (såsom Cas9) på ett mycket effektivt sätt och med ett snabbt kinetisktsvar 14,15. Observera att Shield-1 binder med tre storleksordningar hårdare till mutanten FKBP12 än till dess vilda motsvarighet14.
DD-Cas9/Shield-1-paret kan användas för att studera systematisk identifiering och karakterisering av väsentliga gener i odlade celler och djurmodeller som vi tidigare visade genom att villkorligt rikta in sig på CypD-genen, som spelar en viktig roll i metabolismen av mitokondrier; EGFR, en nyckelspelare i onkogen omvandling; och Tp53, en central gen i DNA-skaderespons. Förutom temporalt och villkorligt kontrollerad genredigering är en annan fördel med metoden att stabiliseringen av DD-Cas9 är oberoende av dess transkription. Denna funktion möjliggör samuttryck, under samma promotor, av spårbara markörer samt rekombiner, såsom östrogenreceptorberoende rekombinas, CREER. I detta arbete visar vi hur vår metod framgångsrikt kan användas in vitro, för att villkorligt rikta in sig på till exempel DNA-replikeringsgenen RPA3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100mM DTT</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X FastDigest buffer</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>B64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 Ligation Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorimetric BCA kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, glutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>EF0654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest BsmBI</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>FD0454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag [M2] mouse mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR &#38; Gel Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibodies</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shield-1</td>
			<td>Cheminpharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 competent bacterial cells</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURVEYOR Mutation Detection Kit</td>
			<td>Transgenomic/IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin [DM1A] mouse mAb</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CP06-100UG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization

Den klustrade regelbundet interspaced korta palindromiska repeat- (CRISPR-) associerade protein 9 (CRISPR/Cas9) tekniken har blivit ett utbrett laboratorieverktyg för att införa exakta och riktade modifieringar i genomet. Dess enorma popularitet och snabba spridning tillskrivs dess enkla användning och noggrannhet jämfört med sina föregångare. Ändå har den konstituerande aktiveringen av systemet begränsade tillämpningar. I detta dokument beskriver vi en ny metod som möjliggör temporal kontroll av CRISPR / Cas9 aktivitet baserat på villkorlig stabilisering av Cas9 proteinet. Genom att fusing en konstruerad mutant av rapamycinbindande proteinet FKBP12 till Cas9 (DD-Cas9) möjliggör snabb nedbrytning av Cas9 som i sin tur kan stabiliseras genom närvaron av en FKBP12 syntetisk ligand (Shield-1). Till skillnad från andra inducerbara metoder kan detta system enkelt anpassas för att generera bi-cistronic-system för att samexpressa DD-Cas9 med en annan gen av intresse, utan villkorad reglering av den andra genen. Denna metod möjliggör generering av spårbara system samt parallell, oberoende manipulering av alleler riktade mot Cas9-kärnan. Plattformen för denna metod kan användas för systematisk identifiering och karakterisering av väsentliga gener och förhör av funktionella interaktioner av gener i in vitro- och in vivo-inställningar.

För att möjliggöra det villkorliga uttrycket av Cas9 utvecklade vi en dubbel lentiviral vektorkonstruktion bestående av en U6-driven promotor för att konstitutivt uttrycka sgRNA och en EF-1α kärnpromotor för att driva uttrycket av DD-Cas9 fusion protein (Figur 1A)19. Som ett paradigm för att illustrera systemets robusthet och effektivitet, transduced vi lunga carcinomatous A549 cellinje med den lentivirala konstruktionen. Niv?...

Watch this Scientific Journal Video about A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization at JoVE.com

A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization

Här beskriver vi ett genomredigeringsverktyg baserat på temporal och villkorlig stabilisering av klustrad regelbundet interspaced kort palindromisk upprepning- (CRISPR-) associerat protein 9 (Cas9) under den lilla molekylen, Shield-1. Metoden kan användas för odlade celler och djurmodeller.

En ny verktygslåda för utvärdering av genfunktioner med villkorlig Cas9-stabilisering

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associated protein 9 (CRISPR/Cas9) technology has become a prevalent laboratory ...

Denna metod ger snabb, temperaturstyrd CRISPR-Cas9 genredigering under en liten molekyl, Shield-1. Det erbjuder också mindre off-target effekter, lägre celltoxicitet, och även högre internt kontrollerad genredigering när man jämför den med konstituerande aktivering av Cas9. Den största fördelen med denna partikel är att den kan användas för karakterisering av väsentliga gener, liksom tumöröverlevnadsgener.Destabilisering av DD-Cas9 är oberoende av dess uttryck, och detta gör det möjligt att uttrycka intressegenen under samma promotor. Denna metod kan enkelt tillämpas på in vivo- och in vitro-studier. Shield-1 kan också tränga igenom blod- hjärnbarriären, vilket gör det enkelt att också studera gener som är involverade i hjärnans utveckling.Jämnt så friska HEK293T celler med en densitet av en till två miljoner celler per 10 centimeter vävnad kulturplatta med hjälp av 10 milliliter glukos DMEM med 10%filtrerade FBS. Inkubera cellerna i vävnadskulturens inkubator vid 5% koldioxid och 37 grader Celsius i 20 timmar. Nästa dag, bekräfta att cellerna nådde 70% confluency genom brightfield mikroskopi och att de är jämnt spridda över plattan.Byt medium en timme före transfektionen med en slutlig volym på 10 milliliter. Förbered två rör med 500 mikroliter varmt medium. Tillsätt 25 mikroliter transfection reagens i rör ett och inkubera vid rumstemperatur i fem minuter.Till det andra röret, tillsätt en blandning av plasmider. Blanda rör ett med rör två för att bilda en transfectionblandning och inkubera vid rumstemperatur i 20 minuter. Tillsätt transfektionsblandningen droppvis till HEK293T-cellerna och inkubera plattan i vävnadskulturens inkubator.Efter 18 timmar, byt försiktigt media till 10 milliliter färsk DMEM med 10% FBS för att ta bort transfection reagenset. Inkubera cellerna under de kommande 48 timmarna. Efter 48 timmar, samla supernatanten med en 10 milliliter spruta och passera den genom ett 0,45 mikrometer filter.Aliquot viruset supernatant och lagra det på minus 80 grader Celsius. För bestämning av virus titer, frö 5 miljoner HEK293T celler per brunn i två sex-brunnsplattor. Inkubera båda plattorna vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid över natten för att nå 50 till 60% sammanflöde.Nästa dag, använd en av sexbrunnsplattorna för att räkna cellerna i de sex brunnarna. Tina upp viruset alikvoten som kommer att användas för att utföra seriell utspädning och tillsätt åtta mikrogram per milliliter polybrenreagens, förbered DMEM med 10% FBS för seriell utspädning av viruset och tillsätt polybrenreagenset. Bered två milliliter tiofaldig seriella utspädningar av lentiviruset från 0,1 till 0,0001 i polybreninnehållande media.Ta bort media från sexbrunnsplattan och tillsätt en milliliter virusutspädningar till brunnarna, vilket lämnar en brunn med media ensam som en negativ kontroll och en väl med 100%virus. Inkubera cellerna i 24 timmar. Nästa dag, ta bort media med viruset från sex-brunnsplattorna och ändra det till två milliliter färsk DMEM med 10% FBS.Inkubera cellerna i 48 till 72 timmar och observera GFP med ett fluorescerande mikroskop varje dag. Efter 48 till 72 timmar lossar du cellerna och återanvänder dem i maxbuffert. Använd en flödescytometer för att bestämma procentandelen GFP-uttryck och beräkna virustittern med hjälp av formeln som anges i textmanuskriptet.Plätera celllinjen av intresse i en 10 centimeter tallrik och inkubera över natten för att nå en sammanflöde av 50 till 60%Sedan infektera cellerna med 500 till 2 000 mikroliter viruspartiklar i en 10 milliliter total volym av odlingsmedium. Inkubera virusmedierna i 24 timmar. Nästa dag, ändra virala medier till kulturmedier, och bestämma procentandelen GFP positiva celler med hjälp av flöde cytometri.Välj GFP-positiva celler med hjälp av BD FACSAria II för cellsortering. Expandera positivt markerade celler och frys lagret. Plätera de positivt valda cellerna och otransducerade cellerna i 12-brunnsplattor separat, 24 timmar efter infektion.Vänta tills cellerna fäster och ändrar mediet till cellkulturmedier som innehåller 200 nanomolar Shield-1. Ersätt mediet i plattorna med transduced och otransduced celler, lämnar två brunnar per tallrik med vanliga medier som en negativ kontroll. Inkubera och extrahera proteiner från varje brunn vid noll, två, sex, 12, 24, 48 och 72 timmar efter att ha lagt till Shield-1 till brunnarna.Ta sedan bort mediet med Shield-1 från resten av brunnarna och ändra det för vanliga cellmedia. Samla proteinerna från dessa brunnar vid två, sex och 12 timmar efter att ha bytt media. Induktion av Cas9 protein bekräftades av dess uttryck nivåer är liknande bland de transduced cellerna och fordonet, trots förekomsten eller frånvaron av Shield-1.Det finns tillräcklig induktion av Cas9 uttryck i den transduced A549 cellinjen två timmar efter behandling med Shield-1, som blir försumbar inom sex till 12 timmar efter tillbakadragande av Shield-1. Shield-1-behandlade transduced A549 celler minskade i antal efter 48 timmar utan att påverka Rinella provet, som validerades genom immunoblotting med hjälp av en antikropp mot det utarmade RPA3 proteinet. Genredigering inversion eller indel mutationer bekräftades med hjälp av surveyor nuclease analyser.Lentivirus vektor konstruktion utformad var ett bicistronic system som bär en annan gen av intresse under samma EF-1a promotor. Ett modifierat fluorescerande protein, P2A, lades till för att spåra infekterade celler. Uttrycket av mVenus protein observerades i fordonet och A549 transduced celler, oberoende av DD-Cas9 uttryck och Shield-1 behandling.Effektiv transduktion av cellinjen med DD-Cas9 vektor är ett av de hastighetsbegränsande stegen, för att ha friska HEK293T-celler och använda deras låga passagenummer är avgörande. Optimeringen av förhållandet mellan DD-Cas9 plasmid, förpackningsplasmid och kuvertplasmid är mycket viktig för optimal transfection. Men förutom det är också mängden Shield-1 som behövs för att stabilisera DD-Cas9 målceller något som du måste vara försiktig med.DD-Cas9 med Cre-plasmid finns också, och den kan användas för att studera de genetiska interaktionerna i in vivo-studier baserade på Cre-lox-systemet.

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL-kartläggning och CRISPR / Cas9 redigering för att identifiera en läkemedelsresistensgen i<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En standardmetod att undersöka Hotellets mutagenicitet som en funktion av punktmutation reparation katalyseras av CRISPR/Cas9 och SsODN i mänskliga celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Mikroskop av CRISPR/Cas9 Protein till kanal havskatt, Ictalurus punctatus, embryon för Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Ett protokoll för produktionen av integras-brist Lentiviral vektorer för CRISPR/Cas9-medierad gen Knockout i delande celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effektiv produktion och identifiering av CRISPR/Cas9-genererade gen Knockouts i det modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Högeffektiva gen störningar av murina och mänskliga hematopoetiska stamceller av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Använda mus oocyter att bedöma mänskliga geners funktion under meios jag

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

En snabb och lättköpt Pipeline för generera genomisk punkt mutanter i C. elegans med CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen redigering till göra villkorlig mutanter av humana malariaparasiten P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...