Name: a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization
Uploaded: 2021-09-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization at JoVE.com

Laboratuvarımızın önceki üyelerine ve bilim insanı Serif Şentürk'e önceki çalışmalarından dolayı teşekkür ediyoruz. Danilo Segovia'ya bu makaleyi eleştirel bir şekilde okuduğu için teşekkür ederiz. Bu çalışma Swim Across America ve National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center programı tarafından mümkün ve desteklendi.

1. DD-Cas9 vektör
<ol><li>Addgene'den DD-Cas9 vektörü (dolgu sırası ve Venüs (EDCPV), Plasmid 90085 ile DD-Cas9 vektörü edinin. NOT: Bu, EFS organizatörü DD-Cas9 transkripsiyonunu sürerken tek kılavuz RNA (sgRNA) transkripsiyonunu yönlendiren bir U6 promotörüne sahip bir lentiviral DD-Cas9 plazmididir. DYKDDDDK dizisi (bayrak etiketi), Cas9'un C terminalsinde ve ardından DD-Cas9 ve modifiye floresan protein Venüs'ü (mVenus) ayıran 2A kendinden yarıklı peptitte (P2A) bulunur.</li>
</ol><p class="...

<ol>
	<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats+(CRISPRs):+the+hallmark+of+an+ingenious+antiviral+defense+mechanism+in+prokaryotes.">Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes.</a> Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CRISPR-Cas9+genome+engineering:+lessons+learned+from+RNA+interference.">Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference.</a> Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).</li><li>Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Inducible+CRISPR/Cas+Systems.">Drug Inducible CRISPR/Cas Systems.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).</li><li>Wade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Silencing+Using+the+CRISPR-Cas9+System:+A+Review+of+the+Benefits+and+Challenges.">High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).</li><li>Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-switchable+substrates+for+a+ubiquitin-proteasome+system.">Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+efficient+inducible+CRISPR/Cas9+platform+with+improved+specificity+for+multiple+gene+targeting.">An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting.</a> Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).</li><li>Oakes, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+engineering+hotspots+identifies+an+allosteric+CRISPR-Cas9+switch.">Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch.</a> Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+protein+tagging+in+cells+with+split+fluorescent+protein.">Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein.</a> Nature Communications. 7, 11046 (2016).</li><li>Roper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+and+organoid+transplantation+models+of+colorectal+cancer+and+metastasis.">In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis.</a> Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).</li><li>Chu, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+with+FKBP-derived+destabilizing+domains.">Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+control+of+protein+stability+and+function+in+living+mice.">Chemical control of protein stability and function in living mice.</a> Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).</li><li>Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+reversible,+and+tunable+method+to+regulate+protein+function+in+living+cells+using+synthetic+small+molecules.">A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules.</a> Cell. 126, 995-1004 (2006).</li><li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing.">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888 (2018).</li><li>Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+CRISPR/Cas9-induced+mutant+screening.">A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening.</a> Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).</li><li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification.">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).</li><li>Senturk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+tunable+method+to+temporally+control+gene+editing+based+on+conditional+Cas9+stabilization.">Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization.</a> Nature Communications. 8, 14370 (2017).</li><li>McJunkin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+suppression+of+an+essential+gene+in+adult+mice+using+transgenic+RNA+interference.">Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).</li><li>Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-triggered+Cas9+protein+with+improved+genome-editing+specificity.">Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity.</a> Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).</li><li>Dow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).</li><li>Wright, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+split-Cas9+enzyme+complex.">Rational design of a split-Cas9 enzyme complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).</li><li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Lentiviral+Packaging+Mixes+and+Producer+Cell+Lines+for+RNAi+Applications.">Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications.</a> Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).</li><li>Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+Protein+Stabilization+In+Vivo+Mediated+by+Shield-1+in+Transgenic+Medaka.">Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka.</a> PLOS One. , (2015).</li><li>Sellmyer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+context+affects+levels+of+a+chemically+dependent+destabilizing+domain.">Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain.</a> PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).</li><li>Iwamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+chemical+method+to+regulate+protein+stability+in+the+mammalian+central+nervous+system.">A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system.</a> Chemistry &amp; Biology. 17 (9), 981-988 (2010).</li><li>Tai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilizing+domains+mediate+reversible+transgene+expression+in+the+brain.">Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain.</a> PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).</li><li>Auffenberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+and+reversible+inhibition+of+neurons+and+circuits+by+small+molecule+induced+potassium+channel+stabilization.">Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization.</a> Scientific Reports. 6, 19293 (2016).</li></ol>

CRISPR/Cas9 teknolojisi, genomları işlevsel olarak sorgulama yeteneğinde devrim yaptı2. Bununla birlikte, genlerin inaktivasyonu genellikle hücre öldürücülüğü, fonksiyonel eksiklikler ve gelişimsel kusurlarla sonuçlanır ve gen fonksiyonlarını incelemek için bu tür yaklaşımların yararını sınırlar7. Ayrıca, Cas9'un kesin ifadesi toksisiteye ve hedef dışı etkilerin üretilmesine neden olabilir6. CRISPR-Cas9 tabanlı genom d...

"Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlarla ilişkili protein 9" anlamına gelen CRISPR-Cas9 ilk olarak bakteri adaptif bağışıklık 1,2üzerine yapılan çalışmaların bir parçası olarak keşfedilmiştir. Bugün CRISPR/Cas9 programlanabilir gen düzenleme için en tanınmış araç haline gelmiştir ve transkripsiyonel ve epigenetik modülasyonlara izin vermek için sistemin farklı yinelemeleri geliştirilmiştir3. Bu teknoloji, DNA4'ünhemen hemen her dizisinin son derece hassas genetik manipülasyonu sağlar.
Herhangi bir CRISPR gen düzenlemesinin temel bileşenleri özelleştirilebilir bir kılavuz RNA dizisi ve Cas9 çekirdeği5'tir. RNA kılavuzu, DNA'daki hedef tamamlayıcı diziye bağlanır ve Cas9 çekirdeğini genom3,4'tebelirli bir noktada çift iplikçik kırılması gerçekleştirmeye yönlendirir. Elde edilen bölünme bölgesi daha sonra homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) veya homolojiye yönelik onarım (HDR) ile onarılır ve bunun sonucunda hedeflenen DNA dizisi5'tekideğişikliklerin tanıtılması .
CRISPR/Cas9 tabanlı gen düzenlemenin kullanımı kolaydır ve önceki gen düzenleme tekniklerine kıyasla nispeten ucuzdurve2,4,5sistemlerinin çokluğunda hem verimli hem de sağlam olduğu kanıtlanmıştır. Yine de, sistem bazı sınırlamalar sunar. Cas9'un constitutive ifadesinin genellikle hedef dışı sayısı ve yüksek hücre toksisitesi4, 6,7,8ile sonuç olduğu gösterilmiştir. Ek olarak, temel ve hücre sağkalım genlerinin Cas9 tarafından eşgüdümlü olarak hedeflleştirilmesi, hücre ölümünün kinetik çalışmaları gibi belirli türde fonksiyonel çalışmaları yapma yeteneğinden uzaklaştırır7.
Tet-ON ve Tet-Off9gibi6sorunlarını gidermek için farklı indükleyici veya koşullu kontrollü CRISPR-Cas9 araçları geliştirilmiştir; bölgeye özgü rekombinasyon10; kimyasal nedenli yakınlık11; intein bağımlı birleştirme3; ve 4-Hidroksikomoxifen Östrojen Reseptörü (ER) bazlı nükleer lokalizasyon sistemleri12. Genel olarak, bu prosedürlerin çoğu (intein birleştirme ve kimyasal olarak indüklenen yakınlık bölme sistemleri) geri dönüşümlü kontrol sunmaz, ilaç tedavisine (Tet-On/Off sistemi) çok yavaş bir kinetik yanıt sunmaz veya yüksek verimli manipülasyona uygun değildir6.
Bu sınırlamaları gidermek için sadece hızlı ve sağlam zamansal kontrollü gen düzenleme sağlamakla kalmayıp aynı zamanda yüksek verimli gen manipülasyonu için izlenebilirlik, ayarlanabilirlik ve amenability sağlayan yeni bir araç seti geliştirdik. Bu yeni teknoloji hücre hatlarında, organoidlerde ve hayvan modellerinde kullanılabilir. Sistemimiz, Cas9 ile kaynaştığında, hızlı bozulmasına neden olan tasarlanmış bir etki alanına dayanmaktadır. Bununla birlikte, son derece seçici, toksik olmayan, hücre geçirgen küçük bir molekülle hızla stabilize edilebilir. Daha spesifik olarak, insan FKBP12 mutantını Cas9'a "istikrarsızlaştırıcı etki alanı" (DD) olarak tasarladık, memeli hücrelerinde ifade edildiğinde Cas9'u her yerde bulunan-proteazom sistemi aracılığıyla hızlı ve konsutif bozulma için işaretledik13. DD sentetik ligand, Shield-1 DD konformasyonunu stabilize edebilir, böylece DD'ye (Cas9 gibi) kaynaşmış proteinlerin çok verimli bir şekilde bozulmasını önleyebilir ve hızlı bir kinetik yanıt14,15. Not olarak, Shield-1 mutant FKBP12'ye vahşi tip muadilinden daha sıkı üç büyüklük sırasına bağlanır14.
DD-Cas9/Shield-1 çifti, mitokondri metabolizmasında önemli bir rol oynayan CypD genini koşullu olarak hedef alarak daha önce gösterdiğimiz gibi, kültürlü hücrelerde ve hayvan modellerinde temel genlerin sistematik olarak tanımlanmasını ve karakterizasyonunu incelemek için kullanılabilir; EGFR, onkojenik dönüşümde önemli bir oyuncu; ve Tp53, DNA hasar tepkisinde merkezi bir gen. Zamansal ve şartlı kontrollü gen düzenlemeye ek olarak, yöntemin bir başka avantajı DD-Cas9'un stabilizasyonunun transkripsiyondan bağımsız olmasıdır. Bu özellik, aynı promotör altında, izlenebilir belirteçlerin yanı sıra östrojen reseptörüne bağımlı rekombinaz, CREERgibi rekombinazların birlikte ifadesini sağlar. Bu çalışmada, yöntemimizin tüp bebek olarak nasıl başarıyla kullanılabileceğini gösteriyoruz, örneğin DNA replikasyon geni RPA3'ü koşullu olarak hedeflemek için.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100mM DTT</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X FastDigest buffer</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>B64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X T4 Ligation Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colorimetric BCA kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, glutaMax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>EF0654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest BsmBI</td>
			<td>Thermosfisher</td>
			<td>FD0454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flag [M2] mouse mAb</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA extraction kit</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740952.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR &#38; Gel Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibodies</td>
			<td>LICOR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shield-1</td>
			<td>Cheminpharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stbl3 competent bacterial cells</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURVEYOR Mutation Detection Kit</td>
			<td>Transgenomic/IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin [DM1A] mouse mAb</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CP06-100UG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new toolkit for evaluating gene functions using conditional cas9 stabilization

Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrar- (CRISPR-) ilişkili protein 9 (CRISPR/Cas9) teknolojisi, genomda doğru ve hedefli modifikasyonlar yapmak için yaygın bir laboratuvar aracı haline gelmiştir. Muazzam popülaritesi ve hızlı yayılımı, öncekilere kıyasla kolay kullanımına ve doğruluğuna atfedilmektedir. Ancak, sistemin constitutive aktivasyonu sınırlı uygulamalara sahiptir. Bu yazıda, CAS9 proteininin koşullu stabilizasyonuna dayalı CRISPR/Cas9 aktivitesinin zamansal kontrolüne izin veren yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Rapamycin bağlayıcı protein FKBP12'nin mühendislikteki bir mutantını Cas9'a (DD-Cas9) eritmek, Cas9'un hızlı bir şekilde bozulmasını sağlar ve bu da bir FKBP12 sentetik ligandının (Shield-1) varlığıyla stabilize edilebilir. Diğer indüklenebilir yöntemlerin aksine, bu sistem, ikinci genin koşullu düzenlenmesi olmadan, DD-Cas9'u başka bir ilgi geni ile birlikte ifade etmek için bi-cistronic sistemler üretmek için kolayca uyarlanabilir. Bu yöntem, izlenebilir sistemlerin üretilmesinin yanı sıra Cas9 çekirdeği tarafından hedeflenen alellerin paralel, bağımsız manipülasyonunu sağlar. Bu yöntemin platformu, temel genlerin sistematik olarak tanımlanması ve karakterizasyonu ve in vitro ve in vivo ortamlarda genlerin fonksiyonel etkileşimlerinin sorgulanması için kullanılabilir.

Cas9'un koşullu ifadesini etkinleştirmek için, sgRNA'yı kurucu olarak ifade etmek için U6 tahrikli bir promotörden ve DD-Cas9 füzyon proteininin ekspresyonunu yönlendirmek için bir EF-1α çekirdek promotöründen oluşan çift lentiviral vektör yapısı geliştirdik (Şekil 1A)19. Sistemin sağlamlığını ve verimliliğini göstermek için bir paradigma olarak, akciğer karsinomatöz A549 hücre hattını lentiviral yapı ...

Watch this Scientific Journal Video about A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization at JoVE.com

A New Toolkit for Evaluating Gene Functions using Conditional Cas9 Stabilization

Burada, shield-1 adlı küçük molekül altında düzenli olarak kümelenmiş kısa palindromik tekrar- (CRISPR-) ilişkili protein 9'un (Cas9) zamansal ve koşullu stabilizasyonuna dayanan bir genom düzenleme aracı tarif ediyoruz. Yöntem kültürlü hücreler ve hayvan modelleri için kullanılabilir.

Koşullu Cas9 Stabilizasyonunu Kullanarak Gen fonksiyonlarını değerlendirmek için Yeni Bir Araç Seti

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) associated protein 9 (CRISPR/Cas9) technology has become a prevalent laboratory ...

Bu yöntem, Shield-1 adlı küçük bir molekül altında hızlı, sıcaklık kontrollü CRISPR-Cas9 gen düzenleme sağlar. Ayrıca Cas9'un konsitülatif aktivasyonu ile karşılaştırırken daha az hedef dışı etki, daha düşük hücre toksisitesi ve ayrıca daha yüksek dahili kontrollü gen düzenleme sunar. Bu parçacığın ana avantajı, tümör sağkalım genlerinin yanı sıra temel genlerin karakterizasyonu için kullanılabilmesidir.DD-Cas9'un istikrarsızlaştırılması ifadesinden bağımsızdır ve bu, ilgi geninin aynı organizatör altında birlikte ifade edilmesine izin verir. Bu yöntem in vivo ve in vitro çalışmalara kolayca uygulanabilir. Shield-1 ayrıca kan-beyin bariyerine de nüfuz edebilir, bu da beyin gelişiminde rol oynayan genleri incelemeyi kolaylaştırır.%10 filtreli FBS ile 10 mililitre glikoz DMEM kullanarak 10 santimetre doku kültürü plakası başına bir ila iki milyon hücre yoğunluğunda sağlıklı HEK293T hücrelerini eşit olarak tohumlar. Doku kültürü inkübatöründeki hücreleri 20 saat boyunca %5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, hücrelerin brightfield mikroskopisi ile% 70 izdiah ulaştığından ve plaka boyunca eşit olarak dağıldığını onaylayın.Transeksiyondan bir saat önce medyayı 10 mililitrelik son hacimle değiştirin. 500 mikrolitre sıcak ortam ile iki tüp hazırlayın. Tüp bire 25 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın.Diğer tüpe plazmid karışımı ekleyin. Bir transfeksiyon karışımı oluşturmak için tüp bir ile tüp iki karıştırın ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Transfeksiyon karışımını HEK293T hücrelerine damla yönünde ekleyin ve plakayı doku kültürü inkübatörüne inkübatöre ekleyin.18 saat sonra, transfeksiyon reaktifini çıkarmak için ortamı %10 FBS ile 10 mililitre taze DMEM'e dikkatlice değiştirin. Önümüzdeki 48 saat boyunca hücreleri kuluçkaya yatır. 48 saat sonra, süpernatant 10 mililitre şırınga ile toplayın ve 0.45 mikrometre filtreden geçirin.Aliquot virüs süpernatant ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Virüs titresini belirlemek için, iki altı kuyu plakasına kuyu başına 5 milyon HEK293T hücresi tohumlayın. Her iki plakayı da 37 santigrat derecede ve bir gecede% 5 karbondioksit ile kuluçkaya yatırarak% 50 ila% 60 izdiah eder.Ertesi gün, altı kuyudaki hücreleri saymak için altı kuyu plakalarından birini kullanın. Seri seyreltmeyi gerçekleştirmek ve mililitre polibren reaktifi başına sekiz mikrogram eklemek için kullanılacak virüs aliquotunu çözün, virüsün seri seyreltilmesi için% 10 FBS ile DMEM hazırlayın ve polibren reaktifini ekleyin. Polibren içeren ortamda lentivirüs 0.1 ila 0.0001 arasında iki mililitre on kat seri seyreltme hazırlayın.Medyayı altı kuyu plakasından çıkarın ve kuyulara bir mililitre viral seyreltme ekleyin, bir kuyuyu medya ile tek başına negatif kontrol ve bir kuyuyu% 100 virüs ile bırakın. Hücreleri 24 saat kuluçkaya yatır. Ertesi gün, virüsle birlikte medyayı altı kuyu plakalarından çıkarın ve% 10 FBS ile iki mililitre taze DMEM'e değiştirin.Hücreleri 48 ila 72 saat kuluçkaya yatırarak GFP'yi her gün floresan mikroskopla gözlemler. 48 ila 72 saat sonra, hücreleri ayırın ve maksimum arabellekte yeniden biriktirin. GFP ifadesinin yüzdesini belirlemek ve metin el yazmasında verilen formülü kullanarak virüs titresini hesaplamak için bir akış sitometresi kullanın.10 santimetrelik bir plakaya ilgi hücre hattını plakala ve %50 ila %60'lık bir izdiah süresine ulaşmak için gece boyunca kuluçkaya yatırın, ardından hücrelere 10 mililitrelik toplam kültür ortamında 500 ila 2.000 mikrolitre virüs parçacığı bulaştırın. Viral medyayı 24 saat kuluçkaya yatır. Ertesi gün, viral ortamı kültür ortamı olarak değiştirin ve akış sitometrisi kullanarak GFP pozitif hücrelerinin yüzdesini belirleyin.Hücre sıralama için BD FACSAria II kullanarak GFP pozitif hücrelerini seçin. Pozitif olarak seçilen hücreleri genişletin ve stoğu dondurun. Pozitif olarak seçilen hücreleri ve çevrilmemiş hücreleri enfeksiyondan 24 saat sonra, 12 kuyulu plakalarda ayrı ayrı plakalayın.Hücreler takılana kadar bekleyin ve ortamı 200 nanomolar Shield-1 içeren hücre kültürü ortamına değiştirin. Plakalardaki ortamı transdüklenmiş ve çevrilmemiş hücrelerle değiştirin ve plaka başına iki kuyuyu negatif kontrol olarak normal ortamla bırakın. Kuyulara Shield-1 ekledikten sonra her kuyudan sıfır, iki, altı, 12, 24, 48 ve 72 saat içinde proteinleri inkübte edin ve çıkarın.Ardından Shield-1 ile medyayı kuyuların geri kalanından çıkarın ve normal hücre ortamı için değiştirin. Medyayı değiştirdikten 2, 6 ve 12 saat sonra bu kuyulardan proteinleri toplayın. Cas9 proteininin indüksiyonu, Shield-1'in varlığına veya yokluğuna rağmen, transdüklenmiş hücreler ve araç arasında benzer ifade seviyeleri ile doğrulandı.Shield-1 ile tedaviden iki saat sonra transdüklenmiş A549 hücre hattında Cas9 ekspresyonunun yeterli indüksiyonu vardır, bu da Shield-1'in çekilmesinden sonraki altı ila 12 saat içinde ihmal edilebilir hale gelir. Shield-1 tedavi edilen transdüklenmiş A549 hücreleri, tükenen RPA3 proteinine karşı bir antikor kullanılarak immünblotting ile doğrulanan Rinella örneğini etkilemeden 48 saat sonra sayı olarak azaldı. Gen düzenleme inversiyonu veya indel mutasyonları eksper nükleaz tahlilleri kullanılarak doğrulandı.Tasarlanan lentivirüs vektör yapısı, aynı EF-1a promotörü altında başka bir ilgi geni taşıyan bir bicistronic sistemiydi. Enfekte hücrelerin izini sürmek için modifiye edilmiş bir floresan protein olan P2A eklendi. Araçta ve A549 transdüklenmiş hücrelerde DD-Cas9 ekspresykülü ve Shield-1 tedavisinden bağımsız olarak mVenus proteininin ekspresykülü gözlendi.DD-Cas9 vektörü ile hücre hattının verimli bir şekilde transdüksiyonu, sağlıklı HEK293T hücrelerine sahip olmak ve düşük geçiş sayılarını kullanmak için hız sınırlayıcı adımlardan biridir. DD-Cas9 plazmid, ambalaj plazmidi ve zarf plazmidi arasındaki oranın optimizasyonu optimal transfeksiyon için çok önemlidir. Ama bunun yanında, DD-Cas9 hedef hücrelerini stabilize etmek için gereken Shield-1 miktarı da dikkatli olmanız gereken bir şeydir.Cre plazmidli DD-Cas9 da mevcuttur ve Cre-lox sistemine dayanan in vivo çalışmalarda genetik etkileşimleri incelemek için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Haritalama ve CRISPR / Cas9 Düzenlemesi, bir İlaç Direnç Geninin Belirlenmesi için<emToksoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Genetik

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

CRISPR/Cas9 Protein gen düzenleme için mikroenjeksiyon kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, embriyo içine

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Integrase-eksik Lentiviral vektörler üretimi için CRISPR/Cas9-aracılı Gene hücre bölünmesi içinde nakavt için bir iletişim kuralı

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...